LỜI CẢM ƠN Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Phương Phú Công, người đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ Vi sinh vật học và toàn thể các thầy cô khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại đây. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Dung LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, các kết quả thu được trong khoá luận là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kì công trình khoa học nào. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Dung Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 SVTH: Nguyễn Thị Dung 1 K35B - SP Sinh DANH MUC BẢNG • Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ phẩm DANH MUC HÌNH • CÁC THUẢT NGỮ VIẾT TẮT Cs : Cộng sự CMC : Cacboxyl methyl cellulose CMC - ase : Cacboxylmethylcellulase Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 SVTH: Nguyễn Thị Dung 2 K35B - SP Sinh MỤC LỤC MỞ ĐÀU í . Lý do chọn đề tài Trong thời gian gần đây chăn nuôi đang gặp phải những khó khăn với hàng loạt các vấn đề nổi lên như: nhiều dịch bệnh như cúm gia cầm tái phát và giá thức ăn chăn nuôi cao, Chính vì vậy, ngành chăn nuôi nước ta đang đứng trước một thách thức mới là làm thế nào để có một nền nông nghiệp bền vững và ổn định trong thời kì kinh tế hội nhập, phát triển nhanh, luôn đổi mới và nhiều cạnh tranh này. Mặt khác, một nền nông nghiệp phát triển như ở Việt Nam thì vấn đề được đặt ra là đầu ra cho các phế phụ phẩm trong nông nghiệp sau thu hoạch như rơm rạ, vỏ trấu, vỏ lạc Nguồn phế phụ phẩm trong nông nghiệp thải ra trong quá trình sản xuất và chế biến nông sản của nước ta ước tính khoảng trên 50 triệu tấn mỗi năm. Lượng phế thải lớn này là những hợp chất hữu cơ giàu cacbon và các chất khoáng đa vi lượng. Đây là nguồn nguyên liệu có giá trị cao cho sản xuất các dạng chế phẩm sinh học cũng như phân hữu cơ sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp đặc biệt là trong lĩnh vực chăn nuôi. Do vậy, cần phải có những phương pháp, những nghiên cứu khả thi và hiệu quả để tận dụng nguồn phế phẩm nông nghiệp dồi dào này [26] Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose, chúng được tổng hợp chủ yếu nhờ vi sinh vật trong đó nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose cao hơn cả như Aspegillus, Mucor, Tricoderma Cellulase là một phức hệ enzyme rất quan trọng và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Cellulase được sử dụng với 2 mục đích chính : Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải các phế thải của công nghiệp thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ sung vào thức ăn gia súc và vào trong công nghệ môi trường ; Thủy phân cellulase tạo cơ chất lên men để thu Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 SVTH: Nguyễn Thị Dung 3 K35B - SP Sinh sản phẩm cuối cùng khác nhau. Cellulase đã, đang và sẽ ngày càng được sử dụng nhiều hơn để bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi [12]. Từ rất lâu trước, con người cũng đã biết đến sự tồn tại của các chủng nấm mốc và đã biết ứng dụng chúng vào nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường, nông nghiệp Trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong chăn nuôi như : Chu Thanh Bình và Cs (2012) đã ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bãi thải hoa quả giàu cellulose làm thức ăn gia súc ; Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn bằng cách sử dụng Aspergillus hennebergi niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho bò; Phương Phú Công (2008) Tuyển chọn và ứng dụng một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men xylan trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu xylanase phục vụ cho chăn nuôi và đã thu được kết quả cho nhiều triển vọng. Xuất phát từ những yều cầu cấp thiết như trên tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu ceỉỉuỉase phục vụ chăn nuôi ” 2 . Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V trong việc phân giải cellulose trên các phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi. 3 . Nội dung của đề tài 3.1. Tuyển chọn và nghiên cứu chủng nấm mốc M4V có khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp. 3.2. Bước đầu đánh giá sản phẩm lên men từ chủng nấm mốc M4V để bổ sung vào thức ăn làm tăng năng suất vật nuôi. 4 . Ỷ nghĩa của đề tài 4.1. Ý nghĩa lý luận Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Bước đầu nghiên cứu nâng cao chất lượng phế phụ phẩm trong ngành nông nghiệp Việt Nam để phục vụ chăn nuôi. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 SVTH: Nguyễn Thị Dung 4 K35B - SP Sinh CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cellulose y à sự phân bố cellulose trong thực yật 1.1.1, Cellulose Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (CeHio05) n , và là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-0- (P-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.1). Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 10 11 tấn cellulose (trong gỗ,cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%) [27]. Cellulose Hình 1.1. Công thức hoá học của cellulose Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Waals Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hoá chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose không liên kết chặt với nhau nên dễ bị tấn công [27]. Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo dài và định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 A° và xếp xen kẽ với vùng vô định hình [27]. Trong mô hình chuỗi gập: phân tò cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng khớp khoảng 1000. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thuỷ phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết ß - glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tò monomer sắp xếp tạo ra sự thay đổi 180° tri ụỉìit Khóa luận tất nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 SVTH: Nguyễn Thị Đung 5 K35B - SP Sinh cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thuỷ phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hoá trị (ß - glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro [27]. Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen. Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose. Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết ß-1 —>4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm - OH tự do, vì vậy giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa các nhóm - OH của chúng. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hơn hay còn gọi đó là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose [27]. Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thuỷ phân. Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hoá được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hoà hoạt động của hệ Khóa luận tất nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 SVTH: Nguyễn Thị Đung 6 K35B - SP Sinh thống tiêu hoá. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm cũng có thể phân huỷ cellulose, vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn [24]. 1.1.2. Sự phân bổ cellulose trong thực vật Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn. Sinh khối thực vật của trái đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn. Khối lượng cellulose khổng lồ này ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có trong động vật và vi sinh vật nhưng với số lượng nhỏ. Cùng với cellulose, hemicellulose và lignin phối hợp với nhau tạo nên cấu trúc và quyết định tính chất hoá học và cơ lí của nguyên liệu có nguồn gốc thực vật. Các hợp chất này thường đi cùng với nhau, do đó người ta thường gọi là ligno - cellulose (Bảng 1.1) [27]. Bảng 1.1. Thành phần lỉgnocellulose trong rác thải và phế phụ phẩm nông nghiệp phổ biến Khỏa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 SVTH: Nguyễn Thị Dung 7 K35B - SP Sinh Khỏa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 SVTH: Nguyễn Thị Dung 8 K35B - SP Sinh Nguồn lignocellulose Cellulose Hemicellulose Lignin (%) (%) (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 /V ^ ml A Ã Ả Thân gô mêm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giây 85-99 0 0-15 Vỏ trâu 32.1 24 18 Vỏ trâu của lúa mì 30 50 15 Rác đã phân loại 60 20 20 Lá cây 15-20 80-85 0 Hạt bông 80-95 5-20 0 Giây báo 40-55 25-40 18-30 Giây thải từ bột giây hoá học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nước thải ban đầu 8-15 - 24-29 Chât thải của lợn 6 28 - Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.1-5.1 Cỏ ở bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4 Cỏ mềm 45 31.4 12 Các loại cỏ (trị số trung bình 25-40 25-50 10-30 cho các loại) Bã thô 33.4 30 18.9 1.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase 1.2.1. Hệ thống cellulase Cellnl ase Cellulose oligosaccharides, glucose OH Cellulose “ po Iyme r of jS-( 1 -A )-D- gIyoũ pyran osyl un its Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: endo-P-l,4-glucanase, exoglucanase và P-glucosidase. ❖ Endo-P-l,4-glucanase được gọi là endoglucanase hoặc 1,4-P- D-glucan- 4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4). ❖ Exoglucanase, gồm l,4-P-D-glucan-4-glucanohydrolase (giống như cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-P-D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91). ❖ p - glucosidase hoặc p - glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [28]. 1.2.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase Hình 1.2. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase Oellulase C C O < w/ Ĩ4 ỉttSi' là etîzytfte xúc tác chi? i/ííiĩ trinh chttyên /100 c'eỉ ti4lí>se tỉtcĩttỉ 1 cức c-eliotii-a- 03II ulose -tcrystefl) O H ❖ Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết a-1,4- glucoside trong cellulose, lignin và a- D glucan một cách ngẫu nhiên. Sản phẩm của quá trình phân giải là các cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose. ♦♦♦ Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose. ❖ Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetrose thành glucose [28]. 1.3. ứng dụng của cellulase 1.3.1. Cellula.se với công nghiệp thực phẩm Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi loại rau quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu của ngành trồng trọt và nông nghiệp. Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose. Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hoá, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hoá. Chế phẩm cellulase thường dùng để: Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc, tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật [31]. ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật. Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em và nói chung chất lượng thực phẩm được tăng lên. Một số nước đã dùng cellulase để xử lí các loại rau quả cải bắp, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn xử lí cả chè và các loại tảo biển, [25]. Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase thành tế bào của hạt đại mạch bị phá huỷ tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hoá. Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase đã làm tăng chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Đặc biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thuỷ phân, dùng làm thức ăn gia [...]... cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V 3.2.1 Ảnh hưởng của sự phổi trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V Do các loại phế phụ phẩm nông nghiệp có hàm lượng khoáng khác nhau và mỗi loại có những ưu điểm riêng như lõi ngô thì có độ xốp cao, vỏ lạc và vỏ trấu có mùi thơm Với những ưu điểm và sự khác nhau đó, để nâng cao chất lượng của nguồn... thường có nhiều chất xơ, thường bị bỏ hoặc có thể làm chất đốt [7], [8] Như vậy nếu sử dụng chủng nấm mốc M4V có thể nâng cao chất lượng của các phế phụ phẩm nông nghiệp đồng thời tận dụng được các phế phụ phẩm này để sản xuất enzyme sẽ nâng cao được giá Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp trị của các phế phụ phẩm nông nghiệp 3.2 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase. .. quả nghiên cứu ở hình và bảng 3.1 cho thấy, chủng nấm mốc M4V có khả năng sinh cellulase cao trên các phế phụ phẩm nông nghiệp Trong đó, vỏ trấu là cơ chất thích hợp để sinh cellulase từ chủng nấm mốc M4V Kết quả này cũng giống như các kết quả nghiên cứu trước đây, các chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase mạnh trong các môi trường có nguồn cacbon tự nhiên, các chất phế phụ phẩm mà chúng tôi sử dụng. .. chất phế phụ phẩm nông nghiệp, đây chính là nguồn nguyên liệu chứa cellulase rẻ tiền, dễ kiếm ở hầu hết các vùng nông thôn của Việt Nam 3.2.2 Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V Từ nghiên cứu về ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp chúng tôi đã tìm ra được tỉ lệ phối trộn thích hợp nhất cho sự sinh cellulase. .. thức ăn chăn nuôi cho gà, vịt, Như vậy, qua các kết quả phân tích ở trên đã chứng tỏ rằng, chúng ta hoàn toàn có thể nâng cao chất lượng của các phế phụ phẩm nông nghiệp thông qua việc sử dụng chủng nấm mốc M4Y bằng phương pháp lên men rắn Ngoài ra, kết quả này cũng mở ra khả năng ứng dụng to lớn của chủng nấm mốc M4V trong các lĩnh vực mà đặc biệt ở đây chúng ta nhấn mạnh đến lĩnh vực chăn nuôi mà... pepton 3.3 Nâng cao chất lượng phế phụ phẩm nông nghiệp thông qua sử dụng chủng nấm mốc M4Y để ứng dụng trong chăn nuôi 3.3.1 Kiểm tra hàm lượng đường tổng sổ của môi trường trước và sau khi lên men bằng chủng nấm mốc M4V Với một đất nước nông nghiệp như Việt Nam thì những sản phẩm như vỏ trấu, vỏ lạc và lõi ngô là những vật phẩm có khối lượng rất lớn nhưng lại không có giá trị cao đối với đời sống... bình của các kết quả của các lần thí nghiệm nhắc lại Kết quả trung bình cộng thu được có độ chính xác cao hơn Do đây là các thí nghiệm đơn nên không cần phương sai CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát khả năng sinh cellulase của chủng M4V trên các phế phụ phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 nông nghiệp Nguồn cacbon có ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối và sinh enzyme của nấm Nó có vai... cellulase của chủng M4V là 4 vỏ trấu : 4 vỏ lạc : 2 lõi ngô Để thu được lượng cellulase nhiều hơn và ổn định hơn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men của chủng M4V trên cơ chất vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô theo tỉ lệ 4: 4: 2 3.2.2.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase Thời gian lên men bề mặt của nấm mốc khoảng 36-60 giờ Tuỳ thu c vào đặc... Hoạt tính củatốt nghiệp ở nguồn nỉtơpepton và NaNOỉ Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận chủng M4V Ket quả cho thấy khả năng sinh cellulase của chủng M4V đã sử dụng đa dạng nguồn nitơ Nguồn nitơ vô cơ có các gốc nitrat NaNƠ3 có hoạt tính cellulase cao hơn so với NH4CI; (NEU^SCU Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu của Lương Đức Phẩm cho rằng nitrat là nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp... loài nấm của chi Aspergillus; Fusarium; Trỉchoderma [13] Trên các nguồn nitơ hữu cơ pepton cho hoạt tính cellulase cao hơn Tuy nhiên, trong quá trình sản xuất chế phẩm enzyme phục vụ cho chăn nuôi thì việc sử dụng nitơ hữu cơ với chi phí cao sẽ dẫn tới kém hiệu quả kinh tế, vì giá thành sản xuất chế phẩm cao Như vậy, có rất nhiều yểu tổ ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng nấm mốc M4V . chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu ceỉỉuỉase phục vụ chăn nuôi ” 2 . Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V trong. phân giải cellulose trên các phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi. 3 . Nội dung của đề tài 3.1. Tuyển chọn và nghiên cứu chủng nấm mốc M4V có khả năng sinh cellulase trên. luận Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Bước đầu nghiên cứu nâng cao