Đang tải... (xem toàn văn)
MỤC LỤC trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................ 2 1.3. Yêu cầu ............................................................................................................ 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài .............................................. 2 1.4.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................... 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................... 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 2.1. Enzyme Nattokinase ......................................................................................... 3 2.1.1. Đậu tương ...................................................................................................... 3 2.1.2. Natto và Nattokinase ..................................................................................... 6 2.2. Boza .............................................................................................................. 16 2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ..................................................... 17 2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................................. 17 2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ................................................................ 18 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 20 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu .................................................................... 20 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 20 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 20 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................. 20 3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng ........................................................................... 20 3.3.1. Hóa chất ...................................................................................................... 20 3.3.2. Thiết bị sử dụng ........................................................................................... 21 3.3.3. Các môi trường sử dụng (Sambrook và Russel, 2006) ................................. 21 3.4. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 22 3.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 22 3.5.1.Phương pháp phân lập .................................................................................. 22 3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn .......................... 22 3.5.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn ........................... 23 7 3.5.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp nattokinase của vi khuẩn......................................................................... 23 3.5.5. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật ..................................................... 25 3.5.6. Phương pháp nhân giống vi khuẩn ............................................................... 25 3.6. Phương pháp sử lý số liệu ............................................................................... 25 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 26 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên men Boza .............................................................................................................. 26 4.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên men Boza .............................................................................................................. 26 4.2.1. Kết quả nghiên cứu hình thái của vi khuẩn BL4 .......................................... 26 4.2.2. Kết quả nghiên cứu đặc tinh sinh hóa của vi khuẩn BL4 ............................. 28 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 ............................................................................... 29 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 ........................................................................ 29 3.3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường tới khả năng tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 ............................................................................... 30 3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 31 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 33 4.1. Kết luận .......................................................................................................... 33 4.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 34
1 I HC THI NGUYấN TRNG I HC NễNG LM B TH I Tờn ti: Phân lập và nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ boza KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC H o to : Chớnh quy Chuyờn ngnh : Cụng ngh sinh hc Lp : K42 - CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khoỏ hc : 2010-2014 Ging viờn hng dn: TS. Dng Vn Cng Khoa CNSH-CNTP, trng i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn ThS. Lng Hựng Tin Khoa CNSH-CNTP, trng i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn Thỏi Nguyờn, nm 2014 2 LỜI CẢM ƠN! Để thực hiện được đề tài này em đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của thầy hướng dẫn và các thầy cô giáo, các bạn sinh viên. Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Dương Văn Cường, thầy Lương Hùng Tiến - giảng viên khoa Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, thầy đã luôn quan tâm giúp đỡ và chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tiếp theo em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành đề tài này. Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ dành thời gian cho em để em có thể hoàn thành tốt khóa luận trên. Do trình độ và điều kiện thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề tài không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô và các bạn để đề tài hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, Ngày 30 tháng 5 năm 2014. Sinh viên thực hiện Bế Thị Đài 3 DANH MỤC BẢNG BIỂU trang Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 20 Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 21 Bảng 4.1: Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính phân giải máu đông từ Boza 26 Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn BL4 27 Bảng 4.3: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn BL4 28 4 DANH MỤC CÁC HÌNH trang Hình 2.1: Natto và enzyme Nattokinase 7 Hình 2.2: Các cơ chế tác động lên fibrin của Nattokinase 9 Hình 2.3. Hình ảnh sản phẩm Boza 16 Hình 4.1: Hình thái tế bào vi khuẩn BL4 27 Hình 4.2: Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới hoạt tính Nattokinase của vi khuẩn BL4 29 Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng của pH tới hoạt tính sinh Nattokinase của vi khuẩn BL4 30 Hình 4.4: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 31 5 DANH MỤC VIẾT TẮT pI Điểm đẳng điện Da Dalton MW Khối lượng phân tử B. subtilis Bacillus subtilis TS Tiến sĩ t-PA Tissue plasminogen activator Bệnh viện TƯ Bệnh viện trung ương cs Cộng sự 6 MỤC LỤC trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích nghiên cứu 2 1.3. Yêu cầu 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2 1.4.1. Ý nghĩa khoa học 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Enzyme Nattokinase 3 2.1.1. Đậu tương 3 2.1.2. Natto và Nattokinase 6 2.2. Boza 16 2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 17 2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 17 2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 18 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 20 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 20 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu 20 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20 3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng 20 3.3.1. Hóa chất 20 3.3.2. Thiết bị sử dụng 21 3.3.3. Các môi trường sử dụng (Sambrook và Russel, 2006) 21 3.4. Nội dung nghiên cứu 22 3.5. Phương pháp nghiên cứu 22 3.5.1.Phương pháp phân lập 22 3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn 22 3.5.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn 23 7 3.5.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp nattokinase của vi khuẩn 23 3.5.5. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 25 3.5.6. Phương pháp nhân giống vi khuẩn 25 3.6. Phương pháp sử lý số liệu 25 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên men Boza 26 4.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên men Boza 26 4.2.1. Kết quả nghiên cứu hình thái của vi khuẩn BL4 26 4.2.2. Kết quả nghiên cứu đặc tinh sinh hóa của vi khuẩn BL4 28 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 29 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 29 3.3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường tới khả năng tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 30 3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 31 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 4.1. Kết luận 33 4.2. Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch do các cục máu đông (trombus) như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não đang tăng cao ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Vì vậy enzyme Nattokinase được quan tâm nghiên cứu sản xuất và sử dụng rộng rãi để phòng bệnh nghẽn động mạch do các cục máu đông. [1] Nattokinase là serine protease gồm 275 axit amin, hoạt động ở pH tối ưu từ 8-10, nhiệt độ tối ưu từ 30 - 70 o C, có trọng lượng phân tử từ 27,7 - 44kDa, điểm đẳng điện (pI) 8 và cấu trúc tương đồng với subtilisin. Cơ chế hoạt động của nattokianse là trực tiếp phân cắt fibrin trong huyết khối và gián tiếp bằng cách hoạt hóa sự sản xuất urokinase và plasmin trong mô. Sự tuần hoàn máu của người bị tác động bởi một số enzyme đặc biệt. Nattokinase hỗ trợ cho máu có thể lưu thông tốt hơn và giúp cho huyết áp ở mức bình thường.[32] Nattokinase có thể được tổng hợp từ các vi sinh vật (nhân sơ và nhân thật) như là Bacillus subtilis, Fusarium và Rhizomucor sp. và các enzyme tương tự có thể được tổng hợp từ tuyến tụy của người (Trypsin và chymotrypsin). Vi sinh vật có thể được dùng để sản xuất Nattokinase là Bacillus subtilis (Vi khuẩn) và Rhizomucor sp. (Nấm mốc). Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể được phân lập từ nhiều loại thực phẩm lên men truyền thống như: Natto của Nhật (Fujita M. và cs., 1993); Bacillus amyloliquefaciens DC-4 từ Douchi, Trung Quốc (Peng Y. và cs., 2003), Bacillus sp. CK 11-4 từ Chungkook-Jang và Bacillus sp. DJ-4 từ Doc-Jang, Hàn Quốc.[14][15] Boza là đồ uống lên men truyền thống từ lúa mạch của nhiều nước đông Âu và Thổ Nhĩ Kỳ. Trong Boza có hệ vi sinh đa dạng, bao gồm nhiều loại lợi khuẩn như là vi khuẩn lactic như: Lactobacillus brevis, Lb. platarum, Lb. graminis, Lb. paraplantarum, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis [18]. Các chủng vi khuẩn trong Boza không chỉ lên men tạo sản phẩm giàu dinh dưỡng từ lúa mạch mà có thể tổng 2 hợp sinh Nattokinase trong sản phẩm. Để đánh giá được điều này, chúng tôi lựa chọn đề tài “Phân lập và nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ boza” là đề tài nghiên cứu. 1.2. Mục đích nghiên cứu Phân lập và nghiên cứu được khả năng sinh tổng hợp enzyme Nattokinase của các chủng vi khuẩn từ Boza. 1.3. Yêu cầu - Phân lập được các chủng có khả năng sinh enzyme phân hủy máu đông Nattokinase từ sản phẩm lên men Boza. - Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các chủng đã phân lập được. - Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh Nattokinase của các chủng đã phân lập. 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học - Phân lập được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme phân hùy máu đông từ Boza, làm cơ sở để nghiên cứu tiếp theo trong thực tiễn. - Giúp sinh viên tiếp cận với thực tế nghiên cứu khoa học, thành thạo các thao tác phòng thí nghiệm vi sinh. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Phân lập được chủng vi khuẩn từ Boza có khả năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm phân hủy huyết khối trong phòng, chữa các bệnh tim mạch. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Enzyme Nattokinase 2.1.1. Đậu tương Đậu nành còn có tên là đậu tương. Nguồn gốc từ Trung Quốc, sau lan sang Việt Nam, Nhật Bản, Triều Tiên. Châu Âu mới biết đến đậu nành từ thế kỷ 18. Từ cổ xưa, đậu nành dùng làm thực phẩm, nhưng gần đây y học thế giới phát hiện ra nhiều tác dụng chữa bệnh của nó. Đây là kết luận được các chuyên gia Mỹ đưa ra trong hội nghị về khai thác giá trị dinh dưỡng từ đậu nành đối với sức khỏe con người tại Viện Dinh dưỡng thuộc Đại học Columbia (Mỹ). - Ngừa ung thư vú ở phụ nữ Một cuộc khảo sát của các nhà khoa học thuộc Đại học Georgetown (Mỹ) cho thấy bổ sung đậu nành ở mức độ vừa phải giúp giảm nguy cơ bị ung thư vú. Theo Hiệp hội Ung thư Mỹ, dùng 3 khẩu phần đậu nành mỗi ngày đem lại nhiều ích lợi cho phụ nữ có nguy cơ hoặc có tiền sử gia đình mắc bệnh ung thư vú. [33] -Tác dụng trên tim mạch Theo một cuộc khảo sát, bổ sung 20-133g protein từ đậu nành mỗi ngày có thể giúp giảm 7-10% hàm lượng cholesterol xấu LDL trong cơ thể. “Dùng đậu nành là một phần của chế độ dinh dưỡng giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim”, Wahida Karmally – Giám đốc dinh dưỡng tại Viện Nghiên cứu Irving nói. Còn theo Cơ quan Quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ (FDA), thêm 25g protein từ đậu nành mỗi ngày có tác dụng giảm lượng chất béo bão hòa, qua đó giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Các nhà khoa học thuộc Hội mãn kinh ở Bắc Mỹ đã kết luận: Đậu nành và các chất chiết từ đậu nành có tác dụng giảm huyết áp tâm trương, giảm cholesterol toàn phần, giảm cholesterol xấu (tức LDL-cholesterol), ngăn chặn sự tiến triển của [...]... 2.1.2.6 Các nguồn vi sinh vật tổng hợp Nattokinase Vi sinh vật là nguồn sản xuất quan trọng để tạo ra các hợp chất có khả năng phân hủy máu đông Streptokinase từ Streptococus hemolyticus và Satphylokinase từ Streptococus aureus đã sớm chứng minh được có hiệu quả trong liệu pháp tan huyết khối Nhiều năm qua, có thêm nhiều enzyme từ các loài vi sinh vật khác nhau đã được khám phá như nattokinase từ Bacillus... khác nhau đã được khám phá như nattokinase từ Bacillus natto, Subtilisin DFE và Subtilisin DJ-4 từ Bacillus myloliquefaciens.Các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và tảo 15 Bảng 2.1: Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme fibrinase [14][15] Nguồn vi sinh vật - Tài liệu tham khảo Trực khuẩn + B Subtilis BK.17 Jeong et al 2001 + B Subtilis A1 Jeong et... để phân lập và giữ giống vi khuẩn: Cao nấm men 0,5%; Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; Agar 2%; pH 7,2 - 7,4 22 - Môi trường LB dùng để nhân giống vi khuẩn: Cao nấm men 0,5%; Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; pH 7,2 - 7,4 3.4 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh Nattokinase từ Boza - Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn đã phân lập - Nội dung 3: Nghiên cứu. .. phân lập từ suối nước nóng có khả năng tạo ra enzyme phân hủy fibrin chịu nhiệt Một số loại nấm cũng có thể tạo ra protease có hoạt tính thủy phân fibrin cao như Aspergillus ochraceus 513, 16 Fusarium oxysporum, Penicillium chrysogenum H9,… Trong đó các chủng thuộc chi Bacillus là nguồn vi sinh vật quan trọng để sản xuất enzyme thủy phân fibrin Vào năm 1987, Bacillus subtilis natto sinh tổng hợp Nattokinase. .. LUẬN 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên men Boza Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu đồ uống lên men Boza được thể hiện trong bảng 4.1 Bảng 4.1: Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính phân giải máu đông từ Boza STT Chủng vi khuẩn Vòng phân giải (cm) 1 BL1 1,1 2 BL2 - 3 BL3 - 4 BL4 1,7 5 BL5 - Kết quả phân lập thu được 5 chủng vi khuẩn thuần khiết được ký hiệu... L5 Sau khi cấy các chủng lên môi trường dinh dưỡng chứa máu thỏ BAM, các chủng BL2, BL3, BL5 không tạo vòng phân giải trên đĩa môi trường Chỉ có 2 chủng BL1 và BL4 có hoạt tính phân giải máu đông, trong đó chủng BL4 có hoạt tính phân giải mạnh (vòng phân giải >1,5cm) và được chọn làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo 4.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên... tim mạch và đột quỵ não hiện nay có thành phàn chính là enzyme Nattokinase 18 2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Vi c nghiên cứu enzyme Nattokinase ở nước ngoài rất được chú trọng được nghiên cứu từ rất sớm và ngày càng được quan tâm vì những lợi ích mà nó mang lại Trong suốt những năm 1990, các nhà nghiên cứu báo cáo kết quả về các phương pháp khác nhau để của tách và tinh chế Nattokinase và các... bỏ sinh khối Sau đó dịch nổi được sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch 3.5.5 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Giống vi sinh vật được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng LBA ở nhiệt độ 4oC Sau 2-3 tuần giống vi sinh vật được cấy chuyển một lần để đảm bảo sức sống và ổn định của giống vi sinh vật trong quá trình nghiên cứu 3.5.6 Phương pháp nhân giống vi. .. sung về các đặc tính sinh hóa khác theo hệ thống phân loại vi 29 khuẩncủa Bergey hoặc bằng phương pháp sinh học phân tử thông qua phân tích trình tự rDNA 16S của ribosome 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 Vi khuẩn Bacillus... quả nghiên cứu đặc tinh sinh hóa của vi khuẩn BL4 Một số những đặc tính sinh hóa cơ bản của vi khuẩn BL4 được đánh giá, kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 4.3 Bảng 4.3: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn BL4 Đặc tính Kết quả đánh giá Bắt màu nhuộm Gram + Sinh bào tử + Sinh catalase + Sinh oxidase + Phân giải glucosea + Phân giải glucoseb + Phân giải lactoseb - Phân giải sucroseb + Sinh hơi + Sinh . tài Phân lập và nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ boza là đề tài nghiên cứu. 1.2. Mục đích nghiên cứu Phân lập và nghiên cứu được khả năng sinh tổng. tổng hợp enzyme Nattokinase của các chủng vi khuẩn từ Boza. 1.3. Yêu cầu - Phân lập được các chủng có khả năng sinh enzyme phân hủy máu đông Nattokinase từ sản phẩm lên men Boza. - Nghiên cứu. ti: Phân lập và nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ boza KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC H o to : Chớnh quy Chuyờn ngnh : Cụng ngh sinh hc