Luận văn Thạc sĩ khoa học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 1 Luận văn Thạc sĩ khoa học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420122 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn chính: TS. Nguyễn Huy Hoàng Người hướng dẫn phụ: PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội – Năm 2014 2 Luận văn Thạc sĩ khoa học MỤC LỤC 3 Luận văn Thạc sĩ khoa học LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân và sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Hoàng – Phó viện trưởng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện KH&CN Việt Nam, là người thầy_người anh đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn tới PGS. TS Nguyễn Thị Hồng Vân – cô giáo đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của các cán bộ Phòng Hệ gen học chức năng, viện Nghiên cứu hệ gen. Đặc biệt là Th.S. Nguyễn Thu Hiền đã giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và tiến hành thí nghiệm. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo nghiên cứu giảng dạy tại Khoa Sinh, Khoa đào tạo sau đại học – Trường Đại học KHTN đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm qua. Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ và những người thân trong gia đình lòng biết ơn sâu sắc, cảm ơn những người bạn đã chia sẻ khó khăn thử thách trong cuộc sống và công việc để em có được kết quả này. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 08 năm 2014 4 Luận văn Thạc sĩ khoa học BẢNG CHỮ VIẾT TẮT B.subtilis Bacillus subtilis bp Base pair (c DNA Deoxyribonucleic axcid E.coli Escherichia coli EtBr Dung d Ethidium Bromide IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Ker Keratinase LB Luria-Bertani µl Microlit PCR Polymerase Chain Reaction (Phvà B.sem nhis 168M chia Primer-F MPolymer Primer-R MMPolymer rARN Ribosomal ribonucleic acid VK Vi khul 5 Luận văn Thạc sĩ khoa học DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng Trang Bảng 1 Trình tư các cặp mồi 21 Bảng 2 Thành phần một phản ứng PCR 23 Bảng 3 Thành phần gel cô 5% và gel tách 10% polyacrymide 25 Bảng 4 Thành phần phản ứng cắt với enzyme XhoI và BamHI 26 Bảng 5 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR 1a 29 Bảng 6. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR 2 30 Bảng 7 Hoạt tính của keratinase từ các chủng nghiên cứu 48 6 Luận văn Thạc sĩ khoa học DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu Tên hình Trang Hình 1 Một số sản phẩm chứa keratin 3 Hình 2 Cấu trúc xoắn α và gấp nếp β của keratin 4 Hình 3 Cấu tạo phân tử của keratinase 6 Hình 4 Vi khuẩn E.coli 9 Hình 5 Vi khuẩn B. subtilis 10 Hình 6 Vector biểu hiện 19 Hình 7 Sơ đồ nghiên cứu biểu hiện gen Ker trong E.coli và B.subtilis 22 Hình 8 Sơ đồ tái tổ hợp gen Ker và promoter của gen α-amylase của chủng B. subtilis 168M bằng phương pháp Megarprimer 28 Hình 9 Ảnh điện di DNA tổng số 33 Hình 10 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Keratinase 34 Hình 11 Điện di sản phẩm cắt bằng 2 enzyme giới hạn XhoI và BamHI 36 Hình 12 Trình tự được đọc bằng mồi vector (T7 promoter và T7 terminator) 37 Hình 13 Cắt kiểm tra sản phẩm tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn 39 Hình 14 Điện di protein trên gel polyacrylamide –SDS ở nồng độ 12,5% 40 Hình 15 Điện di đồ sản phẩm PCR 42 Hình 16 Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra vector tách dòng bằng enzyme giới hạn 43 7 Luận văn Thạc sĩ khoa học Hình 17 Plasmid pHT43 mang tổ hợp [Bspr.Ker] được cắt kiểm tra bằng SmaI và KpnI 45 Hinh 18 Kết quả kiểm tra hoạt tính các tế bào B. subtilis 168M tái tổ hợp mang vector tái tổ hợp pHT43[Bspr.Ker] 46 Hình 19 Điện di dịch enzyme thô trên gel SDS-PGE 47 8 Luận văn Thạc sĩ khoa học MỞ ĐẦU Ngày nay, ngành công nghệ sinh học chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế nước ta. Trong đó, công nghệ DNA tái tổ hợp đang được chú trọng đầu tư và là công nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ sinh học. Công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời dựa trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép phân lập và khuếch đại một gen từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Việc nâng cao hoạt tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi. Trong đó có tạo dòng và sản xuất keratinase. Keratinase là enzyme có khả năng thủy phân các protein cứng, các cấu trúc phức tạp trong lông, tóc, móng, sừng Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng keratinase là thành viên của nhóm protease serine. Hiện nay, keratinase được thu từ nhiều nguồn khác nhau như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn. Trong nhóm vi khuẩn có khả năng sinh keratinase, hoạt tính keratinase cao đã được ghi nhận rộng rãi đối với các chủng từ Bacillus và Streptomyces. Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng keratinase được phân lập từ chủng B. licheniformis và B. subtilis là thành viên của nhóm protease serine [5]. Đây là nhóm enzyme thương mại, có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong các quá trình công nghệ sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin, các từ ngành công nghiệp gia cầm và công nghệ da Với sự bùng nổ của ngành công nghiệp gia cầm, hàng năm tồn đọng hàng tấn lông gà trong tự nhiên, điều này gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường. Trong khi đó, lông gà chiếm khoảng 90% là keratin [9], việc thủy phân keratin đem lại được những ứng dụng to lớn, có thể làm phân bón, keo, tạo ra các axit amin hiếm như serine, cystein và proline, đặc biệt là tạo ra thức ăn chăn nuôi [50]. Tuy nhiên, nếu xử lý lông vũ bằng các loại hóa chất như những phương pháp trước đây sẽ làm mất hàm lượng axit amin của thức ăn và rất tốn kém. Trong khi đó, nếu sử dụng 9 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học keratinase trong quá trình thủy phân lông vũ để sản xuất thức ăn chăn nuôi sẽ không làm mất hàm lượng dinh dưỡng của nó mà giá thành rẻ [38] và làm giảm ô nhiễm môi trường. Hiện nay, keratinase được thu từ nhiều nguồn khác nhau như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn. Trong đó, nhóm vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao, hoạt tính keratinase đã được ghi nhận rộng rãi đối với các chủng từ chi Bacillus và StreptomycesNhận thấy tầm quan trọng của keratinase trong các ngành công nghiệp nên keratinase đã được biết đế. Tuy nhiên, khả năng sinh tổng hợp keratinase từ các chủng hoang dại còn hạn chế, hoạt tính của enzyme thấp và thường lẫn tạp chất. Do đó Nhưng để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của keratinase trong ứng dụng công nghiệp thì trọng tâm là nâng cao trình độ sản xuất keratinase tái tổ hợp thông qua tách dòng. Mặt khác gen và biểu hiện gen. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tách dòng và hiện gen keratinase từ vi khuẩn Gram dương, xạ khuẩn hay nấm men trong hệ biểu hiện E.coli, B.subtilis hoặc P.pastoris để khám phá một hệ thống biểu hiện tốt hơn để sản xuất keratinase , gen từ vi khuẩn Bacillus licheniformis được thể hiện trong Escherichia coli , Bacillus subtilis , và Pichia pastoriỞ Việt Nam hiện nay việc nghiên cứu keratinase còn hạn chế, chưa có cơ sở nào sản xuất keraitnase ở quy mô công nghiệp. Vì vậy Do đó với mục đích tìm ra được chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sinh karatinase cao để có thể đưa vào sản xuất với qui mô lớn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hóa keratinase trong tế bào Escherichia coli và Bacillus”. • Mục tiêu đề tài Nghiên cứu Tạo tạo chủng tái vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sinh keratinase cao, nhanh và sạch nhằm ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp • Nội dung nghiên cứu 10 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 [...]... Bacillus sp DNd 1.2 Tách DNA tổng số Tách dòng gen kerE trong vector pJET1.2 dòng gen kerB trong vector pTZ57R/T Tách Chuyển gen KerE vào vector biểu hiện pET32a gen Ker vào vector biểu hiện pHT43 Chuyển Biểu hiện protein trong E.coli BL21 Biểu hiện protein trong B .subtilis 168M Thử hoạt tính của keratinase Hình7 Sơ đồ nghiên cứu biểu hiện gen Ker trong E.coli và B .subtilis 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số của... thống và chưa đưa vào ứng dụng trong thực tiễn Do đó để có thể đẩy mạnh hướng nghiên cứu sản xuất keratinase ở quy mô công nghiệp, đầu tiên chúng tôi sẽ tiến hành Tiếp nối các nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tàinhiệm vụ: Nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hóa keratinase trong tế bào E.coli và Bacillus Chúng tôi mong muốn sẽ lựa chọn được chủng tái tổ hợp có khả năng sinh Kkeratinase cao, góp phần vào... (Bacillus sp.) và xạ khuẩn (Nocardiopsis sp.) [3] hay phân lập gen và biểu hiện gen từ P.aeruginosa trong một hệ thống biểu hiện E coli [54] Gần đây nhất, một số nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành biểu hiện gen từ vi khuẩn Bacillus licheniformis trong hệ biểu hiện E coli, B subtilis và P pastoris để khám phá một hệ thống biểu hiện tốt hơn để sản xuất keratinase , gen từ vi khuẩn Bacillus licheniformis... hoá học vào đất và có khả năng tăng chất lượng cho sản phẩm Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã chỉ ra rằng phun qua lá tăng hiệu quả hơn bón qua gốc từ 8-10 lần Ngoài ra, do nhu cầu sử dụng keratinase ngày càng cao nên các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào phân lập gen và biểu hiện keratinase tái tổ hợp Một số nghiên cứu đã được phân lập và biểu hiện gen keratinase từ vi khuẩn Gram dương (Bacillus. ..Luận văn Thạc sĩ khoa học - Chọn dòng gen biểu hiện keratinase từ chủng vi khuẩn hoang dại - Thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli và B .subtilis - Biểu hiện gen mã hóa keratinase trong E.coli và B .subtilis - Đánh giá mức độ biểu hiện của chủng tái tổ hợp so với chủng hoang dại.Thử hoạt tính của keratinase tái tổ hợp 11 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận... vector được thiết kế với mục đích để chọn dòng và biểu hiện ở mức độ cao của các gen ngoại lai ở vi khuẩn E coli Vector pET32a (5.900 bp) thường được sử dụng với mục đích chính là biểu hiện gen (Hình 6) - Vector biểu hiện trong B .subtilis: Vector pHT43 thuộc hệ vector pHT mua của hãng Mobitec (CHLB Đức) được thiết kế chuyên để biểu hiện trong tế bào Bacillus subtilis (Hình 6) 29 Hoàng Thị Thu Hiền – Di... tạo bào tử và có khả năng chịu đựng trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt (Hình 5) Toàn bộ bộ gen của B subtilis đã được giải trình tự vào năm 1997 Tế bào vi khuẩn B subtilis chỉ có một phân tử DNA nằm trong một nhiễm sắc thể tròn Kích thước tổng thể của DNA là 4.214.814 cặp bp Khoảng 87% bộ gen (bao gồm 4.100 gen) mã hóa cho protein Trong 4.100 gen thì có 192 gen được cho là không thể thiếu và. .. nucleotid kéo dài trở thành một sợi trục Sau đó, tế bào hình thành một vách ngăn và bắt đầu phân chia thành hai phần Phần nhỏ hơn của tế bào được gọi là các tiền bào tử (forespore) và phần lớn hơn được gọi là tế bào mẹ Tế bào mẹ nuôi dưỡng tiền bào tử Khi hình thành vách ngăn, 30% số nhiễm sắc thể đã nằm bên trong tế bào mẹ, 70% nhiễm sắc thể còn lại chuyển vào tiền bào tử thông qua một loại protein vận chuyển... khuếch đại đoạn gen Ker được thiết kế dựa theo trình tự nucleotide từ đoạn gen keratin của chủng B subtillis đã được đăng kí trên ngân hàng cơ sở dữ liệu GenBank có gắn thêm trình tự enzyme giới hạn Để chọn một hệ thống biểu hiện tốt để sản xuất kKeratinase, chúng tôi sử dụng gen từ chủng Bacillus sp DNd 1.2 biểu hiện trong Escherichia coli và Bacillus subtilis Qui ước gen tương ứng là KerE và KerB 30 Hoàng... khuẩn E.coli Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn lựa chủng E coli BL21 (DE3) làm chủng chủ để biểu hiện Chủng biểu hiện E coli BL21 (DE3) là chủng đột biến, chứa đột biến Ion protease (một protease nội bào) và ompT protease (một protease ngoại bào) nên hạn chế khả năng thủy phân protein Ngoài ra trong hệ gen của chủng E coli BL21 (DE3) có chứa gen mã hóa T7 RNA polymerase, [18] đây là gen có nguồn . đưa vào sản xuất với qui mô lớn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hóa keratinase trong tế bào Escherichia coli và Bacillus . • Mục tiêu đề tài Nghiên cứu. hiện keratinase từ chủng vi khuẩn hoang dại - Thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli và B .subtilis. - Biểu hiện gen mã hóa keratinase trong E.coli và B .subtilis. - Đánh giá mức độ biểu. KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420122 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH