1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH PHẠM THỊ HẰNG PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRITERPENOIT TỪ NẤM LỖ (HEXAGONIA APIARIA) Ở NGHỆ AN LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Vinh - 2014 2 LỜI CẢM ƠN Luận văn được thực hiện tại phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá hữu cơ - Khoa Hoá, Trung tâm Kiểm định An toàn Thực phẩm và Môi trường, Trường Đại học Vinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, Viện Hàn lâm - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS. TS Trần Đình Thắng – Phó trưởng Khoa Hoá học, Trường Đại học Vinh đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS Hoàng Văn Lựu, PGS.TS Lê Văn Hạc - Khoa Hoá học- Trường Đại học Vinh đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho tôi hoàn thành luận văn. TS. Đỗ Ngọc Đài đã giúp tôi thu mẫu thực vật. PGS.TS. Ngô Anh (Khoa Sinh, Trường Đại học khoa học Huế) giúp định danh mẫu thực vật. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, cán bộ bộ môn Hoá Hữu cơ, Khoa Hoá học, các anh chị nghiên cứu sinh, học viên cao học, các bạn sinh viên trong phòng thì nghiệm chuyên đề Hóa Hữu cơ, gia đình và người thân đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Nghệ An, ngày 30 tháng 10 năm 2014 Học viên Phạm Thị Hằng 3 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 4. Đối tượng nghiên và phạm vi nghiên cứu 2 5. Phương pháp nghiên cứu 2 Chương 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Họ Nấm Lỗ (Polyporaceae) 4 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố 4 1.1.2. Thành phần hóa học 4 1.1.2.1. Terpenoit 5 1.1.2.1.1. Các lanostan triterpenoit và dẫn xuất của chúng 5 1.1.2.1.2. Sesquiterpenoit và diterpenoit 18 1.1.2.2. Các sterol 21 1.1.2.3. Các hợp chất khác 28 1.1.3. Hoạt tính sinh học 29 1.1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào 29 1.1.3.2. Hoạt tính ức chế 29 1.2. Chi Hexagonia 30 1.2.1. Đặc điểm 30 1.2.2. Thành phần hoá học 31 1.2.3. Hoạt tính sinh học 32 1.3. Nấm lỗ (Hexagonia apiria) 32 1.3.1. Phân Loại 32 1.3.2. Đặc điểm 33 1.3.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 34 4 Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 35 2.1. Phương pháp nghiên cứu 35 2.1.1. Phương pháp lấy mẫu 35 2.1.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 35 2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 35 2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 36 2.2.1. Hoá chất 36 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 36 2.3.1. Phân lập các hợp chất 36 2.3.2. Một số dữ kiện về phổ tử ngoại, hồng ngoại, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất đã phân lập 37 Chương 3: KẾ T LUẬN VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. Phân lập các hợp chất 39 3.2. Xác đị nh cấu trúc hợp chất A 39 3.3. Xác đị nh cấu trúc hợp chất C 52 KẾ T LUẬN 66 TÀI LIỆ U THAM KHẢO 67 5 Danh mục các kí hiệu viết tắt, các chữ cái viết tắt CC: Column Chromatography (sắc kí cột) TLC: Thin Layer Chromatography (sắc kí lớp mỏng) RP -18: Reversed phase Chromatography (sắc kí cột pha đảo) IR: Infrared Spectroscopy (phổ hồng ngoại) HR-ESI- MS: High Resolution Electrospray Mass Spectrometry (phổ khối phân giải cao) 1 H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (phổ cộng hưởng từ hạt nhân) 13 C-NMR: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-13) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer. HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation COSY: Correlation Spectroscopy s: singlet br s: singlet tù t: triplet d: doublet dd: doublet của doublet ddd: doublet doublet doublet m: multiplet TMS: Tetramethylsilan DMSO: DiMethylSulfoxide Đ.n.c : Điểm nóng chảy 6 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất A 40 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất C 53 DANH SÁCH SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1 Chiết hợp chất trong quả thể nấm lỗ H. apiari 38 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 3.1 HMBC của hợp chất A (Hexagonin A) 42 Hình 3.2 Phổ khối lượng phân giải cao (HR- ESI-MS) của hợp chất A 42 Hình 3.3 Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất A 43 Hình 3.4 Phổ 1 H- NMR của hợp chất A 43 Hình 3.5 Phổ 1 H- NMR của hợp chất A 44 Hình 3.6 Phổ 3 C- NMR của hợp chất A 44 Hình 3.7 Phổ 13 C- NMR của hợp chất A 45 Hình 3.8 Phổ DEPT của hợp chất A 46 Hình 3.9 Phổ HSQC của hợp chất A 47 Hình 3.10 Phổ HSQC của hợp chất A 48 Hình 3.11 Phổ HMBC của hợp chất A 48 Hình 3.12 Phổ HMBC của hợp chất A 49 7 Hình 3.13 Phổ HMBC của hợp chất A 50 Hình 3.14 Phổ COSY của hợp chất A 51 Hình 3.15 Phổ COSY của hợp chất A 52 Hình 3.16 Phổ 1 H-NMR của hợp chất C 55 Hình 3.17 Phổ 1 H-NMR của hợp chất C 56 Hình 3.18 Phổ 13 C-NMR của hợp chất C 56 Hình 3.19 Phổ 13 C-NMR của hợp chất C 57 Hình 3.20 Phổ DEPT của hợp chất C 58 Hình 3.21 Phổ HSQC của hợp chất C 59 Hình 3.22 Phổ HMBC của hợp chất C 60 Hình 3.23 Phổ HMBC của hợp chất C 61 Hình 3.24 Phổ HMBC của hợp chất C 62 Hình 3.25 Phổ COSY của hợp chất C 62 Hình 3.26 Phổ COSY của hợp chất C 63 Hình 3.27 Phổ NOESY của hợp chất C 64 Hình 3.28 Phổ NOESY của hợp chất C 65 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Hiện nay, nấm được công nhận là một giới riêng biệt, khác biệt hẳn với thực vật hay động vật, chúng đã tách ra và xuất hiện xấp xỉ hơn một tỷ năm trước [5], tạo thành một giới riêng biệt trên hành tinh chúng ta. Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng môi trường sống khác nhau, đa phần nấm sống ở trên cạn, nhưng một số loài lại chỉ tìm thấy ở môi trường nước. Dựa theo sự theo tỉ lệ giữa số loài nấm với số loài thực vật ở trong cùng một môi trường, người ta ước tính giới Nấm có khoảng 1,5 triệu loài [6]. Tuy nhiên mới có khoảng hơn 80000 loài nấm đã được các nhà phân loại học phát hiện và định danh. Giới Nấm ngày càng có ý nghĩa to lớn trong nền kinh tế quốc dân, trong khoa học cũng như trong vòng tuần hoàn vật chất. 8 Giới nấm nói chung và nấm nói riêng có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con người, chúng là nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, là nguồn thức ăn quý được nhân dân ưa chuộng, chứa nhiều protein, các chất khoáng và vitamin (A, B, C, D, E ) [2,3]. Nhiều loài nấm được ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm, là nguồn nguyên liệu để điều chế các hoạt chất điều trị bệnh. Những loại nấm như nấm hương, nấm linh chi đã được tập trung nghiên cứu về khả năng chống ung thư, chống virus và tăng cường hệ miễn dịch của chúng. Ở Việt Nam, từ lâu nhân dân đã biết dùng nấm làm thực phẩm và dược phẩm. Việc nghiên cứu nấm được bắt đầu vào năm 1954 tại Đại học Tổng hợp Hà Nội đã mô tả 28 loài nấm ăn được và 10 loài nấm độc. Và cho đến nay ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm có nhiều loài được mô tả, nhưng mới chỉ có một số công trình nghiên cứu ứng dụng nấm làm dược liệu. Các loài nấm thuộc chi Hexagonia là các loài nấm quý, tuy vậy chúng chưa được nghiên cứu nhiều. Trên thế giới mới có hai công trình nghiên cứu từ Hexagonia speciosa. Chúng có hoạt tính sinh học cao, có khả năng ngăn chặn một số dòng ung thư. Loài Hexagonia apiaria là một loại nấm dược liệu có giá trị cao và tài nguyên thiên nhiên quý hiếm. Kỹ thuật trồng Hexagonia apiaria đã được phát triển và nhân tạo nấm đảm đã thu được thành công đầu tiên. Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng trong y học của chi này. Chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài: “ Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất triterpenoit từ nấm lỗ (Hexagonia apiaria (Pers.) Fr.) ở Nghệ An” từ đó góp phần xác định thành phần hoá học của các hợp chất và tìm ra nguồn nguyên liệu cho ngành hoá dược. 2. Mục đích nghiên cứu Đề tài tập trung đánh giá tiềm năng thành phần hóa học của loài nấm lỗ (Hexagonia apiaria) bao gồm thu mẫu thực vật, chụp ảnh, tạo tiêu bản, tạo dịch chiết metanol, tách chiết phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 9 phân lập được, tạo ra cơ sở dữ liệu khoa học phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng tiếp theo nhm tạo ra sản phẩm dược phẩm phục vụ cuộc sống. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Trong đề tài này, chúng tôi có các nhiệm vụ: - Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ nấm lỗ Hexagonia apiaria. - Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ nấm lỗ Hexagonia apiaria. 4. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là quả thể loài nấm lỗ Hexagonia apiaria. thuộc chi Nấm Hexagonia. 5. Phương pháp nghiên cứu - Thu mẫu và xác định tên khoa học cây. - Chiết với các dung môi có độ phân cực khác như hexan, etyl axetat, butanol… - Sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký như sắc ký cột thường (CC) sử dụng silicagel cỡ hạt 230-400/mesh. Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F 254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm, các phương pháp kết tinh phân đoạn. - Cấu trúc hoá học các hợp chất được phân lập được xác định bng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR) và hai chiều (2D NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, 1 H- 1 H COSY, HSQC và HMBC đã được sử dụng. - Cấu trúc lập thể tương đối và tuyệt đối của các hợp chất được xác định bng các phản ứng hoá học và các phương pháp phổ NMR với các kỹ thuật NOESY. 10 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Họ Nấm Lỗ (Polyporaceae) 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố Họ Polyporaceae là một họ nấm thuộc khung Basidiomycota bao gồm có 92 chi và hơn 636 loài. Các loài trong họ Polyporaceae là nấm gỗ mục nát, gồm có hai loại: 71 loài nấm trắng thối (phân hủy lignin) có hệ sợi nấm mono- hoặc di-mitic, bề mặt của bào tử đảm mịn, lưỡng cực; 21 loài nấm nâu thối (phân hủy cellulose) có hệ sợi nấm di- hoặc tri-mitic, tứ cực [7]. Hầu hết các loài của họ này có hymenium trong các lỗ chân lông nm ở mặt dưới của các mũ, một số loài có mang như Panus hoặc có cấu trúc mang [...]... Các hợp chất khác Từ kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của các loài thuộc họ Polyporaceae cho thấy ngoài các hợp chất chính trên còn tìm thấy một số hợp chất khác như: benzenoit, dẫn xuất maleimide và maleic anhydrit, dẫn xuất lignan và benzoquinon, dẫn xuất succinic và maleic; và một số hợp chất khác Từ năm 2001 – 2013, từ loài quả thể nấm Antrodia camphorata đã tách được 2 hợp chất phenyl và 1 hợp. .. Khung Lanosterol R = H, OH Hình 1.1: Các kiểu cấu trúc lanostanoit cơ bản Ngoài 4 loại khung cơ bản trên, khi cô lập hợp chất lanostanoit từ các loài nấm trong họ Polyporaceae còn có một số khung như sau [59]: 30 3 1 2 H H 29 4 H H Khung 7 , 9 ( 11 )-lanosta-diene 28 Khung seco -lanostane Khung seco -eburicane Hình 1.2: Các kiểu cấu trúc lanostanoit khác Từ năm 1991 – 1996, Tai T và cộng sự đã phân lập. .. phenyl và 1 hợp chất biphenyl bởi nhóm Huang K F và nhóm Huang R L [46, 47] 11 dẫn xuất succinic và maleic đã tách được bởi nhóm Chien S C và nhóm Yang S S [52, 53], 4 dẫn xuất maleimide và maleic anhydrit đã tách bởi Wu M D [51], 6 hợp chất benzenoit đã tách bởi Chen Y C và cộng sự [55] Ngoài ra còn tách được một số hợp chất như dẫn xuất ubiquinonol [50]; antroquinonol B, 4- 35 acetyl-antroquinonol... khuẩn,… Do đó, các loại nấm có thể tạo thành một nguồn tốt cho sự phát triển của các loại thuốc Các kết quả nghiên cứu cho thấy một số hợp chất thể hiện hoạt tính sinh học 1.1.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào Một số hợp chất triterpenoid và sterols được từ phân lập từ các loài nấm trong họ Polyporaceae đã được xác định là có khả năng gây độc tế bào với một số dòng tế bào ung thư ở người như dòng tế bào:... cộng sự đã phân lập 1 hợp chất lanstan triterpenoit mới từ dịch chiết của quả thể nấm Daedalea dickinsii là polyporenic acid C (17 ) Có hoạt tính chống ức chế collagen ở người với IC50 = 126µM [14] HOOC OH O H Axit Polyporenic C (17 ) Năm 1999, có 12 dẫn xuất lanostanoit từ dịch chiết hexan và metanol của lớp vỏ cứng nấm Fomitopsis pinicola trong đó có 6 hợp chất mới bởi Rösecke J và cộng sự là axit pinicolic... [56] Lanostan là một nhóm các triterpenoit tetracyclic có nguồn gốc từ lanosterol Chúng có đặc tính sinh học và dược lý, chẳng hạn như hiệu ứng gây độc tế bào của chúng qua sự cảm ứng của quá trình apoptosis Chủ yếu là được phân lập từ Ganoderma lucidum và một số loài nấm khác như: Poria cocos, Laetiporus sulphureus, Inonotus obliquus, Antrodia camphorata, Daedalea dickinsii, and Elfvingia applanata…Có... OH (36) Năm 2005, Yoshikawa K và cộng sự đã tách được 3 hợp chất lanostan triterpenoit và 5 hợp chất lanostane triterpene glucosides mới từ quả thể nấm Daedalea dickinsii gồm : axit daedaleanic A (37), B (43), và C (44); daedaleasides A (38), B (39), C (40), D (41) và E (42) ; với một axit carboxyacetyl quercinic (45) hoạt động gây độc với dòng tế bào bạch cầu (HL60) và tế bào khối u ruột (HCT-15)... I H và cộng sự đã tách được 3 hợp chất ergostane-kiểu triterpenoit mới từ quả thể nấm của một loài mới Antrodia cinnamomea là antcin A, B, C (116 – 118) [35] COOH O O R Antcin A ( 116 ) R = H, H Antcin B (117) R = O Antcin C (118 ) R = β -OH, H Năm 1996, từ dịch chiết dichloromethan của quả thể nấm Châu Âu Fomitopsis pinicola đã tách được 1 steroit là ergosta-7,22-dien-3β-ol (119) bởi Keller A C và. .. R=e R=f Năm 2008, nhóm Zheng Y và nhóm Zhou L đã tách được hai lanostane triterpenoit mới và 1 lanostane- kiểu triterpene từ quả thể nấm Poria Cocos là poriacoson A, B (68, 69) và axit 29-hydroxypolyporenic C (70) Trong đó hợp chất 70 có khả năng gây độc đối với hai dòng tế bào ung thư ở người là ung thư phổi (A549) và ung thư tuyến tiền liệt (DU145) ở giá trị IC50 là 25,3 và 418.6µM [ 22,23] O HOOC HOOC... hóa, chống ung thư, chống virus và hoạt động hypocholesterol mà ngày nay là mục tiêu quan trọng trong việc nghiên cứu thuốc trong y học Nấm dược liệu cho thấy tiềm năng lợi ích của việc chữa bệnh, là do chúng chứa một số hợp chất có hoạt tính sinh học Những hợp chất có khối lượng phân tử cao như: polysaccharides, protein và chất béo cũng như các hợp chất chuyển hóa có khối phân tử phức tạp thấp với thành . đề tài: “ Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất triterpenoit từ nấm lỗ (Hexagonia apiaria (Pers.) Fr.) ở Nghệ An từ đó góp phần xác định thành phần hoá học của các hợp chất và tìm ra. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH PHẠM THỊ HẰNG PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRITERPENOIT TỪ NẤM LỖ (HEXAGONIA APIARIA) Ở NGHỆ AN LUẬN VĂN. dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ nấm lỗ Hexagonia apiaria. - Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ nấm lỗ Hexagonia apiaria. 4. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên