1 I. MỞ ĐẦU Đậu tương (Glycine max (L.) Merr) là cây trồng quan trọng trên thế giới có giá trị sử dụng toàn diện do hàm lượng protein cao nhất trong các loại hạt thực vật (38-47%), lipid (12,5- 25,0%), glucid (10-15%). Đây là nguồn cung cấp protein và dầu thực vật chủ lực cho toàn thế giới. Hạt đậu tương chứa gần như đầy đủ các axit amin cơ bản như isoleucin, leucin, methyonin, phenylalanin, tryptophan, valin. Mặc dù đã bắt đầu tiến hành sản xuất trên quy mô công nghiệp từ năm 2011 nhưng Việt Nam vẫn tiếp tục phải nhập khẩu phần lớn lượng bột đậu tương. Năm 2013, Việt Nam đã nhập khẩu khoảng 2,97 triệu tấn khô đậu tương. Trước tình hình đó Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đặt ra yêu cầu tăng năng suất và diện tích trồng đậu tương trên cả nước. Ngày nay, công nghệ gen sử dụng các phương pháp hiện đại đã khắc phục được rất nhiều hạn chế của phương pháp chọn giống truyền thống. Công nghệ gen cho phép các nhà di truyền và chọn giống thực vật xác định, thiết kế các gen đặc hiệu cho các mục tiêu mong muốn rồi chuyển các gen này vào các giống đang sử dụng nhằm tăng tính chống chịu, tăng năng suất chất lượng cây trồng. Có nhiều phương pháp chuyển gen được sử dụng đã thành công trong đó phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới cũng như ở Việt Nam sử dụng nhiều nhất. Với ưu điểm là tần số biến nạp khá cao, các cây chuyển gen thu được tương đối dễ và ít tốn kém, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens đã đạt được kết quả trên nhiều đối tượng như thuốc lá, hoa cúc, đậu xanh, lúa và nhiều giống cây trồng khác. Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate vào cây đậu tương nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens’’. CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về đậu tƣơng 1.1.1. Nguồn gốc 2 Dựa vào sự đa dạng về hình thái, Fukuda (1993) và về sau nhiều nhà khoa học khác đã thống nhất rằng, đậu tương có nguồn gốc từ Mãn Châu (Trung Quốc). Từ Trung Quốc, đậu tương đã lan truyền đi khắp thế giới. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản, vào khoảng 200 năm trước công nguyên, đậu tương đã được đưa vào Triều Tiên và sau đó được chuyển sang Nhật. Đến giữa thế kỷ 17, đậu tương mới được nhà thực vật người Đức Engelbert Caemfer đưa về Châu Âu và đến năm 1954 mới du nhập vào Mỹ. Một số tài liệu cho rằng cây đậu tương được đưa vào trồng ở nước ta từ thời vua Hùng, cây đậu tương được trồng trước cây đậu xanh và cây đậu đen. 1.1.2. Phân loại Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merr. Theo khóa phân loại của Hymowitz T., C.A. Newell và căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể, cây đậu tương thuộc bộ đậu (Fabales), họ đậu (Fabaceae), phân họ Leguminosae, chi Glycine. Đậu tương trồng có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40 là loại cây trồng mang lại giá trị kinh tế cũng như giá trị dinh dưỡng cao. 1.1.3. Vai trò của đậu tương Cây đậu tương mang lại những giá trị rất toàn diện. Theo thống kê, trên toàn thế giới có khoảng 1,2 vạn sản phẩm làm từ đậu tương. Các sản phẩm được tiêu thụ trên thị trường gồm bột đậu nành đóng gói, đậu phụ, sữa đậu nành, sữa chua đậu nành,… Trong công nghiệp, đậu tương được sử dụng để chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu. Đậu tương là cây có khả năng cố định đạm nên được sử dụng làm cây luân canh cải tạo đất trong hệ thống nông nghiệp. Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng nitơ trong thân chiếm 0,05%, trong lá chiếm 0,19%. Ngoài ra đậu tương còn là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, 1kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Các bộ phận của cây đậu tương (thân, lá, rễ, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc. 1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen thực vật 1.2.1. Khái quát chung về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh sống trong đất, có khả năng xâm nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thương của cây chủ. Trong tự nhiên, 3 Agrobacterium tumefaciens chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc biệt là nhóm thực vật có hoa. Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối u do Agrobacterium tumefaciens sinh ra phát triển mạnh ngay trong điều kiện thiếu hoocmon sinh trưởng (auxin và cytokinin). Đó là do Agrobacterium tumefaciens đã chuyển một đoạn T-DNA (transfer DNA) sang tế bào thực vật và T-DNA điều khiển quá trình sinh tổng hợp các chất đó. Ngoài ra, các khối u cũng sinh tổng hợp các opine là các axit amin, đặc biệt là các dẫn xuất của đường. Opine được vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt động của gen chuyển hóa opine trên plasmid gây khối u thực vật. Dạng opine được tổng hợp có thể là nopanin, octopin, agrocinopin, mannozapin và agropin, phụ thuộc vào từng chủng Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, octopin và nopalin là hai dạng opine phổ biến. 1.2.2. Ti-plasmid Ti-plasmid là một phân tử DNA mạch vòng, kích thước khoảng 200kb, phân tử lượng của nó sấp xỉ 1,2.10 8 . Trong tế bào thực vật chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập. Ti- plasmid ở các chủng Agrobacterium khác nhau đều có bốn vùng tương đồng: vùng có liên quan đến sự tái bản, vùng liên quan đến sự tiếp hợp, vùng gây độc hay còn gọi là vùng vir (virulent region), vùng T-DNA. Quá trình gây tạo khối u có liên quan trực tiếp đến vùng T-DNA và vùng vir. Vùng T-DNA Vùng T-DNA là vùng được chuyển vào tế bào thực vật và gây nên các khối u thực vật. Có hai hệ gen tồn tại trên T-DNA: - Hệ gen thứ nhất quy định quá trình sinh tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Khi các gen này hoạt động sẽ dẫn đến sự phân chia các tế bào một cách liên tục gây ra khối u. - Hệ gen thứ hai quy định lên quá trình sinh tổng hợp các opine. Đây là các axit amin lạ có nguồn gốc từ arginine và không bao giờ xuất hiện trong tế bào bình thường. T-DNA được giới hạn bởi hai bờ phải (right border) và bờ trái (left border). Hai bờ có cấu trúc lặp lại gồm 24 cặp bazơ nitơ chỉ những đoạn DNA nằm giữa hai bờ được chuyển vào tế bào thực vật. Bờ phải và bờ trái là những yếu tố cần thiết cho sự chuyển DNA. Tuy nhiên, quá trình chuyển T-DNA lại do vùng gây độc quy định. Vùng gen vir 4 Vùng vir dài 35kb mang các gen gây độc. Vùng này bao gồm gen virA, virB, virC, virD, virE, virG (một số chủng còn có virF). Trong đó gen virA, virB, virD, virG cần thiết cho tạo độc tính. Hoạt động của gen vir giúp T-DNA này tách ra khỏi vi khuẩn, xâm nhập vào tế bào thực vật. Sự biểu hiện của các gen vùng vir là một quá trình sinh hoá phức tạp mà các tác nhân đầu tiên tác động đến nó là hợp chất phenolic. Với những đặc tính này A.tumafaciens được sử dụng như một vectơ để chuyển gen vào cây. 1.2.3. Quá trình chuyển gen thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens Chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật, ) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. Các bước chính để tạo một thực vật chuyển gen gồm có: chọn lọc và phân lập gen, chuyển gen vào tế bào thực vật, nuôi tế bào thực vật mang gen lạ thành cây hoàn chỉnh. Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau như sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện tế bào và mô thực vật, dùng vi tiêm, chuyển gen thông qua con đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A. tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay. Chuyển gen vào thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens được xem là phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm) dựa vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium . 1.2.4. Hệ thống vector chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Các Ti-plasmid chứa các gen tổng hợp hoocmon sinh trưởng thực vật và opine không cần thiết gây khối u cho cây bị xâm nhiễm nên không được dùng trực tiếp làm vector. Các enzym giới hạn có thể cắt DNA của plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi đó công nghệ gen lại cần có những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzym giới hạn. Ngoài ra, các gen one được dùng làm chỉ thị chọc lọc có tính trội, nhưng chúng lại làm cản trở quá trình tái sinh bình thường ở thực vật. Với những lí do này, Ti-plasmid đã được nghiên cứu cải biến như cắt bỏ các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng đa năng MCS (multicloning site- trình tự tạo dòng) tạo hai hệ thống vector chuyển gen hiệu quả: vectơ 5 liên hợp, vectơ nhị phân. Nhờ vậy, cây trồng được biến nạp Ti-plasmid cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và phát triển bình thường. Vectơ liên hợp (co-integrative vector) Hệ thống vector liên hợp (co-integrative vector) là kết quả của sự liên hợp hai loại plasmid: Ti-plasmid đã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất opine nhưng vẫn giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải. Thay vào những gen bị cắt bỏ là đoạn tương đồng với một đoạn trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian) để phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmid. Plasmid trung gian là một plasmid tách dòng từ vi khuẩn E. coli và có thể tái sinh được ở Agrobacterium. Plasmid này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vụ việc chọn lọc và có đoạn tương đồng. Khi cho tương tác hai loại plasmid này với nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao đổi chéo giữa hai đoạn tương đồng và hình thành nên vector liên hợp. Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn A. tumefaciens và hoạt động theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn đất. Do tần số đưa plasmid trung gian từ E. coli sang Agrobacterium rất thấp nên vector này ít được sử dụng. Vectơ nhị phân (binary vector) Hệ thống vector nhị phân khác với vector liên hợp là chúng có hai vector (plasmid) cùng có mặt và hoạt động trong Agrobacterium. (1) Vector chuyển gen: là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các gen không cần thiết ở giữa hai trình tự bờ trái và bờ phải, gắn thêm các đơn vị sao chép để DNA plasmid có thể vừa tự nhân trong cả E. coli và Agrobacterium, các gen chọn lọc, gen chỉ thị, vùng có chứa nhiều điểm cắt của các enzym giới hạn (vùng tạo ra dòng đa năng) nằm ở giữa hai trình tự bờ trái và bờ phải để chèn gen mong muốn. (2) Vector bổ trợ: với vùng T-DNA và bờ phải, bờ trái cắt bỏ hoàn toàn, giữ lại vùng vir. Khi các gen trên vector bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T-DNA sang tế bào thực vật. Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị sao chép có thể không bền vững trong E. coli khi cả hai vùng này cùng hoạt động. Tuy nhiên, vector nhị phân có ưu điểm như: không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid, kích thước vector khá nhỏ. Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chuyển gen từ E. coli sang A. tumefaciens đã tăng lên. Hiện nay, vector nhị phân được sử dụng rộng rãi với rất nhiều loại được thiết kế phù hợp với yêu cầu của quá trình chuyển gen. 6 Hệ thống vector pCAMBIA Vector pCAMBIA là vector nhị phân có nguồn gốc là vector pPZP. Đặc điểm chung của pCAMBIA: số lượng bản copy trong E. coli cao, đơn vị sao chép pVS1 bền vững trong Agrobacterium, kích thước nhỏ (từ 7-12kb) phụ thuộc vào từng loại plasmid, chọn lọc vi khuẩn bằng chloramphenicol hoặc kanamycin, chọn lọc thực vật bằng hygromycin B hoặc kanamycin, gen chỉ thị là gen gus. Hiện nay hệ thống pCAMBIA đã đã thiết kế các vector khác nhau mang các gen thích hợp với từng đối tượng thực vật, từng chủng A .tumefaciens và từng mục đích sử dụng khác nhau. Gồm có: p2300, p2201, p1300, p1301, p1302, p1303, p1304, p1305.1, p1305.2. 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens: Ảnh hưởng của kiểu gen: hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một loài. Nhiều báo cáo, tài liệu về chuyển gen đã đề cập đến ảnh hưởng của kiểu gen đến khả năng chuyển T-ADN hay phản ứng nuôi cấy in vitro. Ảnh hưởng của dạng mẫu mô đích: hiệu quả biến nạp ở các mô khác nhau biểu hiện sự tiếp nhận gen ngoại lai cũng khác nhau (các mô đang phân sinh dễ biến nạp hơn). Ở cây cà chua (giống seeda) các mô lá mầm cho hiệu quả biến nạp cao hơn gấp 6 lần mô lá. Các dạng mô được sử dụng làm mô đích để biến nạp là mô sẹo phôi hóa, phôi non của hạt hay huyền phù tế bào. Mẫu quá non hay quá già đều ảnh hưởng đến khả năng biến nạp. Nếu mẫu non, sức sống kém dẫn đến tỷ lệ mẫu sống thấp, còn nếu mẫu quá già lúc này hệ gen thực vật ổn định dẫn đến việc tiếp nhận gen ngoại lai trở nên khó khăn hơn. Ảnh hưởng của chủng Agrobacterium và plasmid: các nghiên cứu chuyển gen thành công thông qua A. tumefaciens cho thấy các chủng vi khuẩn được sử dụng hiệu quả ở các loài cây một lá mầm đó là LBA4404, C58 đã bị bất hoạt, EHA101 và các chủng cải biên (EHA105 từ EHA101, AGL0 và AGL1 từ EHA101) [33]. Dạng Ti-plasmid của Agrobacterium cũng có vai trò trong quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Các nghiên cứu cho thấy, Ti- plasmid dạng nopalin có hiệu quả hơn trong việc lây nhiễm Agrobacterium vào ngô so với Ti- plasmid dạng octopin. Nhiệt độ: ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển T- ADN đã được phát hiện ở các loài cây hai lá mầm. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình chuyển T- 7 ADN có thể thay đổi đối với mỗi dạng mẫu mô biến nạp nhất định. Nhiệt độ thích hợp cho chuyển gen bền vững cũng cần phải được đánh giá với mỗi dạng mẫu mô đích và với mỗi chủng Agrobacterium biến nạp. Ở các loài cây một lá mầm nhiệt đồng nuôi cấy thường là 24- 25 0 C, một số trường hợp là 28 0 C. Ảnh hưởng của nhiệt độ thấp (dưới 23 0 C) đến khả năng chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững đã được đánh giá. Biểu hiện gen bền vững gen trong chuyển gen vào mô sẹo cây tỏi đạt được cao nhất ở 22 0 C. Tần số chuyển gen cao hơn đã nhận được ở phôi ngô non sau biến nạp được đồng nuôi cấy ở 20 0 C so với 23 0 C. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy: sự lây nhiễm Agrobacterium có thể được cải tiến bằng cách thêm các chất cảm ứng như acetosyringone vào môi trường nuôi cấy. Khi nghiên cứu sự ảnh hưởng của acetosyringone đến hiệu quả chuyển gen ở giống lúa DT10 cho thấy ở nồng độ 400μM thì hiệu quả biến nạp cao nhất (45,1%) còn ở nồng độ 500μM chỉ đạt 16%, thấp nhất (Trần Bích Lan và cs, 1998). Gần đây, việc sử dụng L- Cys bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy đã cải thiện hiệu suất chuyển gen ở cây ngô. Ảnh hưởng của các chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium: các chất kháng sinh như: cefotaxim, car, timentin thường được sử dụng loại bỏ vi khuẩn sau khi đồng nuôi cấy trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua Agrobacterium . Hiện nay, Car đang được sử dụng chủ yếu trong các thí nghiệm chuyển gen thông qua Agrobacterium vào ngô và lúa ở nồng độ 100 mg/l. Và đối với đậu tương là cefotaxim 200mg/l, car 250mg/l . Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn: mật độ vi khuẩn Agrobacterium cao thường gây chết tế bào thực vật giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển gen bền vững. Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn lây nhiễm cao là cần thiết đối với chuyển gen vào các loài, các mẫu mô khó, tần số chuyển gen có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm ở mật độ vi khuẩn cao sau đó rửa mẫu hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường đồng nuôi cấy. 1.3. Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate trên cây đậu tƣơng 1.3.1 Cơ chế kháng glyphosate Để sản xuất cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, người ta cần những gen kháng mã hóa cho protein, những protein này hoặc làm bất hoạt thuốc diệt cỏ, hoặc thay đổi vị trí tác động 8 của thuốc trong tế bào, làm thuốc không còn gây hại. Thuốc diệt cỏ glyphosate ức chế đặc hiệu enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate- synthase (EPSP-synthase). Đây là enzyme cần thiết trong thực vật để tổng hợp amino acid thơm (phenylalanin, tryptophan và tyrosin), một số vitamin và các hợp chất có nguồn gốc thứ cấp. Enzyme này không có ở người và động vật, vì vậy glyphosate không độc đối với người. Glyphosate được phân giải trong đất nhờ vi sinh vật và không để lại sản phẩm độc hại nào. Kháng glyphosate có thể do những cơ chế khác nhau: + Thứ nhất trong cây có sự biểu hiện mạnh mẽ của enzyme của EPSP-synthase dưới sự điều khiển của promoter CaMV-35S và đồng thời tạo nên một enzyme oxidoreductase của vi khuẩn. Nhờ enzyme oxidoreductase mà thuốc bị bất hoạt và với một lượng lớn EPSP-synthase được tạo nên thì lượng thuốc còn lại không thể gây hại ở cây biến đổi gen. Ở đây 2 gen cần thiết, trong đó gen oxidoreductase là không có trong thực vật. + Một khả năng thứ hai là sử dụng EPSP-synthase của vi khuẩn. Từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (loài CP4), EPSP-synthase vi khuẩn được phân lập và do sự thay đổi trình tự amino acid nên enzyme này không còn mẫn cảm với glyphosate và vì vậy được sử dụng trong nhiều cây trồng thương mại. + Thứ ba là xuất hiện một dạng đột biến EPSP-synthase của cây trồng có khả năng kháng glyphosate. Sự kết hợp của glyphosate vào enzyme EPSP-synthase ở loại hình bình thường đã làm mất hoạt tính xúc tác và hạn chế sự di chuyển của enzyme này vào lục lạp. Dạng EPSP*- synthase (mã hóa bởi shkG*- dạng đột biến) có hoạt tính thấp với glyphosate và vẫn thể hiện hoạt tính khi có mặt của thuốc diệt cỏ này. 1.6.2. Đậu tương chuyển gen kháng glyphosate Hiện nay, các cây trồng chuyển gen kháng glyphosate thường mang 1 hoặc vài gen dưới đây: - Gen EPSPS phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium chủng CP4 mã hoá cho một dạng của enzym 5-enolpyruvyshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) có khả năng kháng thuốc diệt cỏ glyphosate. - Gen EPSPS cải biên phân lập từ ngô mã hoá cho enzym EPSPS 9 - Gen phân lập từ vi khuẩn đất Achromobacter chủng LBAA mã hoá cho enzym oxy hoá khử glyphosate (GOX). Ở cây đậu tương, người ta đã đưa một số gen kháng thuốc diệt cỏ, tuy nhiên khi chuyển gen EPSPS phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium chủng CP4 biểu hiện tính kháng thuốc diệt cỏ rất hiệu quả. Giống đậu tương chuyển gen kháng glyphosate mang gen này hiện đang được trồng phổ biến tại nhiều quốc gia trên thế giới dưới tên thương mại là đậu tương Roundup ready. Đây là giống đậu tương chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ Roundup chứa hoạt chất glyphosate phổ biến nhất. Hiện nay, các nhà khoa học cũng như các tập đoàn giống cây trồng vẫn đang nỗ lực nghiên cứu nhằm phát triển thêm các giống đậu tương mang gen kháng thuốc trừ cỏ khác ngoài gen EPSPS nhưng những nỗ lực này hầu hết mới chỉ dừng lại ở việc tạo ra các dòng cây chuyển gen triển vọng chứ chưa thể tạo ra những sản phẩm thương mại hoá khác thay thế cho các giống Roundup ready mang gen EPSPS. CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu thực vật là hai giống đậu tương DT2008 và giống ĐT26. Các chủng vi khuẩn GV3101, C58C1, LBA4404được lưu giữ tại Viện Di truyền Nông nghiệp. Các chủng này chứa vector pCAMBIA2300 2.2 Hóa chất thiết bị 2.2.1. Hóa chất và môi trường Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm: H 2 O 2 , BAP, IAA, các muối đa lượng, vi lượng, vitamin thuộc môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) và B5 (Gambor, 1968). Các chất kháng sinh, chất dẫn dụ acetosyringone (AS) 2.2.2. Các thiết bị thí nghiệm Các máy móc và thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: máy khuấy từ, máy ly tâm, máy khuấy trộn vortex, máy quang phổ, máy soi chụp ảnh gel, pipetman các loại, máy ly tâm lạnh, bộ điện di DNA, và một số trang thiết bị khác. 2.3. Nội dung nghiên cứu 10 Nội dung 1: Xây dựng quy trình tái sinh giống đậu tương DT2008 và ĐT26 Nội dung 2: Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen CP4-EPSPS kháng thuốc trừ cỏ vào hai giống đậu tương DT2008, ĐT26 nhờ Agrobacterium tumefaciens. Nội dung 3: Đánh giá xác định sự biểu hiện của gen chuyển. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu  Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để xây dựng hệ thống tái sinh cây  Phương pháp lây nhiễm chủng vi khuẩn vào mẫu thực vật  Phương pháp tách chiết DNA  Phương pháp PCR  Phương pháp điện di trên gel agarose CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xây dựng quy trình tái sinh hai giống đậu tƣơng DT2008 và ĐT26 3.1.1. Ảnh hưởng của H 2 O 2 đến khả năng khử trùng hạt Khử trùng mẫu là công đoạn đầu tiên có ý nghĩa quyết định đến kết quả của quá trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của H 2 O 2 đến khả năng khử trùng của hạt giống đậu tương DT2008 và giống ĐT26 Nồng độ H 2 O 2 (%) Thời gian (phút) Giống DT2008 Giống ĐT26 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) 15 8 94 0 6 98 0 2 10 8 0 92 10 0 90 12 2 34 64 5 40 55 20 8 35 20 45 40 23 37 10 2 40 58 5 46 49 12 0 75 25 0 78 22 Qua bảng số liệu cho thấy sử dụng dung dịch H 2 O 2 ở nồng độ 15% trong thời gian 10 phút [...]... giống đậu tương DT2008 và ĐT26 3.2 Bƣớc đầu xây dựng quy trình chuyển gen CP4-EPSPS kháng thuốc trừ cỏ vào hai giống đậu tƣơng DT2008 và ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.2.1 Xác định chủng vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens phù hợp để chuyển gen CP4EPSPS vào giống đậu tương DT2008, ĐT26 Trong thí nghiệm này, ba chủng vi khuẩn được thử nghiệm là LBA4404, C58C1 và GV3101 Hiệu quả chuyển. .. tạm thời của gen gus đạt 18,5% ở giống đậu tương DT2008 và 18,1% ở giống đậu tương ĐT26 3.2.5 Ảnh hưởng của tổ hợp kháng sinh cefotaxim và vancomycin đến hiệu quả ức chế vi khuẩn Trong một quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens điển hình, sau khi vi khuẩn A tumefaciens được sử dụng để chuyển gen ngoại lai vào mô hay tế bào thực vật, vật liệu chuyển gen cần được xử lý với các loại kháng sinh... 3.12 Sơ đồ quy trình quy trình chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ CP4-EPSPS vào hai giống đậu tương DT2008 và ĐT26 3.3 Kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tƣơng DT2008 và ĐT26 đã biến nạp 3.3.1 Kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tương DT2008 đã biến nạp Hình 3.14 Sản phẩm điện di phản ứng PCR nhân gen CP4-EPSPS từ mẫu DNA genome của các cây đậu tương DT2008 đã biến nạp Sau khi... mẫu đậu tương ĐT26 (trong tổng số 25 mẫu thu được sau biến nạp) mang gen CP4-EPSPS, với kích thước xấp xỉ 1,5 kB Đề nghị 1.Tiếp tục tiến hành các thí nghiệm bổ sung để xác minh sự tồn tại của gen kháng thuốc trừ cỏ trong các cây chuyển gen, đồng thời thực hiện tự thụ và chọn lọc để thu được các cây chuyển gen đồng hợp tử làm vật liệu ổn định cho các thí nghiệm lai tạo giống kháng thuốc trừ cỏ glyphosate. .. thí nghiệm trên ta hoàn toàn có thể sử dụng giá trị OD = 0,8 khi biến nạp vi khuẩn với giống đậu tương DT2008 và ĐT26 15 3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens đến hiệu quả chuyển gen trên giống đậu tương DT2008, ĐT26 Bảng 3.7 Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp đối với giống đậu tương DT2008, ĐT26 ĐT26 Giống DT2008 Thời Tỉ lệ gian sống (%) Tỉ lệ Tần số... vật liệu ổn định cho các thí nghiệm lai tạo giống kháng thuốc trừ cỏ glyphosate tiếp theo 2 Sau khi thu được vật liệu chuyển gen cần tiếp tục đánh khả năng kháng thuốc trừ cỏ của cây chuyển gen ngoài đồng ruộng và theo dõi tính ổn định của gen chuyển trong cây đậu tương đã được chuyển gen CP4-EPSPS 22 ... trong số 3 chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm thì chủng vi khuẩn C58C1 tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở giống DT2008 và ĐT26 đạt cao nhất (19,1% và 18,2%) Như vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi chọn được các chủng C58C1 để lây nhiễm với giống đậu tương DT2008 và ĐT26 cho hiệu quả biến nạp tương đối cao 3.2.2 Ảnh hưởng của mật độ dung dịch vi khuẩn (OD600) đến hiệu quả chuyển gen vào giống DT2008... mầm của giống đậu tương 18 DT2008 không mang gen kháng mất khả năng tái sinh Từ các kết quả đạt đƣợc chúng tôi đƣa ra quy trình chuyển gen nhƣ sau: Khử trùng hạt Chủng vi khuẩn C58C1 Cho hạt nảy mầm Nuôi lỏng tạo huyền phù Làm tổn thương nốt lá mầm của hạt Cho mẫu đậu tương tiếp xúc với dịch khuẩn với OD600 = 0,8 (lây nhiễm trong 60 phút) Đồng nuôi cấy trên môi trường A2 (trong 5 ngày) Khử khuẩn bằng... xấp xỉ 1,5 kb tương đương với đối chứng dương (mẫu ADN của plasmid pCAMBIA2300.1) Còn lại 20 mẫu không có sự xuất hiện của băng kích thước này và không có sự khuếch đại sản phẩm PCR Kết quả này chứng tỏ 5 cây đậu tương DT2008 tái sinh này nhiều khả năng mang gen CP4-EPSPS và 20 mẫu ADN không thể nhân băng sản phẩm, đồng nghĩa với vi c cá thể có mẫu ADN này không mang gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate. .. hợp để loại bỏ vi khuẩn Vi c sử dụng kết hợp cefotaxim và vancomycin giúp cải thiện đáng kể hiệu quả ức chế vi khuẩn Vì vậy, trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng vancomycin ở nồng độ 250 mg/l kết hợp với cefotaxim ở các nồng độ khác nhau nhằm cải thiện hiệu quả ức chế vi khuẩn Kết quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 3.9 Bảng 3.9 Hiệu quả ức chế vi khuẩn A tumefaciens và ảnh hưởng của tổ hợp kháng sinh cefotaxim . tài: Bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate vào cây đậu tương nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ’. CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về đậu tƣơng. số gen kháng thuốc diệt cỏ, tuy nhiên khi chuyển gen EPSPS phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium chủng CP4 biểu hiện tính kháng thuốc diệt cỏ rất hiệu quả. Giống đậu tương chuyển gen kháng glyphosate. độ vi khuẩn cao sau đó rửa mẫu hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường đồng nuôi cấy. 1.3. Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate trên cây đậu tƣơng 1.3.1 Cơ chế kháng