BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH TÔ MINH HIỆP NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊNH LƢỢNG AXIT KAURENOIC TRONG MỘT SỐ CÂY THỰC VẬT THUỘC CHI NA (ANNONA) Ở VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Vinh – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH TÔ MINH HIỆP NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊNH LƢỢNG AXIT KAURENOIC TRONG MỘT SỐ CÂY THỰC VẬT THUỘC CHI NA (ANNONA) Ở VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: HOÁ PHÂN TÍCH Mã số: 60.44.0118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. TRẦN ĐÌNH THẮNG Vinh – 2014 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài " NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊNH LƢỢNG AXIT KAURENOIC TRONG MỘT SỐ CÂY THỰC VẬT THUỘC CHI NA (ANNONA) Ở VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO" Đề tài luận văn này đƣợc hoàn thành với sự hƣớng dẫn khoa học và chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Trần Đình Thắng – Phó Trƣởng khoa – Khoa Hóa, Trƣờng Đại học Vinh. Thầy đã dành nhiều thời gian hƣớng dẫn và giải đáp thắc mắc của tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị ở phòng thực hành thí nghiệm Hóa phân tích tại Trƣờng Đại Học Vinh đã tận tình giúp đở tôi trong quá trình tôi phân tích mẫu vật và làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các quý cơ quan đã tạo điệu kiện giúp đỡ về mọi mặt để luận văn này hoàn thành đúng kế hoạch. Tôi xin cảm ơn các Thầy Cô khoa Hóa, Phòng Đào tạo sau Đại Học Trƣờng Đại Học Vinh và Trƣờng Đại Học Đồng Tháp, các Thầy Cô tham gia giảng dạy Cao học khóa 20, lớp Hóa phân tích năm học 2012 – 2014 lời cảm ơn sâu sắc công ơn dạy dỗ trong suốt quá trình giáo dục, đào tạo của nhà trƣờng. Đồng thời Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Cao học Hóa phân tích Khóa 20 đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Tuy nhiên do sự hiểu biết của bản thân và khuôn khổ của luận văn thạc sĩ, nên chắc trong quá trình nghiên cứu không tránh khỏi những thiếu sót, Tôi rất mong đƣợc sự đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô và độc giả quan tâm đến luận văn này, chân thành cám ơn ! Nghệ An, ngày 26 tháng 10 năm 2014 Tác giả Tô Minh Hiệp 1 MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CÁM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỬ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 3 3. Đối tƣợng – Phạm vi nghiên cứu 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Họ Na (Annonaceae) 4 1.2. Chi Annona 5 1.2.1. Các hợp chất lignan 6 1.2.2. Các hợp chất acetogenin 7 1.2.3. Các hợp chất flavonoit 11 1.2.4. Các hợp chất diterpenoit kauran 12 1.3. Axit kaurenoic 16 1.3.1. Các thông số vật lý 16 1.3.2. Công thức cấu tạo 16 1.3.3. Ứng dụng 17 1.4. Phƣơng pháp sắc ký fingerprint và những ứng dụng của sắc ký fingerprint trong đánh giá chất liệu và dƣợc phẩm [ 1] 17 1.4.1. Giới thiệu về phƣơng pháp fingerprint 17 1.4.2. Những ứng dụng của sắc ký fingerprint trong đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu 19 1.4.3. Cách thức xây dựng và thực hiện phƣơng pháp sắc ký fingerprint 20 2 1.5. Hệ thống phân tích HPLC 30 1.5.1. Nguyên lý 30 1.5.2. Phân loại 31 1.5.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo 32 1.5.4. Pha động trong sắc ký pha đảo 33 1.5.5. Các bộ phận của hệ thống HPLC 36 1.5.6. Phƣơng pháp tiến hành sắc ký 37 1.5.6.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 37 1.5.6.2. Chuẩn bị dung môi pha động 37 1.5.6.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC 38 1.5.6.4. Cách đo HPLC 38 CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 39 2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 39 2.1.1. Thu mẫu 39 2.1.2. Phân lập chất chuẩn axit kaurenoic 40 2.2. Phƣơng pháp phân tích 41 2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 41 2.3.1. Thiết bị 42 2.3.2. Dụng cụ 42 2.3.3. Hóa chất 42 2.4. Kỹ thuật thực nghiệm 42 2.4.1. Chuẩn bị hóa chất phân tích 42 2.4.2. Xây dựng đƣờng chuẩn 43 2.4.3. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu 43 2.4.4. Tiến hành phân tích trên máy HPLC/UV 45 2.4.5. Tối ƣu hóa phƣơng pháp 45 2.5. Khảo sát đánh giá phƣơng pháp 47 3 2.5.1. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định (LOQ) của phƣơng pháp 47 2.5.2. Khảo sát độ lặp 47 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1. Phân lập hợp chất kaurenoic 48 3.2. Xác định axit kaurenoic 48 3.3. Định lƣợng axit kaurenoic 56 3.3.1.Xác định khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn của axit kaurenoic 56 3.3.2.Phƣơng pháp xử lý kết quả nồng độ Axit kaurenoic 58 3.3.3.Đánh giá phƣơng pháp xác định Axit kaurenoic 58 3.3.4.Sắc đồ Axit kaurenoic 62 KẾT LUẬN 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT CC: Column Chromatography (Sắc ký cột) FC: Flash Chromatography (Sắc ký cột nhanh) TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại) MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng) EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối va chạm electron) ESI-MS: Electron Spray Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng phun mù electron) 1 H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 13 C-NMR: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer. HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation COSY: Correlation Spectroscopy s: singlet br s: singlet tï t: triplet d: dublet dd: dublet của duplet dt: dublet của triplet m: multiplet TMS: Tetramethylsilan DMSO: DiMethylSulfoxide DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Các hợp chất acetogenin 9 Bảng 1.2: Các hợp chất diterpenoit kauran 12 Bảng 1.3: Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng 35 Bảng 3.1: Số liệu phổ 13 C và phổ DEPT của hợp chất axit kaurenoic 49 Bảng 3.2: Diện tích peak của Axit kaurenoic trong Na tƣơng ứng với từng nồng độ chuẩn 56 Bảng 3.3: Giá trị LOD và LOQ của Axit kaurenoic 57 Bảng 3.4: Kết quả phân tích hàm lƣợng Axit kaurenoic trong Na 58 Bảng 3.5: Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các mẫu na 59 DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1: Công thức cấu tạo các hợp chất lignan 7 Hình 1.2: Công thức cấu tạo các hợp chất acetogenin 9 Hình 1.3: Công thức cấu tạo các hợp chất flavonoit 12 Hình 1.4: Công thức cấu tạo: 16, ent-kaur-15-en-17,19-diol 16 Hình 1.5: Công thức cấu tạo của axit kaurenoic 17 Hình 1.6: Sơ đồ lựa chọn hệ dung môi trong quá trình chiết mẫu 23 Hình 1.7: Tóm tắt phƣơng pháp sắc ký fingerprint 29 Hình 1.8: Độ nhớt của hỗn hợp nƣớc và dung môi hữu cơ ở 25 o C 36 Hình 1.9: Sơ đồ hệ thống HPLC 37 Hình 2.1: Annona reticulata (mẫu 1) 39 Hình 2.2: Annona muricata (mẫu 2) 39 Hình 2.3: Annona squamosa (mẫu 3) 39 Hình 2.4: Quy trình chiết tách cao từ lá na 40 Hình 2.5: Quy trình phân lập các chất từ cao etyl axetat của lá na 41 Hình 2.6: Sơ đồ chuẩn bị mẩu Na 45 Hình 3.1: Phổ UV-Vis của hợp chất axit kaurenoic 50 Hình 3.2: Phổ IR của hợp chất axit kaurenoic 50 Hình 3.3: Phổ EI-MS của hợp chất axit kaurenoic 51 Hình 3.4: Phổ 1 H-NMR của hợp chất axit kaurenoic 51 Hình 3.5: Phổ 13 C-NMR của hợp chất axit kaurenoic 52 Hình 3.6: Phổ DEPT của hợp chất axit kaurenoic 52 Hình 3.7: Phổ DEPT dãn của hợp chất axit kaurenoic 53 Hình 3.8: Phổ HMBC của hợp chất axit kaurenoic 54 Hình 3.9: Phổ HSQC của hợp chất axit kaurenoic 55 Hình 3.10: Đƣờng chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích peak thu đƣợc và nồng độ các chuẩn Axit kaurenoic 57 Hình 3.11: Sắc đồ chuẩn Axit kaurenoic 25 ppm 9.928 min 62 0 Hình 3.12: Sắc đồ chuẩn Axit kaurenoic 50 ppm 9.941 min 63 Hình 3.13: Sắc đồ chuẩn Axit kaurenoic 100 ppm 9.936 min 63 Hình 3.14: Sắc đồ chuẩn Axit kaurenoic 500 ppm 10.039 min 64 Hình 3.15: Sắc đồ mẫu na 001 (lá na ta) 64 Hình 3.16: Sắc đồ mẫu na 002 (vỏ na ta) 65 Hình 3.17: Sắc đồ mẫu na 003 (vỏ bình bát) 65 Hình 3.18: Sắc đồ mẫu na 004 (vỏ na xiêm) 66 Hình 3.19: Sắc đồ mẫu na 005 (lá na xiêm) 66 Hình 3.20: Sắc đồ mẫu na 006 (lá bình bát) 67 [...]... “ Nghiên cứu và định lƣợng axit kaurenoic trong một số cây thực vật thuộc chi Na (Annona) bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao làm luận văn tốt nghiệp thạc sỹ 2 Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu các phƣơng pháp định lƣợng axit kaurenoic - Nghiên cứu quy trình tách, chi t axit kaurenoic trong các mẫu cây thuộc chi Na thu đƣợc trong quá trình lấy mẫu thực tế - Nghiên cứu quy trình định lƣợng axit. .. trình định lƣợng axit kaurenoic bằng phƣơng pháp HPLC 3 Đối tƣợng – phạm vi nghiên cứu Định lƣợng axit kaurenoic trong một số loài thuộc chi Na (Annona): Na (Annona squamosa), Na Xiêm (Annona muricata), Bình Bát (Annona reticulata) 4 CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Họ Na (Annonaceae) Họ Na (Annonaceae) còn đƣợc gọi là họ Mãng cầu, là một họ thực vật có hoa bao gồm các loại cây thân gỗ, cây bụi hay dây leo Với... đối tƣợng nghiên cứu sẽ mang lại hiệu quả cao trong quá trình đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu Sau đây là một số thiết bị và công cụ nghiên cứu đang đƣợc sử dụng trong việc đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu: Sắc ký lớp mỏng (TLC): Trƣớc khi có sự ra đời của các thiết bị phân tích hiện đại nhƣ sắc ký khí GC và sắc ký lỏng cao áp HPLC, sắc ký lớp mỏng đƣợc sử dụng nhiều trong phân tích thảo dƣợc Sắc ký lớp mỏng... khí hậu, khu vực sinh sống bằng phƣơng pháp sắc ký fingerprint dựa trên hệ thống HPLC, các kết quả nghiên cứu dựa trên sắc ký đồ và tín hiệu UV cho thấy khu vực sinh sống và thời tiết có tác động rất lớn đến thành phần hóa học của loài Huyết sâm này Bằng cách sử dụng hệ thống LC-MC một số thành phần xuất hiện trên sắc ký fingerprint của loài Huyết sâm cũng đã đƣợc nghiên cứu và xác định thông qua việc... thơm và đƣợc sử dụng trong sản xuất nƣớc hoa hay đồ gia vị Các loài cây thân gỗ còn dùng làm củi đốt 5 Vỏ cây, lá và rễ của một số loài đƣợc sử dụng trong y học dân tộc Bên cạnh đó, các nghiên cứu dƣợc lý đã tìm thấy khả năng kháng nấm, kháng khuẩn và đặc biệt là khả năng sử dụng trong hóa học trị liệu từ một số thành phần hóa học của lá, rễ và vỏ cây, quả, vỏ của quả… Một số loài đƣợc trồng làm cây. .. khoảng 2.300 đến 2.500 loài trong 120 - 130 chi, đây là họ lớn nhất của Bộ Mộc Lan (Magnoliales) Chi điển hình của họ này là Annona (Na hay Mãng cầu ta; mãng cầu xiêm hay mãng cầu gai) Họ này sinh trƣởng chủ yếu ở vùng nhiệt đới, và chỉ có một ít loài sinh sống ở vùng ôn đới Khoảng 900 loài ở Trung và Nam Mỹ, 450 loài ở châu Phi, và các loài khác ở châu Á Các loài thuộc họ Annonaceae có lá đơn, mọc so... tìm thấy ở các cây khác thuộc họ Na (Annonaceae) đã đƣợc ghi nhận với các hoạt tính: kháng ung bƣớu, kháng ký sinh trùng, diệt sâu bọ, kháng động vật nguyên sinh, ngán ăn, diệt giun sán, và kháng khuẩn [11] Do đó việc xác định và định lƣợng hợp chất này trong các cây họ Na rất cần thiết Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, có rất nhiều phƣơng pháp và công cụ để nghiên cứu các... thông qua phƣơng pháp sắc ký fingerprint Theo định nghĩa, một sắc ký fingerprint của một mẫu thảo dƣợc là một sắc ký đồ (hoặc một điện tâm đồ) có dƣợc tính và tính chất hóa học điển hình của một dịch chi t mẫu thảo dƣợc đó Mẫu sắc ký đồ này phải đảm bảo các yêu cầu về sự xuất hiện “rõ ràng” hay “mờ nhạt”, sự “giống” hay “khác nhau” của các yếu tố hóa học có mặt trong dƣợc liệu Dựa vào những đặc tính... khả năng chống u bƣớu từ thực vật họ Na: có khoảng 50 acetogenin, 12 styrylpyron và 25 polyoxygenat cyclohexen mới đƣợc tách ra từ 5 loài Uvaria, 4 loài Goniothalamus và 1 loài Annona Bƣớc đầu kiểm tra hoạt tính sinh học, phần lớn các chất mới tách ra có các hoạt tính chống u, bƣớu quan trọng 1.2 Chi Annona Chi Annona L có 125 loài, phân bố tập trung ở các vùng nhiệt đới châu Mỹ và châu Phi Ở Việt Nam, ... thu đƣợc trên sắc ký lỏng cao áp kết nối với khối phổ 1.4.3 Cách thức xây dựng và thực hiện phương pháp sắc ký fingerprint Xây dựng fingerprint: Mẫu fingerprint đƣợc tạo ra tùy thuộc vào đối tƣợng nghiên cứu Mỗi ngành khoa học có tiêu chuẩn đặc trƣng riêng cho 21 mẫu fingerprint Trong đề tài của tôi đề cập đến các tiêu chí để tạo mẫu sắc ký fingerprint phục vụ cho việc đánh giá dƣợc liệu trong y học . CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài " NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊNH LƢỢNG AXIT KAURENOIC TRONG MỘT SỐ CÂY THỰC VẬT THUỘC CHI NA (ANNONA) Ở VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO& quot;. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu và định lƣợng axit kaurenoic trong một số cây thực vật thuộc chi Na (Annona) bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao làm luận. DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH TÔ MINH HIỆP NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊNH LƢỢNG AXIT KAURENOIC TRONG MỘT SỐ CÂY THỰC VẬT THUỘC CHI NA (ANNONA) Ở VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC