Đang tải... (xem toàn văn)
Tuyển chọn chủng có khả năng chịu axit và muối mặn cao từ các chủng vi khuẩn lactic trong một số sản phẩm lên men lactic trên địa bàn thành phố Huế
DANH SÁCH BẢNG Hình Tên hình Trang Bảng 1.1 Các giống khác vi khuẩn lactic Bảng 1.2 Đặc điểm phân biệt số loài chi Lactobacillus Bảng 1.3 Các đặc điểm phân biệt số loài Pediococcus 10 Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn dùng thí nghiệm 23 Bảng 3.2 Thành phần mơi trường MRS rắn/Lít 27 DANH SÁCH HÌNH Hình Trang Tên hình Hình 1.1 Hình thái tế bào Lb axitophilus Lb plantarum Hình 1.2 Hình thái tế bào Leuconostoc mesenteroides .8 Hình 1.3 Hình thái tế bào Pediococcus halophilus Aerococcus urinaeequi Hình 1.4 Hình thái tế bào Bifidobacterium .11 Hình 3.1 Hình thái tế bào nhuộm gram chủng vi khuẩn lactic sử dụng thí nghiệm 24 Hình 4.1 Thời gian tăng OD 0,3 chủng vi khuẩn lactic mơi trường MRS có 0,3% muối mật .33 Hình 4.2 Khả sống sót chủng vi khuẩn lactic pH 36 Hình 4.3 Hình ảnh minh họa khả chịu axit chủng DC1 đĩa peptri .38 Hình 4.4 Hình ảnh minh họa khả chịu axit chủng DC2 đĩa peptri .39 Hình 4.5 Hình ảnh minh họa khả chịu axit chủng MC5 đĩa peptri .40 Hình 4.6 Hình ảnh minh họa khả chịu axit chủng MC9 đĩa peptri .41 Hình 4.7 Hình ảnh minh họa khả chịu axit chủng MC10 đĩa peptri 42 Hình 4.8 Đường cong tăng trưởng chủng MC9 .43 Hình 4.9 Trình tự đoạn gen rDNA 16S chủng MC9 Lactobacillus fermentum SFCB2-3 45 Hình 4.10 Cây phân loại dựa trình tự rRNA 16S 46 CÁC TỪ VIẾT TẮT Lb Lactobacillus Lc Lactococcus MRS Man, Rogosa, Sharpe CFU Colony Forming Unit WHO World Health Organization FAO Food and Agriculture Organization OD Optical Density MỤC LỤC PHẦN : MỞ ĐẦU PHẦN : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan vi khuẩn lactic 2.1.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn 2.1.2 Các nhóm vi khuẩn lactic 2.1.3 Ứng dụng vi khuẩn lactic .12 2.2 Hệ vi sinh vật đường tiêu hóa người 12 2.2.1 Đặc điểm chung hệ vi sinh vật đường tiêu hóa người 12 2.2.2 Chức nhóm vi sinh vật chủ yếu đường tiêu hóa người 13 2.3 Tổng quan probiotics 14 2.3.1 Khái niệm probiotics .14 2.3.2 Những tính chất có lợi probiotics 16 2.3.3 Các tiêu chuẩn sàng lọc chủng vi khuẩn làm probiotics 19 2.4 Khả tồn sinh trưởng vi khuẩn lactic đường tiêu hóa người 20 2.5 Tình hình nghiên cứu khả chịu axit muối mật vi khuẩn lactic giới 21 2.6 Tình hình nghiên cứu khả chịu axit muối mật vi khuẩn lactic Việt Nam .21 PHẦN : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Đối tượng nghiên cứu 23 3.2 Thiết bị, hóa chất sử dụng 26 3.2.1 Thiết bị 26 3.2.2 Hóa chất 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 26 3.31 Phương pháp hoạt hóa giống .26 3.3.2 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh 27 3.3.3 Phương pháp bảo quản giống .27 3.3.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào môi trường lỏng .28 3.3.5 Phương pháp khảo sát khả chịu muối mật 29 3.3.6 Phương pháp khảo sát khả chịu axit 30 3.3.7 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng 30 3.3.8 Phương pháp xử lí số liệu .31 PHẦN : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32 4.1 Kết khảo sát khả chịu muối mật 32 4.2 Kết khảo sát khả chịu axit .34 4.3 Xác định khả sinh trưởng tích lũy sinh khối MC9 .43 4.4 Kết định danh 44 PHẦN : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHẦN MỞ ĐẦU Xã hội phát triển việc nâng cao sức khỏe, phịng chống bệnh tật lại trọng Lo sợ trước tác động có hại việc điều trị bệnh kháng sinh, người ngày ưa thích phương pháp giữ gìn sức khỏe, phịng tránh điều trị bệnh tật có nguồn gốc tự nhiên, tạo cân bằng, ổn định thể Một số phương pháp phổ biến rộng rãi sử dụng chế phẩm probiotic Probiotic chế phẩm gồm vi sinh vật sống, chủ yếu vi khuẩn lactic Đây vi khuẩn sống tự nhiên đường tiêu hóa người lồi động vật khác Chúng có nhiều tác động có lợi cho sức khỏe giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế vi khuẩn gây bệnh đường ruột, hỗ trợ tiêu hóa, giảm nồng độ cholesterol máu giảm nguy bị ung thư Để thường xuyên trì tác động này, bổ sung thêm từ nguồn thực phẩm lên men có chứa chúng sữa chua, tơm chua, nem chua từ chế phẩm chuyên dụng Hiệu chúng tăng cường chủng vi khuẩn lactic qua nghiên cứu sàng lọc để đảm bảo chúng có tiềm probiotic mạnh Một tính chất định tiềm probiotic chủng vi khuẩn khả tồn tại, thích nghi với mơi trường đường tiêu hóa động vật Chúng phải chịu mơi trường axit dày thích nghi với nồng độ muối mật ruột tác động enzyme đường tiêu hóa Những năm gần đây, loại thực phẩm có vi sinh vật probiotic ưa chuộng Việt Nam Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu phân lập khảo sát tiềm probiotic hệ vi sinh vật lên men lactic nước ta Do đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Tuyển chọn chủng có khả chịu axit muối mật cao từ chủng vi khuẩn lactic số sản phẩm lên men lactic địa bàn thành phố Huế”, nhằm xác định số chủng có khả tồn thích nghi đường tiêu hóa động vật, làm tiền đề cho nghiên cứu tuyển chọn dòng vi khuẩn lactic có tiềm probiotic để ứng dụng vào sản xuất PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan vi khuẩn lactic 2.1.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn lactic Vi khuẩn những vi sinh vật đơn bào, có cấu tạo đơn giản Chúng hơ hấp hiếu khí yếm khí, cấu tạo tế bào chúng khơng có diệp lục tố [5] Ngồi đặc điểm chung nhóm vi khuẩn khác ln có đặc điểm riêng đặc trưng cho nhóm Vi khuẩn lactic chúng có đặc điểm sinh lí sinh hóa khác so với nhóm vi khuẩn khác lồi khác thấy rõ Mặc dù nhóm vi khuẩn khơng đồng mặt hình thái nhìn chung tất vi khuẩn lactic có đặc điểm sau 2.1.1.1 Đặc điểm sinh lí - Đó vi khuẩn gram dương, nói chung bất động, không sinh bào tử - Chúng vi khuẩn kị khí tùy nghi, vi hiếu khí, loại thể độc có khả lên men hiếu khí kị khí, chúng có khả sinh trưởng có mặt oxi - Chúng khơng chứa cytochrom, catalase nitratoredutase âm tính 2.1.1.2 Đặc điểm sinh hóa - Dinh dưỡng nhóm vi khuẩn lactic phức tạp khả tổng hợp chất cần cho sống chúng yếu Không đại diện thuộc nhóm phát triển mơi trường muối khống khiết chứa glucose NH4+ Đa số chúng cần hàng loạt vitamin (lactoflavin, tiamin, axit pantotenic, axit nicotinic, axit folic, biotin), axit amin, bazơ purin pirimidin [5] - Chúng có khả lên men tạo axit lactic cách phân giải nguồn hydrat cacbon có mơi trường 2.1.2 Các nhóm vi khuẩn lactic Năm 1857 Pasteur chứng minh việc làm sữa chua kết hoạt động nhóm vi sinh vật đặc biệt vi khuẩn lactic Năm 1878 Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đặt tên Bacterium lactics.Về sau nhà khoa học liên tiếp phân lập nhiều loài vi khuẩn lactic khác [1] Và loài vi khuẩn xếp chung vào họ Lactobacteriaceae Bảng 1.1 Các giống khác vi khuẩn lactic [2] Tế bào Kiểu lên % Tài liệu dẫn Giống men G+C Hình Sắp xếp Streptococcus Cầu Chuỗi Đồng hình 34- Schleifer 1986 Leuconostoc Cầu Chuỗi Dị hình 46 Farrow cộng 36- 1989 Pedicoccus Cầu Tứ 43 Schleifer 1986 Lactobacillus Que cầu Đồng hình Kandler Chuỗi welss, 1986 Bifidobacterium Khác Đồng hình 34 Nhiều dị hình -42 Scardovi, 1986 tùy dạng Lactic 32 lồi acetic -53 55 -67 Nhóm vi khuẩn lactic đa dạng bao gồm nhiều chi khác Việc phân loại chi dựa khác hình thái vi khuẩn (Tế bào chúng hình que hình cầu) khả sinh trưởng phát triển điều kiện pH khác (4,4; 9,6); nhiệt độ khác (100 C; 45 0C) khả lên men đồng hình hay dị hình chúng Người ta tiến hành phân loại chia nhóm vi khuẩn lactic thành chi chủ yếu sau (Thể bảng 1.1) Sự tập hợp chi vào nhóm vi khuẩn lactic khẳng định qua phương pháp phân loại phân tử [2] Ngồi có số lồi vi khuẩn sinh nội bào tử có khả lên men tạo axit lactic thuộc chi Bacillus, Tuy nhiên, loài không xem vi khuẩn lactic đặc điểm sinh lý hóa sinh chúng 2.1.2.1 Lactobacillus Giống Lactobacillus chi lớn nhóm vi khuẩn lactic, gồm khoảng 80 loài [27] Với mức độ khác nhiều hình thái, đặc điểm sinh hóa sinh lý Sự không đồng thể phổ tỉ lệ mol G+C rộng, từ 32-55% [27] Chúng trực khuẩn không sinh bào tử thuộc lớp vi khuẩn Gram dương, catalase âm tính, sinh trưởng điều kiện kỵ khí khơng bắt buộc vi hiếu khí Những trực khuẩn thường đứng riêng lẻ thành chuỗi, thủy phân đường saccharosa mạnh tạo axit lactic, không khử nitrat, chúng phân giải gelatin, indole H 2S Chúng phát triển mạnh mơi trường có tính axit, tùy lồi mà pH dao động từ 4,5 đến 6,4 Đây vi khuẩn khuyết dưỡng nhiều loại vitamin, axitamin Người ta tìm thấy Lactobacillus sản phẩm sữa, thịt, nước sạch, bùn, bề mặt thực vật, trái Các loài thuộc chi phần quan trọng hệ thống vi sinh đường ruột người động vật bậc cao, có khoang miệng, đường ruột âm đạo INCLUDEPICTURE "http://bp0.blogger.com/_FlhB437Wa_U/SClyFlwHv7I/AAAAAAAAArc/TeX5R_U81vA/s400/a Nhiều kết nghiên cứu phân loại sinh hóa lai DNA cho thấy Lactobacillus nhóm đặc biệt a b 10 Hình 1.1 Hình thái tế bào (a) Lb axitophilus (b) PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, rút kết luận sau - 12 chủng vi khuẩn lactic DC1, DC2, MC5, MC9, MC10, N1, N5, N10, T9, T110,NC10, NC13 có khả phát triển mơi trường MRS có bổ sung muối mật giờ, cao DC1 thấp NC10 - chủng chịu muối mật cao DC1, DC2, MC5, MC9, MC10 có khả sống sót pH sau nuôi cấy Chủng chịu axit tốt MC9 MC10 - Thời điểm thu sinh khối tốt chủng MC9 môi trường MRS 37oC sau 14 ni cấy - Chủng MC9 thuộc lồi Lactobacillus fermentum chủng tuyển chọn trình nghiên cứu 5.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu tính chất để sàng lọc chủng làm probiotic định danh chủng DC1, DC2, MC5, MC10 - Tiến hành thử nghiệm tác dụng chủng trên động vật - Nghiên cứu khả ứng dụng chủng MC9 vào sản xuất TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 1978 Nguyễn Thành Đạt, Cơ sở sinh học vi sinh vật, Nhà xuất giáo dục, Hà Nội, 2001 Nguyễn Thành Đạt (Chủ biên), Mai Thị Hằng (2001), Sinh học vi sinh vật, NXB giáo dục Lương Đức Phẩm, Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, 1998 Lê Xuân Phương, Vi Sinh Vật Công Nghiệp, NXB xây dựng, Hà Nội, 2001 Nguyễn Thế Trang, Trần Đình Mấn, Một số đặc điểm phân loại hai chủng vi khuẩn lactic HN11 HN34 sinh tổng hợp L(+)-Lactic axit phân lập Việt Nam, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 6(4), 2008,505-511 Hồ Trung Thông, Hồ Lê Quỳnh Châu, Nghiên cứu khả sống môi trường đường tiêu hóa động vật số chủng vi sinh vât nhằm bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probotic, tạp chí khoa học Đại học Huế, số 55, 2009 Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích Vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo Dục Nguyễn Vũ Tường Vy, Nguyễn Văn Thanh, Trần Thu Hoa (2007), Khảo sát khả chịu đựng acid, muối mật kháng sinh số vi sinh vật nguyên liệu sản xuất probiotic dùng đường uống, Tạp Chí Dược học, (378), tr 255-263 Tiếng Anh 55 10 Analie Lourens-Hattingh, Bennie C Viljoen, Yogurt as probiotic carrier food, 2001, International Dairy Journal 11 (2001) 1–17 11 Arvola T, Sutas Y, Moilanen E, and Salminen S, Probiotics in the management of atopic eczema, Clin Exp Allergy 2000, 30: 1604–161 12 Corzo G., and Gilliland S.E , Bile Salt Hydrolase Activity of Three Strains, Oklahoma State University, Stillwater 74078 13 Dumbrepatil A., Adsul M., Chaudhari S., KhireJ , and Gokhale D (2008), Utilization of Molasses Sugar for Lactic Acid Production by Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii Mutant Uc-3 in Batch Fermentation, Applied and environmental microbiology, Jan 2008, Vol 74, No 1, p 333–335 [ac6] 14 Fuller, R Probiotics J Appl Bacteriol Symp 1986, (Suppl 61), 1S–7S 15.Gilliland, S E., and D K Walker 1990 Factors to consider when selecting a culture of L acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypercholesterolemic effect in humans J Dairy Sci.73:905–909 16.Gunter Klein, Alexander Pack, Christine Bonaparte1, Gerhard Reuterk, Taxonomy and physiology of probiotic lactic axit bacteria, International Journal of Food Microbiology, 1998, 103-125 17 Gyu Sung Cho and Hyung Ki Do, Isolation and Identification of Lactic Axit Bacteria Isolated from a Traditional Jeotgal Product in Korea, Ocean Science Journal, Vol 41 No 2, 2006,113-119 18 Havenaar, R., Huis in’t Veld, J.H.J Probiotics: a general view In: Wood, B.J.B (ed) The lactic acid bacteria in health and disease The lactic acid bacteria, Vol Chapman and Hall, New York, 1992: 209-224 19 Ignacio Guerrero Hernández,1 Aldo Torre Delgadillo,1 Florencia Vargas Vorackova, Misael Uribe, Intestinal flora, probiotics, and cirrhosis, 2008, 120-124 20 J B Brian, Wood, The Lactic Axit Bacteria, The Lactic in Health And Disease 21 Joint FAO/WHO Expert Consultation, Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria Report, 2001 56 22 Joint FAO/WHO Working Group, Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food , 2002 23 John F T Spencer, Alicia L Ragout de Spencer, Food Microbiology Protocols,173- 183 24 Khalil R., Mahrous H., , Kamaly K , Frank J., El-Halafawy K and El Soda M (2007), Evaluation of the probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from faeces of breast-fed infants in Egypt, African Journal of Biotechnology Vol (7), pp 935-945, April 2007 25.Kim P.I., Jung M.Y., Chang Y.H., Kim S., Kim S.J., Park Y.H Probiotic properties of Lactobacillus and Bifidobacterium strains isolated from porcine gastrointestinal tract Appl Microbiol Biotechnol, 74, (2007), 1103-1111 26.Klaenhammer T.R and Kullen M.J Selection and design of probiotics Int J Food Microbiol, 50, (1999), 45-57 27 Lars Axelsson, Lactic Axit Bacteria: Classification and Physiology, in: Lactic Axit Bacteria, Microbiological and Functional Aspects, 3rd edition, Seppo Salminen, Atte von Wright, Arthur Ouwehand, Marcel Dekker, Inc, New York, USA, 2004, 1-67 28 Lin W.H.,Yu B., Jang S.H., Tsen H.Y (2007); Different probiotic properties for Lactobacillus fermentum strains, isolated from swine and poultry; Anaerobe 13 (2007) 107–113 29 Liu et al, Acid and bile salt resistant Lactobacillus isolates having the ability to lower and assimilate cholesterol, United States Patent, 2007 30 Maragkoudakisa P A., Zoumpopouloua G., Miarisa C., Kalantzopoulosa G., Potb B., Tsakalidou E, Probiotic potential of Lactobacillus strains isolated from dairy products, International Dairy Journal 16,2006, p: 189– 199 31.Martins F.S., Miranda I.C., Rosa C.A., Nicoi J.R., and Neves M.J Effect of the trehalose levels on the screening of yeast as probiotic by in vivo and in vitro assays Brazilian Journal of Microbiology, 39, (2008), 50-55 32 Mota R M., Moreira J L., Souza M R., Horta M F., Teixeira S., Neumann E., Nicoli J and Nunes A C (2006), Genetic transformation of 57 novel isolates of chicken Lactobacillus bearing probiotic features for expression of heterologous proteins: a tool to develop live oral vaccines, BMC Biotechnology 2006, 6:2 doi:10.1186/1472-6750-6-2 33 M T Liong and N P Shah, Acid and Bile Tolerance and Cholesterol Removal Ability of Lactobacilli Strains, J Dairy Sci, 2005, 88:55–66, American Dairy Science Association 34 Parvez1 S., Malik2 K.A , Kang3 S Ah and H.-Y Kim, Probiotics and their fermented food products are beneficial for health, Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072 35 Suskovic J, Kos B, Matosic S and Besendorfer V, The efect of bile salts on survival and morphology of a potential probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92, World Journal of Microbiology & Biotechnology 16: 673-678, 2000 36 Tournut, J Applications of probiotics to animal husbandry Rev Sci Tech Off Int Epiz 1989, 8, 551–566 37 Yang et al, Bifidobactera strains with acid, bile salt and oxygen tolerance and their culture method, 1998 38 Yuan Kun Lee And Seppo Salminen, Handbook of probiotics anhd prebiotic, A Jonh Wiley and Sons, Inc., Publication 39.Zhou X., Pan Y., Wang Y., and Li W In vitro assessment of gastrointestinal viability of two photosynthetic bacteria, Rhodopseudomonas palustris and Rhodobacter sphaeroides J Zhejiang Univ Sci B, 8(9), (2007), 686-692 PHỤ LỤC Các bảng số liệu khảo sát khả chịu muối mật 58 Bảng 1: Kết thời gian OD 0,3 đơn vị chủng vi khuẩn lactic môi trường MRS có bổ sung muối mật STT Tên chủng Thời gian OD tăng lên 0,3 10 11 DC1 DC2 MC5 MC9 MC10 N1 N5 N10 T9 T10 NC10 12 NC13 2.345e 3.188cde 3.238cde 2.636 de 3.025cde 3.659 bcd 5.067 a 3.693a 3.835bc 4.307 ab 5.366 a 5.334 a Bảng : Bảng phân tích phương sai kết khảo sát khả chịu muối mật Source Model Error Correcte d Total DF Sum of Squares Mean Square 11 24 34.38513805 8.34346497 35 F Value Pr > F 8.99 F Model 0.14625980 0.03656495 Error 40 0.75822550 0.01895564 Corrected Total 44 1.93 0.1244 0.90448530 Bảng 12: Bảng phân tích phương sai khảo sát khả chịu axit 64 Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 14.83101450 3.70775362 Error 40 0.44959000 0.01123975 Corrected Total 44 329.88 F Model 9.14077530 2.28519382 Error 40 0.46179300 0.01154483 Corrected Total 44 197.94 F Model 10.87816170 2.71954042 Error 40 1.03759300 0.02593982 Corrected Total 44 104.84