Đang tải... (xem toàn văn)
MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục bảng biểu vii Danh mục các hình viii Danh mục các biểu ñồ ix Tóm tắt x 1. MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích, yêu cầu của ñề tài. 3 1.2.1 Mục ñích. 3 1.2.2 Yêu cầu. 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Vài nét chung về chi Nghệ (Curcuma) 1,2,3,4 4 2.1.1. Curcuma longa Linn ( C.domestica Val) 4 2.1.2. Curcuma zedoaria (Berg) Roscoe. 5 2.1.3. Curcuma aromatica Salisb. 5 2.1.4. Curcuma xanthorrhiza Roxb. 5 2.1.5. Curcuma alismatifolia Gagnep. 5 2.1.6. Curcuma angustifolia Roxb. 6 2.1.7. Curcuma aeruginosa Roxb. 6 2.1.8. Curcuma thorrelii Gagnep. 6 2.1.9. Curcuma pierreane Gagnep. 6 2.1.10. Curcuma cochinchinessis Gagnep. 6 2.1.11. Curcuma Gracillima Gagnep. 6 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 2.2. Khái quát về cây Nghệ vàng (Curcuma longa L) 1,2,3,4 6 2.2.1. ðặc ñiểm thực vật. 6 2.2.2. Nguồn gốc phân bố, sinh thái. 7 2.3. Thành phần hóa học của cây Nghệ vàng. 8 2.4. Công dụng và hoạt tính sinh học chính từ cây Nghệ vàng 11 2.4.1. Tác dụng dược lý của cây Nghệ 11 2.4.2. Hoạt tính sinh học của Curcumin và tinh dầu Nghệ. 15 2.5. Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật. 22 2.5.1. Tính toàn năng của tế bào 22 2.5.2. Sự phân hóa và phản phân hóa 22 2.5.3. Nuôi cấy tế bào thực vật, các hợp chất tự nhiên và ứng dụng trong công nghiệp. 49 23 2.5.3.1. Nuôi cấy tế bào thực vật. 24 2.5.3.2 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật. 25 2.5.3.3. Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học. 27 2.5.4. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây nghệ 32 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 34 3.1. Vật liệu: 34 3.2. Nội dung nghiên cứu: 34 3.2.1. Nội dung 1: Thí nghiệm về khử trùng mẫu: 34 3.2.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường ñến sự phát sinh callus 35 3.2.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ñến sự phát sinh Callus. 36 3.2.5. Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu mô nuôi cấy ñến sự hình thành Callus. 36 3.2.6. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy mô cây Nghệ tạo callus. 36 3.2.7. ðịnh lượng hàm lượng Curcumin trong củ Nghệ ngoài tự nhiên và callus 37 3.3. Phương pháp nghiên cứu: 37 3.3.1. Chuẩn bị mẫu. 37 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi 37 3.3.3. ðịnh lượng hàm lượng Curcumin trong Callus. 37 3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu thống kê 38 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng ñến khả năng tạo callus 39 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường ñến sự phát sinh callus 44 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ñến sự phát sinh callus. 46 4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ñến sự phát sinh callus 49 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu nuôi cấy tới sự phát sinh callus 51 4.6. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy mô cây Nghệ tạo callus 53 4.7. Phân tích hàm lượng Curcumin 54 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 56 5.1. Kết luận 56 5.2. ðề nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI LƯƠNG ðỨC BẰNG “BƯỚC ðẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRO CÂY NGHỆ VÀNG (Curcuma longa L) PHỤC VỤ CHIẾT XUẤT CURCUMIN” LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành : 60.42.80 Người hướng dẫn khoa học : TS. NGUYỄN ðỨC BÁCH HÀ NỘI - 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 22 tháng 10 năm 2012 Học viên Lương ðức Bằng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN Luận văn này được hoàn thành tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng – Khoa Công ngệ sinh học – Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đức Bách đã tin tưởng, giao đề tài, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian từ lúc tôi làm khóa luận đến khi tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Phan Hữu Tôn đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi, trong quá trình tôi làm việc tại bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ, các bạn học viên trong bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này. Hà Nội, ngày 22 tháng 10 năm 2012 Học viên Lương ðức Bằng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục bảng biểu vii Danh mục các hình viii Danh mục các biểu đồ ix Tóm tắt x 1. MỞ ðẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích, yêu cầu của đề tài. 3 1.2.1 Mục đích. 3 1.2.2 Yêu cầu. 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Vài nét chung về chi Nghệ (Curcuma) [1,2,3,4] 4 2.1.1. Curcuma longa Linn ( C.domestica Val) 4 2.1.2. Curcuma zedoaria (Berg) Roscoe. 5 2.1.3. Curcuma aromatica Salisb. 5 2.1.4. Curcuma xanthorrhiza Roxb. 5 2.1.5. Curcuma alismatifolia Gagnep. 5 2.1.6. Curcuma angustifolia Roxb. 6 2.1.7. Curcuma aeruginosa Roxb. 6 2.1.8. Curcuma thorrelii Gagnep. 6 2.1.9. Curcuma pierreane Gagnep. 6 2.1.10. Curcuma cochinchinessis Gagnep. 6 2.1.11. Curcuma Gracillima Gagnep. 6 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 2.2. Khái quát về cây Nghệ vàng (Curcuma longa L) [1,2,3,4] 6 2.2.1. Đặc điểm thực vật. 6 2.2.2. Nguồn gốc phân bố, sinh thái. 7 2.3. Thành phần hóa học của cây Nghệ vàng. 8 2.4. Công dụng và hoạt tính sinh học chính từ cây Nghệ vàng 11 2.4.1. Tác dụng dược lý của cây Nghệ 11 2.4.2. Hoạt tính sinh học của Curcumin và tinh dầu Nghệ. 15 2.5. Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật. 22 2.5.1. Tính toàn năng của tế bào 22 2.5.2. Sự phân hóa và phản phân hóa 22 2.5.3. Nuôi cấy tế bào thực vật, các hợp chất tự nhiên và ứng dụng trong công nghiệp. [49] 23 2.5.3.1. Nuôi cấy tế bào thực vật. 24 2.5.3.2 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật. 25 2.5.3.3. Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học. 27 2.5.4. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây nghệ 32 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 34 3.1. Vật liệu: 34 3.2. Nội dung nghiên cứu: 34 3.2.1. Nội dung 1: Thí nghiệm về khử trùng mẫu: 34 3.2.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến sự phát sinh callus 35 3.2.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến sự phát sinh Callus. 36 3.2.5. Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu mô nuôi cấy đến sự hình thành Callus. 36 3.2.6. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy mô cây Nghệ tạo callus. 36 3.2.7. Định lượng hàm lượng Curcumin trong củ Nghệ ngoài tự nhiên và callus 37 3.3. Phương pháp nghiên cứu: 37 3.3.1. Chuẩn bị mẫu. 37 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi 37 3.3.3. Định lượng hàm lượng Curcumin trong Callus. 37 3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu thống kê 38 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng đến khả năng tạo callus 39 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến sự phát sinh callus 44 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh callus. 46 4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến sự phát sinh callus 49 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu nuôi cấy tới sự phát sinh callus 51 4.6. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy mô cây Nghệ tạo callus 53 4.7. Phân tích hàm lượng Curcumin 54 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 56 5.1. Kết luận 56 5.2. Đề nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4D : 2,4 Dichlorophenoxy acetic acid BAP : 6- Benzylaminopurine NAA : Naphthalene acetic acid CT : Công thức Nlai : Nhắc lại MT : Môi trường. MS : Murashige and Skoog. CV : Coefficient of variation-hệ số biến động LSD : Least Significant Difference Test So sánh theo sai khác nhỏ nhất. ROS : Reactive oxygen species HSP : Heat shock proteins GSTP1-1 : Glutathione S-transferse P1-1 TRAIL : TNF-related apoptosis-inducing ligand Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang 3.1a. Công thức ảnh hưởng của sự phối hợp thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl 2 0,1% và dung dịch Johnson 10% đến sự sống và khả năng hình thành callus của củ Nghệ. 34 3.1b. Công thức ảnh hưởng của sự phối hợp thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl 2 0,1% và dung dịch Johnson 10% đến sự sống và khả năng hình thành callus của củ Nghệ 35 3.2. Công thức ảnh hưởng của môi trường đến sự phát sinh callus 35 3.3. Công thức ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh callus 36 3.4. Công thức ảnh hưởng của NAA đến sự phát sinh callus 36 4.1a. Ảnh hưởng sự phối hợp thời gian khử trùng của HgCl 2 và Johnson đến sự sống và khả năng tạo callus của củ Nghệ. 41 4.1b. Ảnh hưởng sự phối hợp thời gian khử trùng của HgCl 2 và Johnson đến sự sống và khả năng tạo callus của củ Nghệ 42 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến sự phát sinh callus sau 1 tháng nuôi cấy 44 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh callus của củ Nghệ sau 1 tháng. 47 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến sự phát sinh callus 49 4.5. Kết quả ảnh hưởng của kiểu mô đến sự hình thành callus 51 4.6. Bước đầu thử nghiệm nuôi cấy mô cây nghệ tạo callus 53 4.7. Hàm lượng Curcumin trong callus và trong Nghệ tự nhiên 55 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Ảnh hưởng của Curcumin trên các bệnh khác nhau 16 2.2. Curcumin và hệ thống Apoptosis 19 2.3. Hệ thống nuôi cấy thủy canh 33 4.1. Sự hình thành callus và callus CT xử lý HgCl 2 0,1% trong 10 phút và Johnson 10% trong 10 phút 40 4.2. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng hình thành callus sau 1 tháng nuôi cấy. 46 4.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng hình thành callus sau 1 tháng nuôi cấy. (từ trái qua phải, CT1, CT2, CT3, CT4, CT5) 48 4.4. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành callus sau 1 tháng nuôi cấy. (từ trái qua phải CT1, CT2, CT3, CT4, CT5) 50 4.5. Ảnh hưởng của kiểu mô đến khả năng hình thành callus sau 1 tháng nuôi cấy. (từ trái qua phải mô non, mô bánh tẻ, mô già) 52 4.6. Quy trình nuôi cấy mô cây Nghệ tạo callus 54 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ix DANH MỤC CÁC BIỂU ðỒ STT Tên biểu ñồ Trang 4.1a. Ảnh hưởng sự phối hợp thời gian khử trùng của HgCl 2 và dung dịch Johnson đến sự sống và khả năng tạo callus của của củ Nghệ 43 4.1b. Ảnh hưởng sự phối hợp thời gian khử trùng của HgCl 2 và dung dịch Johnson đến sự sống và khả năng tạo callus của của củ Nghệ 43 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến sự phát sinh callus sau 1 tháng nuôi cấy 45 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh callus của củ Nghệ sau 1 tháng. 47 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến sự phát sinh callus 50 4.5. Kết quả ảnh hưởng của kiểu mô đến sự hình thành callus 52 [...]... nh hàm lư ng Curcumin trong nuôi c y in vitro theo phương pháp này cao g p 2,7 l n so v i cây ngoài t nhiên [28] Th c t trong s n xu t Curcumin thương ph m ngư i ta ch tách chi t t c Ngh vàng vì hàm lư ng Curcumin trong c Ngh vàng cao g p r t nhi u l n cây Ngh ñen Do v y vi c: “Bư c ñ u xây d ng quy trình nuôi c y in vitro cây Ngh vàng (Curcuma longa L) ph c v chi t xu t Curcumin là m t hư ng nghiên... kh thi, n u thành công có th s góp ph n xây d ng m t nhà máy s n xu t Curcumin t cây Ngh vàng t i Vi t Nam 1.2 M c ñích, yêu c u c a ñ tài 1.2.1 M c ñích Nghiên c u xây d ng ñư c quy trình k thu t nuôi c y in vitro cây Ngh vàng t o Callus và cho hàm lư ng Curcumin trong Callus 1.2.2 Yêu c u Xác ñ nh ñư c các y u t nh hư ng ñ n s hình thành callus và hàm lư ng Curcumin trong callus: - Xác ñ nh ñư c phương... y Cây m c hoang vùng Bà R a G n ñây th y Cao B ng 2.1.11 Curcuma Gracillima Gagnep Tên Vi t Nam: Ngh m nh Cây m c hoang t nh mi n Trung 2.2 Khái quát v cây Ngh vàng (Curcuma longa L) [1,2,3,4] 2.2.1 ð c ñi m th c v t Ngh vàng (Curcuma longa L) thu c h G ng (Zingiberaceae) Chúng có ñ c ñi m sau: Cây th o, cao 0.6 – 1 m Thân r thành c hình tr ho c hơi d t, khi b ho c c t ngang có màu vàng s m ñ n vàng. .. Curcumin (bisferuloyl methan), bis 4 hydroxycinnamoyl)- methan và 4-hydroxycinnamoyl feruloyl methan Th c ra, Curcumin là m t h n h p 3 th : Curcumin chính th c ( g i là Curcumin I) chi m t l kho ng 70%, Curcumin II là monodesmetoxy Curcumin chi m kho ng 20% và Curcumin III là bidesmetorycurcumin chi m kho ng 10% Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 9 Curcumin. .. chúng tôi quy trình nuôi c y in vitro cây Ngh vàng s d ng mô bánh t ñ nuôi c y v i công th c kh trùng là HgCl2 0,1% trong 10 phút k t h p v i dung d ch Johnson 10% trong 10 phút sau ñó nuôi c y trên môi trư ng: MS ñ y ñ b sung Saccharose 2 % , Agar 0,8 % , 2,4-D 3 mg/l, BAP 0,4 mg/l, NAA 2 mg/l, pH môi trư ng ~ 5,8 Sau m t tháng nuôi c y t l callus cao nh t ñ t 72% Khi phân tích hàm lư ng Curcumin trong... trong quá trình v n chuy n và b o qu n M t s s n ph m trao ñ i ch t ñư c s n xu t t nuôi c y d ch huy n phù có ch t lư ng cao hơn trong cây hoàn ch nh Do v y vi c nghiên c u nuôi c y in vitro cây Ngh vàng ñ thu các ho t ch t th c p cũng c n ñư c quan tâm nghiên c u ñ ph n nào ñó ch ñ ng ñư c nguyên li u cho ngành chi t xu t dư c li u Hơn n a k t qu nghiên c u cho r ng m t s nuôi c y in vitro (nuôi d ch... công trình nào ñi sâu nghiên c u kh o sát hàm lư ng Curcumin trong s n ph m callus t o thành và nh hư ng c a các y u t nuôi c y in vitro ñ n hàm lư ng và ch t lư ng Curcumin G n ñây nư c ta các tác gi Nguy n Hoàng L c, Võ Châu Tu n ñã nuôi c y thành công t bào d ch huy n phù Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 2 cây Ngh ñen và xác ñ nh hàm lư ng Curcumin. .. h p các s n ph m ñ c bi t có n ng ñ cao hơn so v i cây mà t ñó chúng b t ngu n Ch ng h n: Schulte và c ng s (1987) ñã thông báo s t o thành các Anthraquinone trong các nuôi c y t bào (ñư c t i ưu các ñi u ki n) ñã vư t tr i các cây sinh trư ng ngoài t nhiên Hi n nay trên th gi i ñã có nhi u công trình nghiên c u nuôi c y in vitro theo hư ng tái sinh cây như tác gi : S.Prathanturarug, N.soonthornchareonnon,... ñ tách r i c a t bào trong nuôi c y ph thu c vào ñ c tính c a các kh i t bào x p và có th ñi u ch nh b ng cách thay ñ i thành ph n môi trư ng (Misawa, 1994) Bên c nh nuôi c y t bào huy n phù, nuôi c y callus (trên môi trư ng r n) có ưu ñi m là thao tác thí nghi m ñơn gi n, d v n chuy n m u nhưng như c ñi m là th tích nuôi c y bé nên khó phát tri n quy mô công nghi p, m u nuôi c y ch ti p xúc ñư c m... và thu ho ch vào tháng 1 dương l ch năm sau khi cây tàn l i Sau khi thu ho ch ngư i ta ch n c to kh e ñ làm gi ng cho v sau Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 1 M c dù Ngh vàng b n ch t là cây hoang d i nên tr ng r t ñơn gi n, không b sâu h i như các cây tr ng khác Tuy nhiên năng xu t và ch t lư ng Ngh vàng ph thu c nhi u vào ñi u ki n t nhiên, k thu . BẰNG “BƯỚC ðẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRO CÂY NGHỆ VÀNG (Curcuma longa L) PHỤC VỤ CHIẾT XUẤT CURCUMIN LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH. Bước ñầu xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro cây Nghệ vàng (Curcuma longa L) phục vụ chiết xuất Curcumin là một hướng nghiên cứu có nhiều khả thi, nếu thành công có thể sẽ góp phần xây dựng. nhà máy sản xuất Curcumin từ cây Nghệ vàng tại Việt Nam. 1.2 Mục ñích, yêu cầu của ñề tài. 1.2.1 Mục ñích. Nghiên cứu xây dựng được quy trình kỹ thuật nuôi cấy in vitro cây Nghệ vàng tạo Callus