BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  PHẠM THANH XUÂN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT CÂY MÒ HOA TRẮNG (Clerodendrum Fragrans Vent.) ĐỐI VỚI VI KHUẨN E. coli và Salmonella spp. PHÂN LẬP TỪ PHÂN LỢN CON THEO MẸ BỊ TIÊU CHẢY VÀ THỬ NGHIỆM ĐIỀU TRỊ CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y MÃ SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. NGUYỄN THANH HẢI PGS.TS. NGUYỄN VĂN THANH HÀ NỘI – 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2014 Tác giả luận văn Phạm Thanh Xuân Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của tập thể lãnh đạo, các nhà khoa học, cán bộ, chuyên viên bộ môn Ngoại Sản Khoa Thú Y; tập thể Ban Lãnh đạo Khoa Thú y, Khoa Công nghệ Sinh học; cán bộ các phòng, ban chức năng Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ đó. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thanh Hải, PGS.TS. Nguyễn Văn Thanh – những thầy giáo trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo cho Tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp và gia đình đã tạo điều kiện, động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này. Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2014 Tác giả luận văn Phạm Thanh Xuân Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi Danh mục các từ viết tắt vii MỞ ĐẦU 1 1 Đặt vấn đề 1 2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi 4 1.1.1 Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn 4 1.1.2 Vấn đề tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi 5 1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới và Việt Nam 6 1.2.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng dược liệu trên thế giới 7 1.2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng dược liệu ở Việt Nam 10 1.3 Cây Mò hoa trắng (Clerodendrum Fragrans Vent.) 11 1.3.1 Mô tả thực vật, phân bố, bộ phận dùng 12 1.3.2 Tác dụng dược lý 12 1.3.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn, nấm, virus, kí sinh trùng của một số loài thuộc chi Clerodendrum L. 14 1.4 Bệnh viêm ruột tiêu chảy trên lợn con theo mẹ 16 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng và thời gian nghiên cứu 19 2.1.1 Cây Mò hoa trắng 19 2.1.2 Vi khuẩn thử nghiệm 19 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 2.1.3 Lợn con theo mẹ bị mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy 19 2.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19 2.1.5 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, môi trường 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 24 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Kết quả kháng sinh đồ kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn với các kháng sinh thông dụng 26 3.3 Thu dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong các dung môi khác nhau và đánh giá hiệu suất chiết xuất 31 3.4 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng chiết trong các dung môi khác nhau 34 3.4.1 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng đối với vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. phân lập được từ phân lợn con theo mẹ bị viêm ruột tiêu chảy. 34 3.4.2 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong dung môi ethanol 35% trên E. coli chứa plasmid có gen kháng kháng sinh. 37 3.5 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong dung môi ethanol 35% khi pha loãng. 39 3.6 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong dung môi ethanol 35% theo thời gian bảo quản. 41 3.7 Kết quả thử nghiệm điều trị trên lợn con theo mẹ bị viêm ruột tiêu chảy. 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 1 Kết luận 49 2 Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Thành phân môi trường LB (Luria Bertani) lỏng 20 2.2 Thành phần môi trường LB (Luria Bertani) đặc 20 2.3 Bảng tiêu chuẩn đánh giá khả năng mẫn cảm và kháng thuốc của vi khuẩn 23 3.1 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 02 chủng vi khuẩn thử nghiệm với 14 kháng sinh thông dụng 27 3.2 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết rễ, thân, lá cây Mò hoa trắng sử dụng dung môi ethanol 70% 31 3.3 Hiệu suất tách chiết của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng 33 3.4 Tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết thân cây Mò hoa trắng in vitro 35 3.5 Khả năng diệt khuẩn in vitro dịch chiết thân cây Mò hoa trắng khi pha loãng 40 3.6 Tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong dung môi ethanol 35% theo thời gian bảo quản ở 4 0 C 42 3.7 Kết quả thử nghiệm điều trị lợn con theo mẹ bị viêm ruột tiêu chảy 46 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Cây mò hoa trắng 12 2.1 Hệ nồng độ pha loãng cao đặc để xác định nồng độ tối thiểu tác dụng trên vi khuẩn thử nghiệm 24 2.2 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 25 3.1 Kết quả kháng sinh đồ với kháng sinh chuẩn trên vi khuẩn thử nghiệm 29 3.2 Dịch chiết rễ, thân, lá cây Mò hoa trắng trong dung môi ethanol 70% 30 3.3 Dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong các dung môi khác nhau 32 3.4 Hiệu suất chiết xuất thân cây Mò hoa trắng sử dụng các dung môi khác nhau 33 3.5 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong các dung môi khác nhau 36 3.6 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của các dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong các dung môi khác nhau 36 3.7 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của các dịch chiết thân cây Mò hoa trắng 38 3.8 Khả năng diệt khuẩn in vitro dịch chiết thân cây Mò hoa trắng khi pha loãng 40 3.9 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng đối với vi khuẩn theo thời gian bảo quản ở 4 0 C 43 3.10 Khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong dung môi ethanol 35% sau 30 ngày bảo quản ở 4 0 C 43 3.11 Hình ảnh lơn con theo mẹ mắc bệnh tiêu chảy do E.coli và Salmonella SPP 45 3.12 Tỷ lệ khỏi bệnh của lợn con theo thời gian điều trị 47 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Các chữ được viết tắt Ax Amoxicillin Am Ampicillin Ci Ciprofloxacin Kn Kanamycin Pn Penicillin E.coli Escherichia coli Sal Samonella Sta Staphylococus LB Luria Bertani Đk Đường kính Kq Kết quả mm Millimet ml Millilit µl Microlit g Gam mg Milligam Gr Gram Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện tượng kháng thuốc và sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật đang là mối quan tâm lớn trên toàn thế giới. Kháng sinh tích lũy trong sản phẩm động vật không những gây độc tính mà có thể gây dị ứng cho người tiêu dùng. Tại một số nước phát triển, việc sử dụng kháng sinh như chất tăng trưởng hay mục đích phòng bệnh đã bị cấm. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và tác dụng phụ của kháng sinh trong điều trị đang là những thách thức trong y học (WHO 2014). Tổ chức y tế thế giới năm 1997 đã nhận định rằng nhiều hợp chất có nguồn gốc thực vật bản địa có khả năng thay thế thuốc kháng sinh. Những nghiên cứu và trao đổi thông tin về thảo dược ngày càng được chú trọng (Amadou, 1998). So với các loại kháng sinh tân dược, kháng sinh có nguồn gốc thực vật (gọi là các phytocide) có nhiều ưu điểm như chưa phát hiện có hiện tượng kháng thuốc, không tồn dư trong thực phẩm, rất ít độc, dễ hòa tan trong nước, dễ sử dụng, bào chế giản đơn (Seyyednejad et al., 2010). Thảo dược đang ngày càng chứng minh được vai trò quan trọng của nó trong nền công nghiệp dược phẩm như là một giải pháp an toàn sinh học thay thế cho các thuốc hóa học tổng hợp (Mahesh et al., 2008; Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho, 2013). Khuynh hướng chung của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng là quay về với thiên nhiên, tìm cách giảm sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, động vật thủy sinh và dần dần thay thế bằng thảo dược thân thiện. Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật phong phú và đa dạng, đang sở hữu cả “kho vàng” dược liệu với gần 3.000 cây thuốc có thể dùng trực tiếp làm thuốc hay để tách chiết một số hoạt chất bào chế thuốc thành phẩm (Viện dược liệu quốc gia, 2013). Tuy nhiên nhiều cây thuốc đã có hiệu quả điều trị rõ rệt, nhưng cơ chế tác dụng vẫn chưa được giải thích và chứng minh. Xu hướng chung hiện nay là kết hợp Đông y và Tây y với phương châm vừa áp dụng những kinh nghiệm chữa bệnh dân gian bằng thuốc nam, vừa nghiên cứu khảo sát các tính năng tác dụng của cây thuốc bằng cơ sở khoa học hiện đại (Đỗ Tất Lợi, 1999). Trong số đó, cây Mò hoa Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 trắng trong dân gian được sử dụng để trị vết thương ngoài da bị nhiễm trùng, kể cả là bị nhiễm trùng bởi trực khuẩn mủ xanh cũng cho hiệu quả chữa bệnh tốt, vết thương mau lành (Đỗ Tất Lợi, 1999; Bùi Thị Tho và Nguyễn Thanh Hà, 2009). Nhiều nghiên cứu ngoài nước đã khẳng định cây Mò hoa trắng và các cây trong chi Clerodendrum có tính kháng sinh, có khả năng chống lại nhiều loại vi khuẩn gây bệnh (Aleykytty et al., 2010; Jeenu et al., 2011;Venkatarismam et al., 2012; Leena and Aleykutty, 2012; Anandhi and Ushadevi., 2013). Bệnh viêm ruột tiêu chảy là một bệnh khá phổ biến ở lợn con theo mẹ, một trong những nguyên nhân gây bệnh chính là vi khuẩn E. coli và Salmonella spp.(Bùi Thị Tho, 1996; Vũ Bình Minh, Cù Hữu Phú, 1999; Phạm Thế Sơn, Phạm Khắc Hiếu, 2008; Phạm Ngọc Thạch, 2009). Theo nhiều tác giả thì hiện nay nhiều chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. gây bệnh tiêu chảy đã kháng lại nhiều loại kháng sinh thường dùng trong thú y (Cù Hữu Phú và cs, 2004; Trương Quang và cs, 2005; Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho, 2013) Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết cây Mò hoa trắng (Clerodendrum Fragrans Vent.) đối với vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị tiêu chảy và thử nghiệm điều trị” được thực hiện với mục tiêu: Lựa chọn bộ phận cũng như dung môi tốt nhất để thu dịch chiết cây Mò hoa trắng có tác dụng diệt khuẩn in vitro đối với E. coli và Salmonella spp., ngoài ra còn nghiên cứu khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết đối với E. coli Top 10 có chứa plasmid kháng đơn thuốc (ampicillin và kanamycin). Dựa trên kết quả nghiên cứu khả năng diệt khuẩn in vitro tiến hành sử dụng dịch chiết cây Mò hoa trắng trong điều trị lợn con theo mẹ bị mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy. 2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn a. Ý nghĩa khoa học của đề tài Chứng minh một cách khoa học về khả năng kháng khuẩn của cây Mò hoa trắng. Xác định được phổ kháng khuẩn của kháng sinh thực vật có trong cây. Góp phần bổ sung cơ sở lý luận về tác dụng dược lý và ứng dụng trong dân gian của dược liệu Mò hoa trắng. [...]... giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng đối với vi khuẩn E coli và Salmonella spp phân lập được từ phân lợn con theo mẹ bị vi m ruột tiêu chảy - Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong dung môi ethanol 35% trên E coli chứa plasmid có gen kháng kháng sinh - + Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng. .. + Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết rễ, thân, lá cây Mò hoa trắng sử dụng dung môi ethanol 70% trên vi khuẩn E coli và Salmonella spp. , phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị vi m ruột tiêu chảy + Thu dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong các dung môi khác nhau và đánh giá hiệu suất chiết xuất + Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng chiết trong... năng diệt khuẩn in vitro tốt ở nồng độ 100mg/ml trên cả 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm E coli, S aureus, Bacillus và Klebsiella Nghiên cứu của tác giả Anandhi và Ushadevi (201 3) dịch chiết lá cây C Inerne L trong dung môi ethnol chỉ có tác dụng diệt khuẩn in vitro đối với vi khuẩn P solanacearum và Xanthomonas citri, còn đối với vi khuẩn Salmonella typhi, Bacillus subtilis, K.pneumonia không có tác dụng diệt. .. aureus, E coli và Klebsiella pneumoniae Năm 2011, Leena and Aleykutty đã nghiên cứu dịch chiết lá cây C Paniculatum Linn khi sử dụng 05 dung môi khác nhau (ethyl acetate, alcohol, nước, petroleum ether, chloroform) cho thấy, đối với vi khuẩn Vibrio parahaenolyticus cả năm dịch chiết đều có tác dụng diệt khuẩn in vitro Khi thử nghiệm trên vi khuẩn Salmonella newsport chỉ có 3 loại dịch chiết có tác dụng. .. dung môi ethanol 35% khi pha loãng - + Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong dung môi ethanol 35% theo thời gian bảo quản - + Điều trị thử nghiệm điều trị trên lợn con theo mẹ bị vi m ruột tiêu chảy 2.3 Phương pháp nghiên cứu + Thu dịch chiết lá, thân, rễ cây Mò hoa trắng: Bột lá, thân, rễ cây Mò hoa trắng được chiết với ethanol 70%, bột thân cây Mò hoa trắng. .. bột mịn ( . 201 3) Xuất phát từ thực tế trên, đề tài Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết cây Mò hoa trắng (Clerodendrum Fragrans Vent. ) đối với vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. phân. cây Mò hoa trắng chiết trong các dung môi khác nhau 34 3.4.1 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng đối với vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. phân lập được từ phân. diệt khuẩn của các dịch chiết thân cây Mò hoa trắng in vitro 35 3.5 Khả năng diệt khuẩn in vitro dịch chiết thân cây Mò hoa trắng khi pha loãng 40 3.6 Tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết thân cây