1 Lời cảm ơn Trong quá trình tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt ngiệp, tôi đã nhận được những lời chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của cô giáo: Tiến sĩ Trần Thị Phương Liên. Bên cạnh đó, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, Trung tâm chuyển giao công nghệ, các Phòng, Ban trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo các điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình làm việc. Cùng với đó là sự hỗ trợ nhất định từ gia đình, bạn bè và đồng nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó! Xuân Hòa, ngày 26 tháng 11 năm 2011 Học viên Nguyễn Mạnh Cường 2 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực. Công trình chưa được công bố trên bất cứ một tài liệu nào. Nếu sai, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm! Xuân Hòa, ngày 26 tháng 11 năm 2011 Học viên Nguyễn Mạnh Cường 3 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN ĐTD Đái tháo đường HDL –c High density lipoprotein cholesterol (Cholesterol tỉ trọng cao) VLDL –c Very low dentisy lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp liên kết cholesterol) LDL –c Low dentisy lipoprotein cholesterol (Lipoprotein liên kết cholesterol) STZ Streptozotocin TC Total cholesterol (Cholesterol toàn phần) TG Triglyxeride MỤC LỤC Trang 4 Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt dùng trong luận văn. MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài. 1 2. Mục đích nghiên cứu. 4 3. Nhiệm vụ nghiên cứu. 4 4. Đối tượng và phạm vi ngiên cứu nghiên cứu 4 5. Phương pháp nghiên cứu 4 6. Đóng góp mới của đề tài. 4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 5 1.1. Giới thiệu về một số hợp chất tự nhiên ở thực vật. 5 1.2. Bệnh béo phì (Obesity). 12 1.2.1. Thực trạng béo phì trên thế giới và Việt Nam. 13 1.2.2. Tác hại và nguy cơ của bệnh béo phì. 14 1.2.3. Nguyên nhân và giải pháp phòng, điều trị béo phì. 15 1.2.4. Rối loạn trao đổi lipid máu. 1.3. Bệnh đái tháo đường (Diabetes mellitus). 16 1.3.1. Khái niệm và phân loại. 16 1.3.2. Thực trạng đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam. 17 1.3.3. Tác hại và biến chứng… 18 1.3.4. Phòng và điều trị bệnh ĐTĐ. 18 1.3.5. Chuyển hóa glucose và sự điều hòa glucose huyết. 19 1.4. Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường. 20 1.5. Phương pháp gây đái tháo đường thực nghiệm bằng STZ . 21 1.6. Vài nét chung về cây bí đao. 23 1.6.1. Giới thiêu. 23 1.6.2. Nguồn gốc. 24 1.6.3. Phân loại, mô tả. 24 1.6.4. Thành phần hóa học. 24 1.6.5. Một số tác dụng sinh – Dược và công dụng của cây bí đao. 24 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Đối tượng nghiên cứu. 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 28 2.2.1. Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu. 28 2.2.2. Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của quả Bí đao. 28 2.2.2.1. Định tính. 28 2.2.2.2. Định lượng pholyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau. 30 5 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột béo phì thực nghiệm. 29 2.2.3.1. Thử độc tính cấp, xác định LD 50 . 29 2.2.3.2. Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm. 30 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) trên mô hình chuột đái tháo đường mô phỏng type2. 32 2.2.5. Một số kĩ thuật phân tích hóa sinh. 33 2.2.6. Xử lý số liệu. 35 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Qui trình tách chiết các phân đoạn từ quả Bí đao. 36 3.2. Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết quả Bí đao. 37 3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong quả Bí đao. 37 3.2.2. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết. 39 3.3. Kết quả xác định liều độc cấp. 41 3.4. Kết quả mô hình chuột béo phì thực nghiệm. 41 3.5. Tác dụng hạ glucose huyết của quả Bí đao trên mô hình chuột đái tháo đường type 2. 46 3.5.1. Kết quả tạo mô hình chuột đái tháo đường type 2 thực nghiệm. 46 3.5.2. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao đến nồng độ glucose huyết lúc đói của chuột ĐTĐ. 49 3.6. Tác dụng đến chuyển hóa lipid của quả Bí đao trên mô hình chuột ĐTĐ type 2. 52 KẾT LUẬN. 55 KIẾN NGHỊ. 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 57 MỞ ĐẦU 6 1. Lý do chọn đề tài. Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn trao đổi chất với biểu hiện chung nhất là chứng tăng đường huyết. Căn bệnh này đang trở thành mối nguy hại đối với toàn cầu bởi trung bình 10 giây có một người tử vong vì ĐTĐ. Hiện trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh đái tháo đường. Dự báo đến năm 2030, con số này sẽ tăng lên 366 triệu người. Mỗi năm, thế giới có khoảng 3,2 triệu người chết vì bệnh Đái tháo đường, tương đương số người chết hàng năm vì bệnh HIV/AIDS. Đáng chú ý là bệnh có xu hướng gia tăng mạnh tại các quốc gia đang phát triển ở châu Phi, châu Mỹ La Tinh và châu Á, đặc biệt ở độ tuổi lao động. Riêng châu Á, số liệu công bố tại hội nghị ĐTĐ quốc tế tổ chức vào tháng 12 năm 1997 tại Singapo công bố: năm 1995 có khoảng 62 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, cuối năm 2002 con số này là 89 triệu người. Theo đánh giá của Hiệp hội ĐTĐ quốc tế (IDF) năm 2005 số người mắc bệnh ĐTĐ tại châu Á tăng lên 1.7 lần. WHO đã cảnh báo có thể xuất hiện “đại dịch ĐTĐ” ở châu Á vào thế kỷ 21 [24], [2], [3]. Tính đến nay, Việt Nam có gần 5 triệu người mắc bệnh đái tháo đường. Với tỷ lệ tăng từ 8-20% mỗi năm, Việt Nam nằm trong nhóm nước có tỷ lệ bệnh đái tháo đường tăng nhanh nhất trên thế giới. Thống kê của Hội Người giáo dục bệnh ĐTĐ Việt Nam cho thấy, nếu như năm 2002, tỷ lệ người mắc ĐTĐ chiếm 2,7% dân số thì hiện con số này đã lên trên 7,2%, trong đó khu vực các đô thị, thành phố lớn tập trung nhiều người mắc nhất. Đối tượng mắc ĐTĐ thường ở độ tuổi từ 30 - 65, nhưng hiện đã có những bệnh nhân bị ĐTĐ mới chỉ 9 - 10 tuổi, điều này phản ánh sự trẻ hóa về bệnh này ở nước ta. ĐTĐ không chỉ có tính chất là một bệnh mạn tính, ĐTĐ còn kèm theo nhiều biến chứng nguy hiểm như các bệnh về thận dẫn đến suy thận, bệnh về mắt dẫn đến mù lòa, tổn thương hệ thần kinh và đặc biệt là các biến chứng về mạch máu (xơ vữa động mạch) có thể dẫn đến tử vong như bệnh mạch vành, nhồi máu não, xuất huyết não…[17], [45], [23], [7], [16]. 7 Ngày 21 tháng 12 năm 2006, Hội Đồng Liên Hiệp Quốc đã thông qua một nghị quyết thống nhất chung, tuyên bố ĐTĐ là một vấn đề sức khỏe cộng đồng quốc tế. Đây là lần đầu tiên một bệnh không truyền nhiễm lại được xem là một vấn đề sức khỏe cộng đồng quốc tế và ĐTĐ là bệnh thứ hai chỉ sau AIDS đạt đến tầm quan trọng như vậy. Trong những năm sắp đến, ĐTĐ là mối đe dọa sức khỏe cộng đồng đang tăng lên ở các nước phát triển và đang phát triển. Y học ngày nay đã có nhiều loại thuốc chữa bệnh ĐTĐ có hiệu quả như insulin, sulfonylurea, biguanid, Tuy nhiên, hầu hết các loại thuốc này đều có tác dụng phụ và chi phí điều trị đắt đỏ [10], [30], [2], [22]. Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ người mắc bệnh làm cho ĐTĐ trở thành một vấn đề lớn cho sức khỏe vì bệnh có tỷ lệ mắc, chết trầm trọng trong quá trình trị liệu lâu dài, đặc biệt là ĐTĐ type 2 một trong những bệnh phổ biến nhất trong bệnh ĐTĐ. ĐTĐ có thể mang nhiều biến chứng nguy hiểm như: biến chứng võng mạc, suy thận, biến chứng mạch máu lớn, tổn thương bàn chân dẫn đến cụt Vì vậy đại đa số người bệnh đều có nhu cầu chữa bệnh một cách an toàn. Mỗi năm nước Mỹ đã phải chi hàng tỉ đô la cho điều trị ĐTĐ bằng các thuốc do tổ chức an toàn thực phẩm và dược phẩm Mỹ phê chuẩn (Food and Drug Aministration - FDA) như: Metformin, Orlistat, Sibutramin, Ephedrin, Fenfluramin. Song hầu hết các thuốc này đều có nguồn gốc tổng hợp, thường có tác dụng phụ và đắt tiền. Trước tình hình đó ủy ban chuyên gia của (WHO) đã khuyến nghị nên sử dụng các thuốc có nguồn gốc thảo dược sẵn có, giá thành rẻ và ít độc tính [4], [2]. Trong lịch sử Y học từ 1550 năm trước công nguyên, con người đã biết dùng cây cỏ để chữa ĐTĐ. Nhiều loại thảo dược đó chứng tỏ có tác dụng rất tốt trong việc điều trị ĐTĐ như: mướp đắng, sinh địa, hoàng kỳ, huyền sâm, cỏ ngọt, chè xanh, khoai lang,…Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của các loài cây thuốc có giá trị của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lý, hiệu quả có tầm quan trọng đặc biệt. 8 Quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) là loài thực vật thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae). Bí đao gốc ở Ấn Độ, được trồng rộng rãi ở khắp các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới của châu á và miền Ðông của châu Ðại Dương. Ở nước ta, quả Bí đao cũng được trồng khắp nơi để lấy quả. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tác dụng chống oxy hoá của bí đao trên tế bào mô gan, não, thận. Đây là cơ sở của những tác dụng dược lý của bí đao đã được công bố, đó là: kháng viêm, kháng dị ứng, hạ đường huyết, phòng chống Alzheimer, béo phì, u xơ, ung thư Nhóm nghiên cứu của Chetan Nandecha và cộng sự đã khẳng định cao chiết hạt bí đao có hoạt tính ức chế 5α-reductase, giúp C. Nandecha phòng chống phì đại tiền liệt tuyến trên mô hình thực nghiệm. Nghiên cứu mới nhất của nhóm tác giả Ấn Độ (T. Jayasree, 2011) cho thấy cao chiết nước bí đao làm tăng thể tích nước tiểu, tăng bài tiết ion natri và clor, nhưng lại giảm bài tiết kali. Kết quả này càng khẳng định vai trò của bí đao với bệnh nhân phù thũng, cao huyết áp. Những kinh nghiệm cổ truyền và cả những công bố khoa học hiện đại cho thấy bí đao là món ăn bài thuốc hữu hiệu trong phòng chống các bệnh liên quan đến oxy hoá, trong đó có thừa cân béo phì và các bệnh tim mạch khác. Với những lí do trên, nhằm góp phần tìm kiếm và nghiên cứu thuốc điều trị đái tháo đường từ thành phần hóa học cơ bản của quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) trên chuột nhắt gây bệnh ĐTĐ bằng streptozotocin (STZ), chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu đặc tính hoá sinh dược của một số phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)”. Nghiên cứu được thực hiện với những mục tiêu sau: - Tìm hiểu thành phần hóa học cơ bản của quả Bí đao. - Tìm hiểu tác dụng hạ đường huyết của một số phân đoạn dịch chiết quả Bí đao trên mô hình chuột gây ĐTĐ thực nghiệm bằng STZ. 2. Mục đích nghiên cứu. Đánh giá hoạt tính sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.). 9 3. Nhiệm vụ nghiên cứu. 3.1. Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất tự nhiên có trong quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.). 3.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau. 3.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) trên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2. 4. Đối tượng nghiên cứu 4.1. Mẫu thực vật - Quả bí đao (Benincasa hispida Cogn.). - Địa điểm thu mẫu: Phúc Yên – Vĩnh Phúc. 4.2. Mẫu động vật và vi sinh vật - Chuột nhắt trắng là chủng Swiss 4 tuần tuổi (18- 20 g), do Viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp. 5. Phương pháp nghiên cứu 5.1. Phương pháp hoá lý và hoá học 5.2. Sử dụng các phương pháp hoá sinh 5.3. Tạo mô hình chuột BP, tạo mô hình chuột ĐTĐ typ II 5.5. Sử dụng phương pháp nghiên cứu hình thái giải phẫu 6. Đóng góp mới của đề tài. Đánh giá được khả năng hạ glucose huyết của một số phân đoạn dịch chiết lên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 thông qua chỉ số glucose huyết, các chỉ số lipit máu trên chuột sau 21 ngày điều trị. NỘI DUNG Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về một số hợp chất tự nhiên ở thực vật. 1.1.1. Flavonoid thực vật. 10 Trong số các polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan trọng vì chúng phổ biến ở hầu hết các loài thực vật và có nhiều hoạt tính sinh - dược học có giá trị [9]. 1.1.1.1. Cấu tạo hoá học và phân loại. Về cấu tạo hóa học, khung cacbon của flavonoid là C6 - C3 - C6, gồm 15 nguyên tử cacbon, hai vòng benzene A và B nối với nhau qua dị vòng C, trong đó A kết hợp với C tạo khung chroman. 9 10 8 5 7 6 2 3 O 1 4 1' 5'6' 4' 3' 2' A C B Flavan (2-phenyl chroman) Tùy theo mức độ oxy hoá của vòng pyran, sự có mặt hay không có mặt của nối đôi giữa C 2 và C 3 và nhóm cacbonyl ở C 4 mà có thể phân biệt flavonoid thành các nhóm phụ sau: flavon, flavonol, flavanon, chalcon và auron, antoxyanidin, leucoantoxyanidin, catechin, isoflavonoid, rotenoid, neoflavonoid. Flavonoid tồn tại ở hai dạng: dạng tự do gọi là aglycon và dạng liên kết với đường gọi là glycoside. Các glycoside khi bị thuỷ phân bằng acid hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đường và aglycon tương ứng. Có 2 dạng glycoside là O-glycoside và C-glycoside. Đối với O-glycoside phân tử đường liên kết với flavonoid thông qua nhóm hydroxyl như rutin; đối với C-glycoside, flavonoid liên kết với đường thông qua nguyên tử cacbon như saponin. O OH OH O - Rhamnose - glucose OH O OH Glucose Rutin Saponin 1.1.1.2. Hoạt tính sinh học của flavonoid. [...]... làm với mẫu chuẩn acid gallic 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột béo phì thực nghiệm 36 2.2.3.1 Thử độc tính cấp, xác định LD50 Xác định LD50 của dịch chiết quả Bí đao bằng đường uống theo phương pháp Lorke [51] Chuột nhịn đói trước 16h thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N = 10 và cho uống... cao tổng số ethanol được hòa tan trong nước nóng và chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, chloroform, ethylacetate cất dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn dịch chiết tương ứng 2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của quả bí đao (Benincasa hispida Cogn.) 2.2.2.1 Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại... chất nhầy Lá bí đao dùng để chữa tiểu đường, sốt rét, tả lị, thũng độc Lá Bí đao giã nát trộn với giấm rịt đắp chữa các đầu ngón tay sưng đau (chín mé) Dây bí đao (thân) vị đắng, tính lạnh, có tác dụng hoạt lạc thông kinh, hòa khí huyết, trừ phong thấp [43], [47] [69] 31 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Mẫu thực vật + Cây Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)... GM612, Đức - Máy quang phổ UV – VIS 1000 - Một số máy móc cần thiết khác như: voltex, máy ly tâm, máy khuấy từ, bếp điện 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu Từ 3000g quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) sấy khô được ngâm chiết với ethanol 90% ở nhiệt độ phòng 22oC trong vòng 45 ngày (quá trình được lặp lại 3 lần) Gộp các dịch chiết lại, lọc qua giấy lọc 3 lần và cất lại... là loại rau xanh thường dùng trong các bữa ăn của nhân dân ta, cũng như dưa chuột Có thể dùng quả Bí đao ăn luộc hoặc nấu canh tôm, canh cua, làm nộm, xào thịt gà, thịt lợn Bí đao còn dùng làm mứt; mứt bí thường dùng trong dịp 30 Tết Nguyên đán Ăn Bí đao thông tiểu, tiêu phù, giải khát, mát tim, trừ phiền nhiệt, bớt mụn nhọt Thịt quả bí đao có vị ngọt, tính hơi lạnh, vào các kinh tỳ, v.i, đại tràng... hispida Cogn.) 1.6.1 Giới thiệu Bí đao hay bí phấn hoặc bí trắng, danh pháp khoa học: Benincasa hispida Cogn.; là loài thực vật thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) dạng dây leo, trái ăn được, thường dùng nấu lên như một loại rau Bí đao là cây ưa ấm thuộc họ bầu bí Nhiệt độ thích hợp từ 24 – 280C Măc dù vậy hạt có thể nảy mầm ở nhiệt độ 10 – 150C nhưng tốt nhất là 250C ở giai đoạn cây con (vườn ươm), yêu cầu... hoại tử tế bào Hoạt tính alkyl hóa của STZ do hoạt động của nhóm nitrosourea của nó, đặc biệt là ở vị trí O6 của guanine STZ tạo ra nitric oxide (NO) làm tổn thương ADN của tế bào β Mặt khác, hoạt động của NO làm ức chế chu trình Krebs, giảm tiêu thụ oxy trong ty thể từ đó làm giảm mạnh sự sản xuất ATP và tổn hại đến các nucleotit của tế bào Đồng thời phân tử này còn ức chế hoạt tính enzyme aconitase... xuất không protein 30,5, khoáng toàn phần 0,1 Trong các loại kháng có calcium 26mg, phosphor 23mg, sắt 0,3mg Còn có các vitamin caroten 0,01mg, vitamin B1 0,01mg, vitamin B2 0,02mg, vitamin PP 0,03mg và vitamin C 16mg Nhiệt lượng do 100g bí cung cấp cho cơ thể là 12calo Hạt chứa ureaza [43], [44], [47] 1.6.5 Một số tác dụng Sinh - Dược và công dụng của cây Bí đao [69], [70] Bí đao là loại rau xanh thường... Flavonoid có tác dụng chống ung thư do kìm hãm các enzyme oxy hoá khử, quá trình đường phân và hô hấp, kìm hãm phân bào, phá vỡ cân bằng trong các quá trình trao đổi chất của tế bào ung thư [6] - Tác dụng giảm béo phì và lipid máu Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật cho thấy khi chuột béo phì được điều trị bằng dịch chiết giàu flavonoid từ lá Bằng lăng (Lagerstroemia specciosa L.) thì có trọng... hiệu quả 90% chuột xuất hiện ĐTĐ với nồng độ glucose máu ≥10 mmol/l [19] Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy acid béo tự do có vai trò trong bệnh sinh ĐTĐ type 2 Phần lớn người béo phì có nồng độ acid béo trong huyết tương tăng cao Sự tăng này ức chế quá trình hấp thu glucose ngoại vi dưới tác dụng của insulin, ức chế sử dụng glucose của toàn cơ thể, ức chế oxy hóa glucose ở cơ Nhiều nghiên cứu trên . của một số phân đoạn dịch chiết quả Bí đao trên mô hình chuột gây ĐTĐ thực nghiệm bằng STZ. 2. Mục đích nghiên cứu. Đánh giá hoạt tính sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết từ quả Bí. trong các phân đoạn dịch chiết quả Bí đao. 37 3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong quả Bí đao. 37 3.2.2. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết. 39 3.3. Kết quả xác. Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) trên chuột nhắt gây bệnh ĐTĐ bằng streptozotocin (STZ), chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu Nghiên cứu đặc tính hoá sinh dược của một số phân đoạn dịch