BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN QUỐC ĐẢM NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME GELATINASE TỪ VI KHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ Nha Trang - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN QUỐC ĐẢM NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME GELATINASE TỪ VI KHUẨN Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60 54 10 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN MINH TRÍ TS. NGUYỄN ANH TUẤN Nha Trang – 2013 - i - LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Tác giả luận văn Trần Quốc Đảm - ii - LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận văn, trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm cùng toàn thể Thầy Cô Trường Đại học Nha Trang sự kính trọng, lòng biết ơn và niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được dành cho thầy: Nguyễn Minh Trí, thầy Nguyễn Anh Tuấn, cô Nguyễn Thị Thanh Hải - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận văn. Xin chân thành cảm ơn Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, toàn thể Thầy Cô, anh chị quản lý phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện nghiên cứu tại đây. Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Vũ Phương, Thầy Nguyễn Đình Khương, cô Đỗ Thị Ánh Hòa, chị Nguyễn Minh Nhật, chị Nguyễn thị Đoan Trang và anh Đỗ Xuân Lộc đã giúp đở tôi trong suốt quá trình làm Luận văn. Xin cảm ơn cha mẹ và các anh chị của tôi đã luôn ủng hộ tôi học tập và nghiên cứu nhiều năm qua. Cảm ơn toàn thể bạn bè đã luôn ở bên cạnh giúp đỡ tôi trong quá trình làm Luận văn. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận văn Trần Quốc Đảm - iii - DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu viết tắt Diễn giải B Bacillus sp species F Flavobacterium P Pseudomonas BA Blood agar BSA Bovine Serum Albumin TSA Tryptone Soya Agar C Chủng E Enzyme S Cơ chất P Sản phẩm thủy phân CPE Chế phẩm enzyme MC Mẫu đối chứng MT Môi trường DX8 Phần mềm Design-Expert 8 V Vận tốc phản ứng t o Nhiệt độ h Giờ ADN Acid Deoxyribo Nucleic ARN Axít ribonucleic mARN Messenger ARN rRNA Riboxom ARN GRAS Generally recognized as safe TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam - iv - MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG viii MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Gelatin 4 1.1.1. Khái quát về gelatin 4 1.1.2. Tính chất công nghệ của gelatin 7 1.2. Gelatin thủy phân 7 1.2.1. Khái quát về gelatin thủy phân 7 1.2.2. Ứng dụng của gelatin thủy phân 9 1.2.3. Một số nghiên cứu về gelatin thủy phân 11 1.2. Tổng quan về enzyme và tổng hợp enzyme từ vi sinh vật 12 1.2.1. Tổng quan về enzyme 12 1.2.2. Tổng hợp enzyme từ vi sinh vật 19 1.3. Enzyme protease và enzyme gelatinase 21 1.3.1. Enzyme protease 21 1.3.2. Enzyme gelatinase 23 1.4. Tổng quan về sự phân bố của vi sinh vật và các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật 28 1.4.1. Sự phân bố vi sinh vật trong tự nhiên 28 1.4.2. Dinh dưỡng của vi sinh vật 29 1.4.3. Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự sinh trường và phát triển của vi sinh vật 30 1.5. Vi khuẩn Bacillus subtilis 31 1.6. Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme từ vi sinh vật 32 - v - 1.6.1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên 33 1.6.2. Bảo quản giống 33 1.6.3. Nuôi cấy vi sinh vật để sinh enzyme 34 1.6.4. Thu hồi chế phẩm enzyme 36 Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1. Nguyên vật liệu 38 2.1.1. Mẫu phân lập vi khuẩn 38 2.1.2. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 38 2.1.3. Hóa chất 39 2.2. Phương pháp nghiên cứu 39 2.3. Bố trí thí nghiệm 40 2.3.1. Bố trí thí nghiệm phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase cao 41 2.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định một số tính chất của enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn 43 2.3.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng tuyển chọn 47 2.3.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát mức độ, chiều hướng ảnh hưởng và sự tương tác của các yếu tố nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp gelatinase của chủng tuyển chọn 54 2.3.5. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi sinh gelatinase từ chủng tuyển chọn 54 2.3.6. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện kết tủa thích hợp để thu nhận chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn 55 2.3.7. Bố trí thì nghiệm áp dụng thủy phân gelatin bằng chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn 57 2.4. Phương pháp phân tích 59 2.4.1. Xác định hoạt độ gelatinase 59 2.4.2. Định lượng nitơ amin, nitơ amoniac và nitơ tổng số 59 2.5. Phương pháp xử lý số liêu 60 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 61 - vi - 3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase cao .61 3.1.1. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase 61 3.1.2. Kết quả kiểm khả năng sinh gelatinase của các chủng vi khuẩn phân lập được 62 3.1.3. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase cao nhất từ các chủng phân lập và tuyển chọn được 62 3.1.4. Kết quả định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn 63 3.2. Kết quả xác định một số tính chất của enzyme gelatinase từ chủng Bacillus sp… 66 3.2.1. Kết quả xác định cơ chất đặc hiệu của chế phẩm gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 66 3.2.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 67 3.2.3. Kết quả xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 68 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 69 3.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 69 3.3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 70 3.3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng gelatin trong môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp 72 3.3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 73 3.3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 74 3.4. Kết quả khảo sát mức độ và chiều hướng ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 75 3.5. Kết quả tối ưu hóa điều kiên nuôi sinh gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 77 3.6. Kết quả xác định ảnh hưởng của điều kiện kết tủa đến hoạt tính của chế phẩm gelatinae từ chủng Bacillus sp. C7 84 - vii - 3.6.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của tác nhân và nồng độ kết tủa đến hoạt tính của chế phẩm gelatinae từ chủng Bacillus sp. C7 84 3.6.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt tính của chế phẩm gelatinae từ chủng Bacillus sp. C7 85 3.7. Kết quả áp dụng thủy phân gelatin 1% bằng chế phẩm gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 86 3.7.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của tỷ lệ giữa chế phẩm gelatinase với cơ chất gelatin 1% (E/S) đến tốc độ phản ứng 86 3.7.2. Kết quả xác định thời gian và mức độ thủy phân gelatin 1% của gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 87 3.8. Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm gelatinase kỹ thuật từ chủng Bacillus sp. C7 tuyển chọn phân lập được 88 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 91 - viii - DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gelatin 5 Bảng 1.2. Thành phần acid amin của gelatin và collagen trên 1000g nguyên liệu 5 Bảng 1.3. Thành phần acid amin của gelatin trên 1000g nguyên liệu 6 Bảng 1.4. Một số tính chất của gelatin 7 Bảng 1.5. Ứng dụng chủ yếu của gelatin thủy phân 10 Bảng 1.6. Khả năng sinh gelatinase của một số chủng vi khuẩn Bacillus sp. C7 24 Bảng 1.7. Ảnh hưởng của muối canxi và magie đến số lượng vi sinh vật, pH và khả năng sinh gelatinase từ Proteus trong môi trường lactate 27 Bảng 1.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự phát triển và sự thủy phân gelatin của các chủng vi khuẩn của các loài F. meningosepticum, P. aeruginosa, P. diminuta, P. fluorescens trong môi trường gelatin-agar 28 Bảng 1.9. Nhu cầu khoáng đối với một số vi sinh vật 36 Bảng 3.1. Số chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu 61 Bảng 3.2. Mô tả hình thái khuẩn lạc các chủng phân lập được 61 Bảng 3.3. Kết quả đo đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn trên thạch gelatin-agar sau 72 giờ nuôi cấy 95 Bảng 3.4. Bảng phân tích BLAST đoạn gen giải trình tự của chủng C7 65 Bảng 3.5. Kết quả thí nghiệm xác định cơ chất đặc trưng của CPE gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 96 Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 96 Bảng 3.7. Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 96 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 98 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 97 [...]... gelatinase từ vi khuẩn tuyển chọn phân lập được - Nội dung nghiên cứu: + Phân lập và tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp gelatinase cao tử vi khuẩn trong tự nhiên + Nghiên cứu một số đặc tính của enzyme gelatinase từ vi khuẩn tuyển chọn phân lập được + Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi sinh gelatinase từ vi khuẩn tuyển chọn phân lập được + Nghiên cứu thu nhận chế phẩm gelatinase kỹ thu t từ vi khuẩn. .. nguồn tài liệu khoa học về lĩnh vực nghiên cứu thu nhận enzyme từ vi khuẩn nói chung và enzyme gelatinase từ vi khuẩn nói riêng, phục vụ trong giảng dạy và nghiên cứu + Làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về tinh chế enzyme gelatinase và các nghiên cứu ứng dụng enzyme này vào đời sống sản xuất - Ý nghĩa thực tiễn: + Sự thành công của đề tài sẽ cung cấp chế phẩm enzyme gelatinase ứng dụng thủy phân gelatin... chủng vi sinh vật vào sản xuất ngành công nghệ thực phẩm [25, 31] Như vậy, đề tài Nghiên cứu thu nhận enzyme gelatinase từ vi khuẩn là cần thiết, bước đầu có thể ứng dụng enzyme này để thủy phân gelatin ứng dụng trong đời sống sản xuất - Mục tiêu nghiên cứu: + Phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gelatinase cao từ tự nhiên + Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme gelatinase. .. Vi c nghiên cứu và ứng dụng enzyme có nghĩa to lớn về mặt lý thuyết cũng như về thực tế áp dụng [1] Gelatinase là một proteolytic enzyme, có thể thủy phân gelatin thành các peptide và các acid amin Chúng ta có thể thu nhận gelatinase từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó thu nhận gelatinase từ vi sinh vật thì được chú ý hơn Trong tự nhiên có nhiều vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gelatin [2, 22, 28] Vi c... chủng vi khuẩn sinh gelatinase cao nhất từ các chủng vi khuẩn phân lập 43 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát nghiên cứu một số tính chất của enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn 44 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định cơ chất đặc hiệu của enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn 44 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme gelatinase. .. nhận nhiều enzyme khác nhau như từ dạ dày có thể thu được pepsin, từ tụy tạng thu được trypsin, chymotrypsin - Từ vi sinh vật: đây là đối tượng thích hợp nhất để sản xuất enzyme Sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme có những ưu điểm sau: Có thể chủ động quá trình sản xuất Chu kỳ sinh trưởng phát triển của vi sinh vật ngắn do đó có thể sản xuất enzyme từ vi sinh vật trong một thời gian ngắn từ 36 giờ... hướng vi c tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo hướng sản xuất chọn lọc với lượng lớn Giá thành các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật thấp hơn so với các chế phẩm enzyme từ các nguồn khác vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật t ương đối đơn giản, rẻ tiền 1.2.2 Tổng hợp enzyme từ vi sinh vật [1, 3] Trong tế bào vi sinh vật thường xuyên xảy ra quá trình sinh tổng hợp enzyme Đến nay, người ta đã biết các enzyme. .. không gian phân tử gelatinase 24 Hình 1.10 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh gelatinase của Proteus 26 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát nghiên cứu thu nhận gelatinase từ vi khuẩn tự nhiên 40 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase 41 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập chủng có khả năng sinh gelatinase 42 Hình... nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng tuyển chọn 50 Hình 2.12 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng trong môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn 51 Hình 2.13 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng vi khuẩn tuyển... xuất enzyme Enzyme có trong mọi tế bào của động vật, thực vật và vi sinh vật Do vậy người ta có thể thu nhận enzyme từ các nguồn này để sử dụng trong công nghiệp Một số nguyên liệu dùng làm nguồn nguyên liệu để tách chiết enzyme là: - Từ thực vật: nhựa đu đủ tách papain, hạt đậu tương tách urease, thân và quả dứa tách bromelin - Từ động vật: từ một số mô và cơ quan động vật người ta có thể thu nhận . vực nghiên cứu thu nhận enzyme từ vi khuẩn nói chung và enzyme gelatinase từ vi khuẩn nói riêng, phục vụ trong giảng dạy và nghiên cứu. + Làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về tinh chế enzyme. gelatinase cao tử vi khuẩn trong tự nhiên. + Nghiên cứu một số đặc tính của enzyme gelatinase từ vi khuẩn tuyển chọn phân lập được. + Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi sinh gelatinase từ vi. chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gelatinase cao từ tự nhiên. + Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme gelatinase từ vi khuẩn tuyển chọn phân lập được. - Nội dung nghiên cứu: +