TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ĐỖ HỒNG DUNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BC TỪ CHỦNG GLUCONACETOBACTER BẰNG PHƢƠNG PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN TIA UV KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học HÀ NỘI - 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ĐỖ HỒNG DUNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BC TỪ CHỦNG GLUCONACETOBACTER BẰNG PHƢƠNG PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN TIA UV KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung và các thầy cô trong phòng Vi sinh, khoa Sinh - KTNN đã tận tình giúp đỡ em trong thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này.Cảm ơn tất cả các bạn sinh viên đã giúp đỡ tôi để hoàn thành khóa luận một cách tốt đẹp. Xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã giúp đỡ, động viên để em vững tin hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2014 Sinh viên Đỗ Hồng Dung LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter dưới tác dụng của tác nhân gây đột biến tia UV là do tôi thực hiện, không có sự trùng lặp với các tác giả khác. Tôi xin cam đoan những gì tôi viết trong luận văn này đều là sự thật.Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bố. Trong tài liệu này tôi có sử dụng tài liệu của một số tác giả, tôi xin phép tác giả để bổ sung cho luận văn của mình. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2014 Sinh viên Đỗ Hồng Dung DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 1PFK : Fructose - 1phosphate kinase BC : Bacterial cellulose CFU : Clony Forming Unit CS : Cellulose synthate cs : Cộng sự ĐB : Đột biến Nxb : Nhà xuất bản PMG : Phosphoglucomutase Pru-6-P : Fructose - 6 - phosphate PTS : Hệ thống Phosphotransferase UDPGlc : Uridine diphospho glucose UGP : Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase UV : Ultra Violet VSV : Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter theo Frateur (1950) 5 Bảng 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 xử lý đột biến 3 phút sau 3 ngày 28 Bảng 3.2. Điểm sai khác giữa chủng Gluconacetobacter BHN2 vàGluconacetobacter BHN2 ĐB 32 Bảng 3.3. Khả năng tạo màng BC của các chủng Gluconacetobacter BHN2ĐB lần thứ nhất 37 Bảng 3.4. Khả năng tạo màng BC của các mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7 lần thứ 2 37 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1.Vi khuẩn Gluconacetobacter 4 Hình 1.2. Cấu trúc cellulose 11 Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp celluose ở chủng Gluconacetobacter 12 Hình 3.1.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trên kính hiển vi quang học 20 Hình 3.2.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trên thạch nghiêng 21 Hình 3.3.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trong môi trường hoạt hóa 22 Hình 3.4. Màng BC từ chủng Gulconacetobacter BHN2 23 Hình 3.5. Xử lý đột biến 7 phút vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 24 Hình 3.6. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 xứ lỷ đột biến 5 phút sau 3 ngày. 25 Hình 3.7. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 xử lý đột biến ở 7 phút sau 3 ngày 26 Hình 3.8. Xử lý đột biến 3 phút vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 27 Hình 3.9. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 xử lý đột biến 3 phút sau 3 ngày. 28 Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 (A) vàGluconacetobacter BHN2 ĐĐ (B) 30 Hình 3.11. Hình thái vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 (A) vàGluconacetobac BHN2 ĐB (B) Hình 3.12.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trên thạch nghiêng 33 Hình 3.13.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 ĐB trong môi trường hoạt hóa 34 Hình 3.14. Lên men tạo màng BC từ các mẫu ĐB2, ĐB5, ĐB7 35 Hình 3.15. Màng BC từ mẫu ĐB3, ĐB5 36 Hình 3.16. Mẫu ĐB7 không tạo màng 36 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu của đề tài 1 3. Nội dung nghiên cứu 1 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2 5. Điểm mới của đề tài 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới 3 1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới 3 1.1.2. Đặc điểm phân loại 3 1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter 6 1.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetobacter trên thế giới và ở Việt Nam 7 1.2.1. Trên thế giới 8 1.2.2. Ở Việt Nam 9 1.3. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC 11 1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của màng BC 11 1.3.2. Cơ chế tổng hợp màng BC 12 1.4. Gây đột biến ở vi sinh vật 13 Chƣơng 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Đối tượng nghiên cứu và hóa chất 15 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 15 2.1.3. Hóa chất 15 2.1.4. Môi trường 16 2.2. Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1. Phương pháp vi sinh 16 2.2.2. Phương pháp gây đột biến vi sinh vật 18 2.2.3. Phương pháp tuyển chọn sơ bộ các chủng sau đột biến 19 2.2.4. Phương pháp toán học 19 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 3.1. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2. 20 3.1.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào. 20 3.1.2. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 21 3.2. Xử lý đột biến chủng Gluconacetobacter BHN2 dưới tác dụng của tia UV….23 3.2.1. Thí nghiệm lần 1 24 3.2.2. Thí nghiệm lần 2 25 3.2.3. Thí nghiệm lần 3 27 3.3. Lựa chọn khoảng thời gian xử lý đột biến tia UV phù hợp 29 3.4. So sánh hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào của chủng Gluconacetobacter BHN2 và Gluconacetobacter BHN2 ĐB 29 3.4.1. Hình thái khuẩn lạc 29 3.4.2. Hình thái tế bào 30 3.5.3. Điểm sai khác giữa chủng Gluconacetobacter BHN2 vàGluconacetobacter BHN2 ĐB 31 3.5. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 sau đột biến 33 3.5.1. Nhân giống Gluconacetobacter BHN2 ĐB trên môi trường thạch nghiêng 33 3.5.1. Nuôi chủng Gluconacetobacter BHN2 ĐB trong môi trường hoạt hóa thu sinh khối 34 3.5.3. Tạo màng BC từ 3 mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 1 MỞ ĐẦU 1.Lý do chọn đề tài Như chúng ta đã biết thế kỉ XX là thế kỉ của ngành công nghệ thông tin thì thế kỉ XXI là thế kỉ của ngành công nghệ sinh học. Ngày nay công nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật chủ đạo của nhiều quốc gia trên thế giới. Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh đã có những thành tựu to lớn và ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công nghiệp, y học… Nó đã và đang tập trung sự chú ý của các nhà khoa học trên toàn thế giới. Màng BC do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc tính cơ học giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lí đặc biệt như: độ bền cơ học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn. Vì vậy màng BC được ứng dụng đã và đang được quan tâm hiện nay là sản xuất màng BC điều trị bỏng và tổn thương da. Xuất phát từ thực tiễn về nhu cầu sử dụng màng BC dùng trị bỏng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năngtạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter bằng phương pháp gây đột biếntia UV”. 2.Mục tiêu của đề tài Xử lý đột biến tia UV với chủng Gluconacetobacter BHN2, nghiên cứu khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter BHN2 ĐB dưới tác dụng của tia UV, từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.Nội dung nghiên cứu 3. 1. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2. 3. 2. Gây đột biến chủng Gluconacetobacter BHN2 dưới tác dụng của tia UV. 3.3. Lựa chọn khoảng thời gianxử lý đột biến phù hợp. [...]... hình thái tế bào của chủng Gluconacetobacter BHN2 và Gluconacetobacter BHN2 ĐB 3 5 Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 sau khi gây đột biến 4.Ý nghĩa khoa họcvà ý nghĩa thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu khả năng lên men tạo màng BC từ chủng GluconacetobacterBHN2 ĐB, từ đó chọn chủng sau đột biến để có thể nâng cao chất lượng màng, từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo 4.2... nghiên cứu tiếp theo 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 ĐB để có thể rút ngắn thời gian tạo màng 5.Điểm mới của đề tài Đã xử lý đột biến chủng Gluconacetobacter BHN2 dưới tác dụng của tia UV trong khoảng thời gian 3, 5, 7 phút; tiếp tục nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng ĐB, từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU... nghiên cứu quan tâm phân loại đột biến theo hai hướng: tác nhân gây đột biến, và tính trạng biến đổi do đột biến Các phương pháp gây đột biến ở vi sinh vật: Gây đột biến bằng tác nhân hóa học: Có rất nhiều hóa chất có thể gây đột biến, trong đó các chất gây đột biến mạnh nhất gồm có: metylmetansunfonat, etylmetansunfonat, đimetylsunffat, đietylsunffat, metylnitronitrozoguanidin,… [8] Gây đột biến bằng. .. việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter ngày càng được quan tâm Có một số các nghiên cứu, công bố liên quan đến Gluconacetobacter sự hình thành màng BC và ứng dụng màng BC. Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình tạo màng, đặc tính cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng, sản xuất thạch dừa Gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ... 2.2.1.5 Phương pháp lên men tạo màng Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng Sau đó khử khuẩn ở đèn tím trong 15 phút Bổ sung vào môi trường 5% giống hoạt hóa Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh trong 3 - 4 ngày [5] 2.2.2 Phương pháp gây đột biến vi sinh vật Nguyên tắc gây đột biến: Lấy chủng có khả năng tạo màng chất lượng cao nhân thuần, ổn định hoạt tính [10] Chúng tôi tiến hành gây đột biến. .. đại gây biến đổi bộ máy di truyền của VSV theo những hướng xác định như lai ghép tế bào trần và chuyển gen Đã thu được những chủng có năng suất rất cao nhưng các nhà nghiên cứu vẫn thường xuyên dùng phương pháp tuyển chọn bằng tia UV Phương pháp này đơn giản, dễ làm, an toàn, đặc biệt chi phí thấp 14 CHƢƠNG 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu và hóa chất 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Chủng. .. Chí Minh cho biết nhóm nghiên cứu của ông chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên men Nó có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học có thể thay thế da tạm thời Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả như Huỳnh Thị Ngọc Lan, nghiên cứu chế tạo màng trị bỏng từ Bacterial cellulose của Gluconacetobacter và hoạt... 4000A0) Theo các nghiên cứu đột biến tia UV thì bước sóng 26000A0 đến 28000A0 có tác dụng biến đổi mạnh nhất tới bộ máy di truyền VSV Đây cũng là bước sóng mà các nhà nghiên cứu hay dùng 13 Cơ chế gây đột biến của tia UV đối với VSV còn nhiều tranh cãi, tuy nhiên nhiều nghiên cứu đưa ra một giả thuyết chung như sau: Ở bước sóng 26000A0 AND của vi khuẩn hấp thụ mạnh nhất Dưới tác động của tia UV, bazơ cystein... bằng tác nhân vật lý: Là sử dụng các tia phóng xạ như tia α, β, γ và tia tử ngoại có tác dụng gây nhiều loại đột biến, thường dùng trong phòng thí nghiệm Tia tử ngoại với bước sóng 260nm có hiệu quả cao trong việc gây đột biến cho vi sinh vật, tác dụng chủ yếu lên các bazơ pirimidin Tia tử ngoại (ultraviolet) (UV) là tác nhân được nhà nghiên cứu sử dụng gây đột biến từ những năm đầu của thế kỉ XIX, do... với các phương pháp đương thời Tia UV tác động vào bộ máy di truyền gây biến đổi mạnh có thể tạo ra những chủng có hoạt tính mạnh, ngoài ra tia UV còn khá an toàn đối với người sử dụng Nên trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đi sâu phân tích ảnh hưởng của tia UV đến đột biến của vi sinh vật [8] Tia UV nằm trong vùng quang phổ không nhìn thấy của ánh sáng mặt trời Là sóng điện từ có bước sóng từ: 150.10-10m . dụng màng BC dùng trị bỏng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu khả năngtạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter bằng phương pháp gây đột biếntia UV . 2.Mục tiêu của đề tài Xử lý đột biến. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1. Phương pháp vi sinh 16 2.2.2. Phương pháp gây đột biến vi sinh vật 18 2.2.3. Phương pháp tuyển chọn sơ bộ các chủng sau đột biến 19 2.2.4. Phương pháp. lý đột biến tia UV với chủng Gluconacetobacter BHN2, nghiên cứu khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter BHN2 ĐB dưới tác dụng của tia UV, từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.