Đang tải... (xem toàn văn)
MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu................................................................ 2 1.2.1. Mục đích .................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................... 2 1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ..................................................................... 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3 2.1. Giới thiệu về cây Lan Kim Tuyến .............................................................. 3 2.1.1. Phân loại .................................................................................................. 3 2.1.2. Đặc điểm hình thái cây trưởng thành ...................................................... 3 2.1.3. Đặc điểm phân bố của Lan Kim Tuyến .................................................. 4 2.1.4. Số lượng quần thể ................................................................................... 5 2.1.5. Giá trị của Lan Kim Tuyến ..................................................................... 5 2.2. Tổng quan về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .......................... 5 2.2.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................... 5 2.2.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) ............................... 6 2.2.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV ...................................... 8 2.2.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV ................................ 9 2.2.5. Môi trường nuôi cấy mô TBTV .............................................................. 9 2.2.6. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................... 15 2.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam .................................. 18 2.3.1. Tình hình nghiên cứu Lan Kim Tuyến trên thế giới ............................. 18 2.3.2. Tình hình nghiên cứu Lan Kim Tuyến ở Việt Nam .............................. 19 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 21 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 21 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 21 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 21 3.2. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 21 3.2.1. Hóa chất................................................................................................. 21 3.2.2. Thiết bị .................................................................................................. 21 3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu. .................................................... 22 3.3.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 22 3.3.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 22 3.3.3. Chỉ tiêu theo dõi đánh giá ..................................................................... 27 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 28 4.1. Kết quả ảnh hưởng một số chất khử trùng tới tỉ lệ sống của mẫu chồi Lan Kim Tuyến ....................................................................................................... 28 4.1.1 Nghiên cứu nhằm xác định loại hóa chất khử trùng phù hợp nhất cho vật liệu nuôi cấy .................................................................................................... 28 4.1.2 Nghiên cứu hiệu quả của chất khử trùng NaCLO 1% kết hợp HgCl20,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Lan Kim Tuyến ........................ 31 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng, chất hữu cơ tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến .......................................... 33 4.2.1 Kết quả ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (BA, GA3,TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến ............................................. 33 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của Ba kết hợp với hàm lượng Auxin (IAA) tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến. ................................................... 37 4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh của Lan Kim Tuyến .............................................................................. 40 4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan Kim Tuyến ....................................................................................................... 42 4.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan Kim Tuyến ....................................................................................................... 43 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 46 5.1. Kết luận .................................................................................................... 46 5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47
Đại học Thái Nguyên TRNG I HC NễNG LM BI VĂN BÁCH Tên đề tài: “HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus roxburghii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÁI NGUN” KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học : Chính quy : Cơng nghệ sinh học : CNSH - CNTP : 2010 - 2014 Giáo viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Thị Tình Khoa CNSH - CNTP - Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên - 2014 LỜI CẢM ƠN Qua tháng thực tập phịng ni cấy mơ tế bào thực vật khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm đến em hoàn thành đề tài Để đạt kết ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa tồn thể thầy giáo môn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian qua Đặc biệt, em xin bày tỏ lịng kính trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Tình người tận tình bảo, hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Cuối em xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên, giúp đỡ tạo điều kiện vật chất tinh thần cho em trình học tập nghiên cứu Do thời gian thực đề tài có giới hạn nên đề tài khơng thể tránh khỏi sai sót Em mong nhận đóng góp ý kiến thầy bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 29 tháng 05 năm 2014 Sinh viên thực Bùi Văn Bách DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1.: Kết ảnh hưởng số hóa chất diệt nấm, vi khuẩn đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn mẫu chồi Lan Kim Tuyến (sau 10 ngày nuôi cấy) 29 Bảng 4.2 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch NaClO 1% kết hợp HgCl20,1% đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Lan Kim Tuyến (sau 10 ngày nuôi cấy) 31 Bảng 4.3 Kết ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng (BA, GA3,TDZ) đến khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 30 ngày nuôi cấy) 34 Bảng 4.4 Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với Auxin(IAA) đến khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 30 ngày nuôi cấy) 37 Bảng 4.5 Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với dung dịch nước dừa đến khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến sau (4 tuần nuôi cấy) 40 Bảng 4.6 Kết ảnh hưởng cường độ chiếu sáng tới khả rễ Lan Kim Tuyến (sau 15 ngày nuôi cấy) 43 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1 Biểu đồ mẫu sống khơng nhiễm với hóa chất khử trùng 29 Hình 4.2 Biểu đồ tỷ lệ mẫu sống khơng nhiễm ứng với CT thí nghiệm 31 Hình 4.2 Chồi Lan Kim Tuyến ni cấy môi trường MS (CT cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao nhất) 32 Hình 4.3 Biểu đồ hệ số nhân chồi Lan Kim Tuyến qua CT 34 Hình 4.3 Khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến bổ sung chất kích thích sinh trưởng (BA, GA3,TDZ) 35 Hình 4.4 Hệ số nhân Lan Kim Tuyến ứng với CT thí nghiệm 38 Hình 4.4 Chồi Lan Kim Tuyến bổ xung IAA 738 Hình 4.5 Biểu đồ khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến ứng với hàm lượng nước dừa 41 Hình 4.5 Chồi Lan Kim Tuyến mơi trương MS có bổ xung nước dừa 41 Hình 4.6 Biểu đồ khả rễ, Lan Kim Tuyến với CT thí nghiệm 44 Hình 4.6 Rễ Lan Kim Tuyến ứng với cương độ ánh sáng 44 DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ADN : Acid deoxyribonucleic B1 : Thiamin B3 : Nicotinic acid PP : Acid nicotinic B6 : Pyridoxine BA : 6-Benzylaminopurine CV : Coefficient of Variation Đ/C : Đối chứng IAA : Indol axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog’s NAA : α - Naphlene axetic acid TN : Thí nghiệm CT : Cơng thức GA3 : Acid ascorbic VW : Vaccine Went MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu nghiên cứu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Lan Kim Tuyến 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Đặc điểm hình thái trưởng thành 2.1.3 Đặc điểm phân bố Lan Kim Tuyến 2.1.4 Số lượng quần thể 2.1.5 Giá trị Lan Kim Tuyến 2.2 Tổng quan phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1 Khái niệm phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) 2.2.3 Ưu điểm phương pháp nuôi cấy mô TBTV 2.2.4 Nhược điểm phương pháp nuôi cấy mô TBTV 2.2.5 Môi trường nuôi cấy mô TBTV 2.2.6 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật 15 2.3 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 18 2.3.1 Tình hình nghiên cứu Lan Kim Tuyến giới 18 2.3.2 Tình hình nghiên cứu Lan Kim Tuyến Việt Nam 19 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 21 3.2 Hóa chất thiết bị 21 3.2.1 Hóa chất 21 3.2.2 Thiết bị 21 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 22 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 22 3.3.3 Chỉ tiêu theo dõi đánh giá 27 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết ảnh hưởng số chất khử trùng tới tỉ lệ sống mẫu chồi Lan Kim Tuyến 28 4.1.1 Nghiên cứu nhằm xác định loại hóa chất khử trùng phù hợp cho vật liệu nuôi cấy 28 4.1.2 Nghiên cứu hiệu chất khử trùng NaCLO 1% kết hợp HgCl20,1% đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Lan Kim Tuyến 31 4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng, chất hữu tới khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến 33 4.2.1 Kết ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng (BA, GA3,TDZ) đến khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến 33 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng Ba kết hợp với hàm lượng Auxin (IAA) tới khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến 37 4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến khả nhân nhanh Lan Kim Tuyến 40 4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng cường độ chiếu sáng tới khả rễ Lan Kim Tuyến 42 4.9 Nghiên cứu ảnh hưởng cường độ chiếu sáng tới khả rễ Lan Kim Tuyến 43 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Họ Lan (danh pháp khoa học: Orchidaceae) họ thực vật có hoa, thuộc Măng tây (Asparagales), lớp thực vật mầm Đây họ lớn thực vật, với tổng số 865 loài thuộc 154 chi Lan Kim Tuyến-Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl thuộc họ Lan - Orchidaceae, có phân bố rộng hầu hết tỉnh Việt Nam [2] tên khác Lan Kim Tuyến lông cứng, Kim Tuyến tơ, Giải thủy tơ, Lan Gấm, Cỏ nhung, Kim cương (Anoectochilus setaceus Lindl) lồi thực vật điển hình chi tên (Anoectochilus) Đây loài lan đất có mặt Vân Nam, Lào Việt Nam Chúng sinh sống triền núi đá vôi, dọc theo khe suối, tán to rừng ẩm độ cao 500 - 1.600 mét Chi Lan Kim Tuyến Anoectochilus Việt Nam thống kê 12 lồi, có lồi Lan Kim Tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall ex Lind [1] biết đến nhiều giá trị làm cảnh giá trị làm thuốc Lan Kim Tuyến loài dược liệu quý, gặp thuộc loại dùng để điều trị bệnh tim mạc [5], bồi bổ sức khỏe cho phụ nữ sau sinh [33] Đặt biệt dược liệu Lan Kim Tuyến có khả tiêu diệt khối u [6], [30] Với đặc tính quý giá dược liệu Do số lượng ít, mọc rải rác cịn bị khai thác q nhiều (với hình thức khai thác chặt cây) nên đưa vào Sách đỏ Việt Nam năm 2007 theo Nghị định 32/2006/NĐ-CP, xếp hạng EN A1a,c,d [2],[3] bị cấm khai thác sử dụng mục đích thương mại Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật nhân giống trở nên phổ biến Nuôi cấy mô tế bào tạo trồng bệnh, chất lượng tốt, độ đồng cao, hệ số nhân lớn giữ đặc tính di truyền mẹ Nhận thức vấn đề bảo tồn phát triển loài dược liệu quý - Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii), chúng tơi tiến hành đề tài: “Hồn thiện quy trình nhân giống Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) phương pháp in vitro Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên” 1.2 Mục đích yêu cầu nghiên cứu 1.2.1 Mục đích Nghiên cứu ảnh hưởng chất khử trùng đến khả tạo mẫu nấm vi khuẩn, nồng độ chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh cường độ ánh sáng tới khả rễ Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) 1.2.2 Yêu cầu - Xác định loại hóa chất khử trùng mẫu đạt hiệu tốt đến khả tạo vật liệu vô trùng phục vụ chỗ - Xác định ảnh hưởng nồng độ chất kích thích sinh trưởng (BA, GA3, TDZ, IAA) tới khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) - Xác định ảnh hưởng nước dừa tới khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) - Xác định ảnh hưởng cường độ chiếu sáng tới khả rễ Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên củng cố hệ thống hoá lại kiến thức học vào nghiên cứu khoa học - Biết phương pháp nghiên cứu vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày báo cáo khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài - Nâng cao hiệu nhân giống phương pháp ni cấy mơ, hồn thiện quy trình nhân nhanh giống Lan Kim Tuyến phương pháp nuôi cấy in vitro, đảm bảo cung cấp số lượng giống có chất lượng tốt đồng cho trình sản xuất - Bảo tồn nguồn dược liệu quý có nguy tuyệt chủng PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Lan Kim Tuyến 2.1.1 Phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật [16] Lan Kim Tuyến phân loại sau: Giới (regnum) Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Liliospida Bộ (ordo) Asparagales Họ (familia) Orchidaceae Phân họ (subfamilia) Orchidoideae Tông (tribus) Cranichideae Phân tông (subtribus) Goodyerinae Chi (genus) Anoectochilus Loài (species) roxburghii 2.1.2 Đặc điểm hình thái trưởng thành Cây thảo, mọc đất, có thân rễ mọc dài; thân đất mọng nước, mang mọc xoè sát đất - Đặc điểm thân rễ: Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, nghiêng, bò dài Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình 7,87 cm Đường kính thân rễ từ 3-4 mm, trung bình 3,17 mm Số lóng thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình 4,03 lóng Chiều dài lóng từ 1-6 cm, trung bình 1,99 cm Thân rễ thường có màu xanh trắng, đơi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, khơng phủ lơng [4] - Đặc điểm thân khí sinh: Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng mặt đất, mọc nghiêng Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình cm Đường kính thân khí sinh từ 3-5 mm, trung bình 3,08 cm Thân khí sinh mang nhiều lóng, lóng có chiều dài khác Số lóng thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình 2,87 Chiều dài lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, khơng phủ lơng, thường có màu xanh trắng, đơi có màu hồng nhạt 46 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau nghiên cứu thời gian khử trùng, khả nhân nhanh lan, khả rễ Lan Kim Tuyến mơi trường MS chất kích thích BA, GA3, TDZ, IAA cường độ ánh sáng khác đưa kết luận sau: - Khử trùng Lan Kim Tuyến NaClO 1% kết hợp HgCl2 0,1% phút cho kết cao với tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (sau 10 ngày nuôi cấy) 91,2 % - Môi trường nhân nhanh: + Môi trường MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l + BA 0,5 mg/l bổ sung nước dừa với nồng độ 100 ml/l, pH: 5,6-5,8 cho hệ số nhân chồi cao 5,6 lần, chất lượng chồi chung bình (chồi nhỏ, nhỏ, mầu xanh nhạt) Vĩnh Phúc - Môi trường rễ: + Môi trường MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l bổ sung NAA với nồng độ 1,0mg/l, pH: 5,6-5,8 điều kiện tối khả rễ tốt với số rễ/cây 3,2, chất lượng rễ tốt (rễ mập, dài, khỏe) 5.2 Kiến nghị - Cần nghiên cứu số loại hóa chất khác để khử trùng chồi Lan Kim Tuyến - Cần nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời hàm lượng khoáng đến khả tái sinh chồi Lan Kim Tuyến - Cần tiếp tục đưa giống Lan Kim Tuyến nuôi cấy mơ ngồi nhà ươm giống để khảo sát sinh trưởng, phát triển, suất kiểm tra chất lượng 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Tiến Bân (chủ biên), Danh lục loài thực vật Việt Nam Tập III, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, 2005 Bộ Khoa học Công nghệ, Sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật) Nxb Khoa học Tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội, 2007 Chính phủ Nước Cộng hồ xã hội chủ nghĩa Việt Nam, 2006 Nghị định số 32/2006/NĐ-CP Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng (2009), “Đặc điểm hình thái, phân bố sinh thái lồi Lan Kim Tuyến Anoectochilus setaceus Blume Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 26(2010), 104-109 Nguyễn Đức Lượng (2006), Công nghệ tế bào, NXB Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh :Bộ mơn Giống & Công nghệ sinh học- khoa Lâm Học- trường Đại học Lâm Nghiệp “Bước đầu nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro loài Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)” PGS - TSKH Lê Văn Hồng, Giáo trình cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật Hồ Ngọc Văn (2007), “Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro lan hài hồng (Paphiophidium delenatii) đặc hữu quý Việt Nam” Đh Nha Trang Trần Văn Minh (1997), Giáo trình cao học - nghiên cứu sinh học công nghệ tế bào thực vật, Viện sinh học nhiệt đới, Trung tâm Khoa học tự nhiên công nghệ quốc gia 10 Nguyễn Như Khánh (2011), Giáo trình - chất điều hòa sinh trưởng thực vật, Nxb giáo dục việt nam 11 Ngơ Xn Bình, Bùi Bảo Hồn, Nguyễn Thị Th Hà (2003), Giáo trình cơng nghệ sinh học, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội 48 12 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tân (2009), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục 13 Trịnh Đình Đạt (2009), Cơng nghệ sinh học (công nghệ di truyền), tập 4, Nxb giáo dục 14 Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành (2010), “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro loài Lan Kim Tuyến Anoectochilusroxburghii (Wall.) Lindl”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, 26(2010), 248-253 15 Nguyễn Quang Thạch, Phí Thị Cẩm Miện (2012), “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceusBlume) in vitro bảo tồn nguồn dược liệu quý”, Tạp chí Khoa học Phát triển 16 Trần Hợp (1990), Phong lan Việt Nam, tập 2, Nxb Nông nghiệp, Tp HCM 17 Đặng Ngọc Phúc, Nguyễn Thanh Tùng, Dương Thị Thùy Châu, Trương Thị Bích Phượng(2011), “Nhân giống in vitro Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L Wu)”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (4A): 689-698 18 Phạm Tuấn Trường, Võ Thị Bạch Mai (2008), “Nhân giống vơ tính Saintpaulia phương pháp in vitro”, Tạp chí phát triển KH&CN, tập 11, số 07 19 PGS Nguyễn Bá Lộc, PGS Trương Văn Lung giáo trình sinh lý học thực vật (2006) Nxb ĐH Huế 20 Mai Trần Ngọc Tiếng (2001) Thực vật cấp cao Nxb ĐH Quốc gia Hồ Chí Minh 21 Phạm Thị Thu Hằng cs (2013) nhân nhanh in vitro Trầu Bà Cánh Phượng tạp chí khoa học phát triển 2013, tập 11, số II Tài liệu tiếng Anh 22 Dois C.N Chang, L C Chou, G.C Lee (2007), '' New Cultivation Methods for Anoectochilus formosanus Hayata'', Orchid Science and Bioterchnology, 1(2), 56-60 23 Lazarus Agus Sukamto, Endah Dwi Rahayu and Edhi Sandra (2011), “Characteristics between Anoectochilus setaceus and Anoectochilus 49 formosanus by application of TDZ in vitro”, International Conference of Science and Technology (AICST) ISBN No 978979 16415 24 Yih-Juh Shiau, Abhay P Sagare, Uei-Chin Chen, Shu-Ru Yang, anh Hsin-Sheng Tsay (2001), “Conservation of Anoectochilus formosanus Hayata by artificial cross-pollination anh in vitro culture of seeds” Bot.Bull Acad Sin 43(2002), 123-130 25 Roberts H Smith (1992), plant tissue culture - Techniques and Experiments, Academic press, Inc, The United States of America 26 George SA, Bilsland DJ, Wainwright NJ, Ferguson J Failure of coconut oilto accelerate psoriasis clearance in narrow-band UVB phototherapy or photochemotherapy Photobiology Unit, Ninewells Hospital and Medical School, Dundee, Scotland, U.K 1993 27 Dr Oradee Sahavacharin (1996), Tissue culture micropropagation technology, Department of Horiticulture, Facutly of Agriculture, Kasetsart University 28 N Ahamed Sherif, J H Franklin Benjamin, S Muthukrishnan, T Senthil Kumar and M V Rao (2012), “Regeneration of plantlets from nodal and shoot tip explants of Anoectochilus elatus Lindley, an endangered terrestrial orchid”, African Journal of Biotechnology,11(29), 7549-7553 29 Kiet Van Nguyen (2004), “Effect of environmental conditions on in vitro and ex vitro growth of jewel orchid Anoectochilus formosanus Hayata, thesis for the degree of Doctor of Philosophy in Agriculture”, The Graduate School of Chungbuk National University 30 Chun-Nian He, Chun-Lan Wang, Shun-Xing Guo, Jun-Shan Yang and PeiGen Xiao (2006), “A Novel Flavonoid Glucoside from Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl”, Integrat Plant Biol, 48(3), 359−363 31 Paul Ormerod (2005), “Notulae Goodyerinae (II)”, Taiwania, 50(1), 1-10 32 Shu-Fen Cheng and Doris Chi-Ning Chang (2009), “Growth responses and changes of active components as influenced by elevations and orchid mycorrhizae on Anoectochilus formosanus Hayata”, Botanical Studies, 50(2009), 459-466 50 33 Hao-Yuan Cheng, Wen-Chuan Lin, Fu-Mei Kiang, Long-Yuan Wu and Wen-Huang Peng (2003), “Anoectochilus formosanus attenuates amnesia induced by scopolamine in rats”, J Chin Med 14(4) 235-245 34 Yang Dan, Xue-mei Yu, Shun-Xing Guo, and Zhi-xia Meng (2012), “Effects of forty-two strains of orchid mycorrhizal fungi on growth of plantlets of Anoectochilus roxburghii”, African Journal of Microbiology Research, 6(7), 1411-1416 35 C.-C Hsieh, H.-B Hsiao, W.-C Lin (2010), “A standardized aqueous extract of Anoectochilus formosanus modulated airway hyperresponsiveness in an OVA-inhaled murine model”, Phytomedicine, 17 557-562 36 Eapen (2001) Thidiazuron as a promoter of multiple shoots in cotton explants 37 Dilek Basalma TDZ-induced plant regenration in Astragalus cicer L 38 Parida et al (2010) nhân nhanh in vitro Địa Liền (Keampferia galaga) 39 Laraburu et al (2012) nghiên cứu nhân giống in vitro Handroanthus impetiginosus Phụ lục 2: Kết xử lý số liệu Bảng 4.1.1: Kết ảnh hưởng số hóa chất diệt nấm, vi khuẩn đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn mẫu chồi Lan Kim Tuyến (sau 10 ngày nuôi cấy BALANCED ANOVA FOR VARIATE MN FILE KTD 24/ 5/14 14:38 :PAGE ket qua anh huong cua chat khu trung den hieu qua lam sach mau lan kim tuyen VARIATE V003 MN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= VAR01 3749.07 1249.69 274.51 0.000 VAR02 11.5741 5.78703 1.27 0.347 * RESIDUAL 27.3148 4.55247 * TOTAL (CORRECTED) 11 3787.96 344.360 BALANCED ANOVA FOR VARIATE MSKN FILE KTD 24/ 5/14 14:38 :PAGE ket qua anh huong cua chat khu trung den hieu qua lam sach mau lan kim tuyen VARIATE V004 MSKN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= VAR01 6322.92 2107.64 260.14 0.000 VAR02 3.24074 1.62037 0.20 0.825 * RESIDUAL 48.6112 8.10187 * TOTAL (CORRECTED) 11 6374.77 579.524 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KTD 24/ 5/14 14:38 :PAGE ket qua anh huong cua chat khu trung den hieu qua lam sach mau lan kim tuyen MEANS FOR EFFECT VAR01 CT NOS 3 3 MN MSKN 54.4444 45.5556 7.77778 92.2222 20.5556 69.4445 38.3333 32.2222 SE(N= 3) 1.23186 1.64336 5%LSD 6DF 4.26121 5.68464 - MEANS FOR EFFECT VAR02 NL NOS 4 MN MSKN 31.6667 59.1667 29.5833 60.0000 29.5833 60.4167 SE(N= 4) 1.06683 1.42319 5%LSD 6DF 3.69032 4.92304 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KTD 24/ 5/14 14:38 :PAGE ket qua anh huong cua chat khu trung den hieu qua lam sach mau lan kim tuyen F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |VAR01 |VAR02 | (N= 12) SD/MEAN | | | NO BASED ON BASED ON % | | | OBS TOTAL SS RESID SS | | | MN 12 30.278 18.557 2.1337 7.0 0.0000 0.3474 MSKN 12 59.861 24.073 2.8464 4.8 0.0000 0.8245 - Bảng 4.2.1 kết ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl20,1% kết hợp NaClO 1% 0,2% đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Lan Kim Tuyến (sau 10 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE MN FILE KT 23/ 5/14 21:29 :PAGE anh huong cua thoi gian khu trung bang dung dich nuoc javen, HgCl2 den hieu qua VARIATE V003 MN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 6322.92 2107.64 260.15 0.000 NL 3.24074 1.62037 0.20 0.825 * RESIDUAL 48.6106 8.10177 * TOTAL (CORRECTED) 11 6374.77 579.524 BALANCED ANOVA FOR VARIATE MSKN FILE KT 23/ 5/14 21:29 :PAGE anh huong cua thoi gian khu trung bang dung dich nuoc javen, HgCl2 den hieu qua VARIATE V004 MSKN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 6322.92 2107.64 260.14 0.000 NL 3.24074 1.62037 0.20 0.825 * RESIDUAL 48.6112 8.10187 * TOTAL (CORRECTED) 11 6374.77 579.524 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KT 23/ 5/14 21:29 :PAGE anh huong cua thoi gian khu trung bang dung dich nuoc javen, HgCl2 den hieu qua MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 MN MSKN 54.4444 45.5556 7.77778 92.2222 30.5556 69.4445 67.7778 32.2222 SE(N= 3) 1.64335 1.64336 5%LSD 6DF 5.68460 5.68464 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS 4 MN MSKN 40.8333 59.1667 40.0000 60.0000 39.5833 60.4167 SE(N= 4) 1.42318 1.42319 5%LSD 6DF 4.92301 4.92304 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KT 23/ 5/14 21:29 :PAGE anh huong cua thoi gian khu trung bang dung dich nuoc javen, HgCl2 den hieu qua F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL (N= 12) SD/MEAN | | | NO BASED ON BASED ON % | | | OBS TOTAL SS RESID SS | | | MN 12 40.139 24.073 2.8464 7.1 0.0000 0.8245 MSKN 12 59.861 24.073 2.8464 4.8 0.0000 0.8245 | Bảng 4.2.1 Kết ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng (BA, GA3,TDZ) đến khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 30 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TC FILE HSNN 23/ 5/14 21:23 :PAGE anh huong cua GA3,BA,TDZ toi kha nang nhan nhanh VARIATE V003 TC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 5090.25 1696.75 452.47 0.000 NL 22.1667 11.0833 2.96 0.127 * RESIDUAL 22.4999 3.74999 * TOTAL (CORRECTED) 11 5134.92 466.811 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HSNN 23/ 5/14 21:23 :PAGE anh huong cua GA3,BA,TDZ toi kha nang nhan nhanh VARIATE V004 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 5.65583 1.88528 452.46 0.000 NL 2.246297E-01.123148E-01 2.96 0.127 * RESIDUAL 6.250003E-01.416671E-02 * TOTAL (CORRECTED) 11 5.70546 518678 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HSNN 23/ 5/14 21:23 :PAGE anh huong cua GA3,BA,TDZ toi kha nang nhan nhanh MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 TC 63.0000 87.3333 121.000 91.0000 HSN 2.10000 2.91111 4.03333 3.03333 SE(N= 3) 1.11803 0.372680E-01 5%LSD 6DF 3.86745 0.128916 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS 4 TC 92.5000 89.5000 89.7500 HSN 3.08333 2.98333 2.99167 SE(N= 4) 0.968244 0.322750E-01 5%LSD 6DF 3.34931 0.111645 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HSNN 23/ 5/14 21:23 :PAGE anh huong cua GA3,BA,TDZ toi kha nang nhan nhanh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL (N= 12) SD/MEAN | | | NO BASED ON BASED ON % | | | OBS TOTAL SS RESID SS | | | TC 12 90.583 21.606 1.9365 2.1 0.0000 0.1274 HSN 12 3.0194 0.72019 0.64550E-01 2.1 0.0000 0.1274 | Bảng 4.2.2 Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với Auxin(IAA) đến khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 30 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TC FILE NUOCDUA 23/ 5/14 21:42 :PAGE anh huong cua BA0,5, va nong nuoc dua toi kha nang nhan nhanh choi lan kim tu VARIATE V003 TC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 3402.92 1134.31 97.46 0.000 NL 13.5000 6.75000 0.58 0.592 * RESIDUAL 69.8336 11.6389 * TOTAL (CORRECTED) 11 3486.25 316.932 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE NUOCDUA 23/ 5/14 21:42 :PAGE anh huong cua BA0,5, va nong nuoc dua toi kha nang nhan nhanh choi lan kim tu VARIATE V004 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 3.78102 1.26034 97.46 0.000 NL 2.150000E-01.749998E-02 0.58 0.592 * RESIDUAL 6.775926E-01.129321E-01 * TOTAL (CORRECTED) 11 3.87361 352146 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NUOCDUA 23/ 5/14 21:42 :PAGE anh huong cua BA0,5, va nong nuoc dua toi kha nang nhan nhanh choi lan kim tu MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 TC 124.667 137.000 169.333 134.000 HSN 4.15556 4.56667 5.64444 4.46667 SE(N= 3) 1.96968 0.656559E-01 5%LSD 6DF 6.81344 0.227114 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS 4 TC 139.750 142.000 142.000 HSN 4.65833 4.73333 4.73333 SE(N= 4) 1.70579 0.568597E-01 5%LSD 6DF 5.90062 0.196687 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NUOCDUA 23/ 5/14 21:42 :PAGE anh huong cua BA0,5, va nong nuoc dua toi kha nang nhan nhanh choi lan kim tu F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL (N= 12) SD/MEAN | | | NO BASED ON BASED ON % | | | OBS TOTAL SS RESID SS | | | TC 12 141.25 17.803 3.4116 2.4 0.0001 0.5917 HSN 12 4.7083 0.59342 0.11372 2.4 0.0001 0.5917 | Bảng 4.2.3 Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với dung dịch nước dừa đến khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (4 tuần nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TC FILE NUOCDUA 23/ 5/14 21:42 :PAGE anh huong cua BA0,5, va nong nuoc dua toi kha nang nhan nhanh choi lan kim tu VARIATE V003 TC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 3402.92 1134.31 97.46 0.000 NL 13.5000 6.75000 0.58 0.592 * RESIDUAL 69.8336 11.6389 * TOTAL (CORRECTED) 11 3486.25 316.932 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE NUOCDUA 23/ 5/14 21:42 :PAGE anh huong cua BA0,5, va nong nuoc dua toi kha nang nhan nhanh choi lan kim tu VARIATE V004 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 3.78102 1.26034 97.46 0.000 NL 2.150000E-01.749998E-02 0.58 0.592 * RESIDUAL 6.775926E-01.129321E-01 * TOTAL (CORRECTED) 11 3.87361 352146 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NUOCDUA 23/ 5/14 21:42 :PAGE anh huong cua BA0,5, va nong nuoc dua toi kha nang nhan nhanh choi lan kim tu MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 TC 124.667 137.000 169.333 134.000 HSN 4.15556 4.56667 5.64444 4.46667 SE(N= 3) 1.96968 0.656559E-01 5%LSD 6DF 6.81344 0.227114 MEANS FOR EFFECT NL - NL NOS 4 TC 139.750 142.000 142.000 HSN 4.65833 4.73333 4.73333 SE(N= 4) 1.70579 0.568597E-01 5%LSD 6DF 5.90062 0.196687 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NUOCDUA 23/ 5/14 21:42 :PAGE anh huong cua BA0,5, va nong nuoc dua toi kha nang nhan nhanh choi lan kim tu F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL (N= 12) SD/MEAN | | | NO BASED ON BASED ON % | | | OBS TOTAL SS RESID SS | | | TC 12 141.25 17.803 3.4116 2.4 0.0001 0.5917 HSN 12 4.7083 0.59342 0.11372 2.4 0.0001 0.5917 | Bảng 4.3 Kết ảnh hưởng cường độ chiếu sáng tới khả rễ Lan Kim Tuyến(sau 15 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TR FILE RR 23/ 5/14 21:51 :PAGE anh huong cua cuong chieu sang toi kha nang re cay lan Kim Tuyen VARIATE V003 TR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 1006.22 503.111 92.41 0.001 NL 21.5556 10.7778 1.98 0.253 * RESIDUAL 21.7778 5.44444 * TOTAL (CORRECTED) 1049.56 131.194 BALANCED ANOVA FOR VARIATE R/C FILE RR 23/ 5/14 21:51 :PAGE anh huong cua cuong chieu sang toi kha nang re cay lan Kim Tuyen VARIATE V004 R/C LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 1.11802 559012 92.41 0.001 NL 2.239507E-01.119753E-01 1.98 0.253 * RESIDUAL 4.241975E-01.604937E-02 * TOTAL (CORRECTED) 1.16617 145772 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE RR 23/ 5/14 21:51 :PAGE anh huong cua cuong chieu sang toi kha nang re cay lan Kim Tuyen MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 TR 96.0000 78.6667 70.6667 R/C 3.20000 2.62222 2.35556 SE(N= 3) 1.34715 0.449050E-01 5%LSD 4DF 5.28054 0.176018 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS 3 TR 83.3333 79.6667 82.3333 R/C 2.77778 2.65556 2.74444 SE(N= 3) 1.34715 0.449050E-01 5%LSD 4DF 5.28054 0.176018 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE RR 23/ 5/14 21:51 :PAGE anh huong cua cuong chieu sang toi kha nang re cay lan Kim Tuyen F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL (N= 9) SD/MEAN | | | NO BASED ON BASED ON % | | | OBS TOTAL SS RESID SS | | | TR 81.778 11.454 2.3333 2.9 0.0012 0.2526 R/C 2.7259 0.38180 0.77778E-01 2.9 0.0012 0.2526 | Phụ lục 3: Môi trường Table 1: Preparation of modified Murashige AND Skoog’s MS medium Amount to take Final III 82,5 KNO3 95 37,0 MgSO4 4H2O ZnSO4 7H2O 2,23 1,058 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O II NH4NO3 CuSO4 5H2O I Component MgSO4 7H2O Bottle Stock Solution (g/l) 44,0 440,0 KI CoCl2.6H2O 0,083 0,0025 KH2PO4 IV H3BO3 Na2MoO4.2H2O V FeSO4 7H2O Na2EDTA 2H2O 17,0 0,62 0,025 2,784 3,724 preparation (ml) 20 concentratic (mg/ l) 1.650,0 1.900,0 370,0 10 10 22,3 10,6 0,83 0,025 170,0 10 6,2 0,25 10 27,85 37,25 0,5 2,0 0,1 0,5 0,5 2,0 0,1 0,5 mg/100ml Vitamin Nicotinic acid Glycine ThiamineHCl PyridoxineHCl 100 100 100 100 Inositol 100,0 Sucrose 30.000,0 Agar 8.000,0 PH 5,8 ... quý - Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii), tiến hành đề tài: “Hồn thiện quy trình nhân giống Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) phương pháp in vitro Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên”... khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày báo cáo khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài - Nâng cao hiệu nhân giống phương pháp nuôi cấy mô, hồn thiện quy trình nhân nhanh giống Lan Kim Tuyến. .. thích sinh trưởng (BA, GA3, TDZ, IAA) tới khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) - Xác định ảnh hưởng nước dừa tới khả nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii)