Đang tải... (xem toàn văn)
BÀI GIẢNG VỀ PCR,POLYMERASE CHAIN REACTION,NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG
Trao đổi trực tuyến tại: http://www.mientayvn.com/Y_online.html TS. BS Đỗ Thị Thanh Thủy PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG MỤC TIÊU BÀI GIẢNG 1. Trình bày được nguyên tắc PCR 2. Trình bày được cách chống ngoại nhiễm trong PCR 3. Trình bày được ứng dụng của PCR Kary Mullis mô tả 1983 (Cetus Corporation) 1985: Xuất hiện trên tạp chí “Science” Đạt Nobel Prize hóa học 1993 Polymerase Chain Reaction (PCR) là phản ứng khuếch đại một đoạn ADN bằng enzym polymerase, thực hiện trong ống nghiệm, có độ nhạy rất cao. PCR POLYMERASE CHAIN REACTION PCR POLYMERASE CHAIN REACTION PCR NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG 35-40 chu kì nhiệt Amplicon Số copies = 2 n .y n: Số cycle y: số copies ban đầu 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 Denaturation Annealing Extension Temperature (° C) Time (minutes) Lập lại ≥ 30 lần (chu kỳ) Biến tính 92-96 o C Bắt cặp 45-55 o C Kéo dài 72 o C PCR POLYMERASE CHAIN REACTION GĐ BIẾN TÍNH (92-96 o C) DNA đích 95 o C 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ GĐ BẮT CẶP (45-55 o C) ~55 o C 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ A B Primers A B GĐ KÉO DÀI (72 o C) 72 o C 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ Taq polymerase 72 o C 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ Cycle 1 [...]... PHẢN ỨNG PCR 4 dNTP (deoxy ribonucleotid): dATP, dGTP, dCTP, dTTP [C]: 20-200µM 5 Ion Mg++ - cofactor của enzyme MgCl2: 1.5 mM (0.75-4 mM) 6 Dung dịch đệm pH 8.3-8.8 THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR 1 Máy luân nhiệt (THERMOCYCLER) (I) Thổi liên tục những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát nhiệt vào buồng ủ, hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạnh (LightCycler – Roche) THỰC HIỆN PHẢN ỨNG. .. PCR Điện di trên gel agarose (submarine agarose gel electrophoresis) phân loại DNA dựa vào kích thước 1 Trong điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương, đoạn DNA có kích thước ngắn di chuyển nhanh hơn so với đoạn có kích thước lớn 2 Trong khi điện di, ethidium bromide sẽ đan xen vào cấu trúc sợi đôi DNA và làm sợi đôi DNA phát sáng khi quan sát dưới đèn UV Chuẩn bị gel agarose PHÁT HIỆN... sinh ra từ một đèn phát nhiệt vào buồng ủ, hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạnh (LightCycler – Roche) THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR (II) Dựa theo hiệu ứng Peltier ngược Hai thanh kim loại nối với hai cực của nguồn điện và được điều chỉnh tự động để chiều dòng điện đi qua có thể thay đổi: bên này nóng, bên kia lạnh Khi thay đổi chiều dòng điện thì nhiệt độ của hai thanh cũng thay đổi... NHIỆT Giai đoạn biến tính (92-96oC) Giai đoạn bắt cặp (45-55oC) Giai đoạn kéo dài (72oC) PCR POLYMERASE CHAIN REACTION ĐỘNG HỌC CỦA PCR THÀNH PHẦN TRONG PCR 5’ 3’ 3’ 5’ DNA đích A Nucleotide tự do B primers Taq DNA polymerase 2+ Mg2+ Mg Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ Dd đệm chứa magnesium NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR 1 DNA đích (đoạn DNA quan tâm) Từ máu, chất tiết (đàm, dịch màng phổi, dịch khớp…, tóc, phết niêm... pre-PCR và post-PCR tách biệt • Chiếu tia UV khu vực làm việc • Vệ sinh khu làm việc bằng isopropanol hay dd tẩy 10% 2 UDG (Uracyl DNAse Glycosylase) dUTP PCR MIX PCR mix chứa hệ thống chống ngoại nhiễm UDG (Uracyl DNAse Glycosylase) dUTP PCR MIX CHỐNG NGOẠI NHIỄM PCR luôn khởi đầu 40oC x 10min hệ thống chống ngoại nhiễm 40oC for 10min PCR mix chứa dUTP and UDG Amplicon chứa U PCR mix chứa dUTP và UDG... 5’-ATTCCGATCGCTAATCGATG-3’ 5’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC - TCCTGTGCA TTTCGCCACTAGAG-3’ 3’-TAAGGCTAGCGATTAGCTACCG - AGGACACGTAAAGCGGTGATCTC-5’ 3’-CACGTAAAGCGGTGATCTC-5’ Tm=9x2+10x4=58oC NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR 3 DNA polymerase: enzym chịu nhiệt, xúc tác tổng hợp sợi DNA mới, kỹ thuật đơn giản, đặc hiệu [C]: 1-2.5 units Nhiều loại men chịu nhiệt, tùy mục đích - Ly trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt: Thermus . (POLYMERASE CHAIN REACTION) NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG MỤC TIÊU BÀI GIẢNG 1. Trình bày được nguyên tắc PCR 2. Trình bày được cách chống ngoại nhiễm trong PCR 3. Trình bày được ứng dụng của. Polymerase Chain Reaction (PCR) là phản ứng khuếch đại một đoạn ADN bằng enzym polymerase, thực hiện trong ống nghiệm, có độ nhạy rất cao. PCR POLYMERASE CHAIN REACTION PCR POLYMERASE CHAIN. NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR 1. Máy luân nhiệt (THERMOCYCLER) (I) Thổi liên tục những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát nhiệt vào buồng ủ, hay luồng