VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT o0o LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Đề tài: XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH KIỂU GENE ACE I/D BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ ACTN3 R577X BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP CỦA MỘT SỐ VẬN ĐỘNG VIÊN ĐIỀN KINH VÀ BƠI LỘI Ở VIỆT NAM Hà Nội, tháng 12 năm 2014 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT o0o LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Đề tài: XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH KIỂU GENE ACE I/D BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ ACTN3 R577X BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP CỦA MỘT SỐ VẬN ĐỘNG VIÊN ĐIỀN KINH VÀ BƠI LỘI Ở VIỆT NAM Họ tên học viên: PHẠM THỊ NHÀN Người hướng dẫn: TS LUYỆN QUỐC HẢI Cơ sở đào tạo: Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Chuyên ngành: Hóa Sinh Mã số: 60420114 Hà Nội, tháng 12 năm 2014 MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, có nhiều nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến thành công VĐV đỉnh cao, bao gồm: yếu tố di truyền, yếu tố chế độ tập luyện, chế độ dinh dƣỡng, cảm xúc, môi trƣờng thiết bị luyện tập, trí tuệ, khả nhận thức yếu tố môi trƣờng khác Tuy nhiên, yếu tố di truyền đƣợc xác định định tới 50% vai trò ảnh hƣởng lên vận động thể chất ngƣời (Hopkins, 2001) Một báo cáo Ahmetov Rogozkin năm 2009 cho rằng, yếu tố di truyền định tới 66% thành công VĐV đỉnh cao Bản đồ gene ngƣời đƣợc công bố năm 2007 đƣa 239 gene có ảnh hƣởng đến hoạt động thể chất, có 214 gene nhiễm sắc thể thƣờng, gene nhiễm sắc thể X 18 gene ty thể Đặc biệt, dựa nghiên cứu cấp độ phân tử, nhà khoa học tìm khoảng 36 gene đóng vai trị định tới đặc tính sức mạnh sức bền hoạt động thể chất, đƣợc phân loại thành nhóm thị di truyền liên quan đến thành tích thi đấu VĐV thể thao (Ahmetov cs, 2012) Những công bố nhƣ tảng vững cho việc ứng dụng công nghệ gene phân loại, đào tạo tuyển chọn VĐV Cần phải khẳng định rằng, thành tích thể thao cá nhân bị ảnh hƣởng nhiều yếu tố khác có yếu tố di truyền Các gene đóng vai trò khác việc xác định khác biệt ngƣời ngƣời thông qua biểu tính trạng nhƣ: thành phần sợi mức tiêu thụ oxy Ví dụ: mơn thể thao cần sức bền tố chất di truyền (do gene quy định) ảnh hƣởng lên đến 50% thành tích đạt đƣợc (Hopkins, 2001) Đây liệu khoa học từ nghiên cứu dựa liệu di truyền số lƣợng lớn VĐV thành tích cao Việc phát biến dị di truyền có liên quan mật thiết tới thành tích VĐV đỉnh cao cho phép đánh giá tiềm thành tích đạt đƣợc ngƣời mang biến dị Trong số gene có liên quan đến thành tích thể thao, biến dị di truyền gene ACE ACTN3 đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều với nhiều cơng trình đƣợc cơng bố tạp chí khoa học thể thao uy tín giới, chúng đƣợc cho có mối quan hệ mật thiết đến thành tích thể thao VĐV Tuy nhiên, bên cạnh nhiều nghiên cứu liên quan mật thiết kiểu gene ACTN3 ACE tới hiệu suất thể thao vận động viên, có nghiên cứu cho kết phủ nhận giả thuyết Chính thế, việc thực nghiên cứu quốc gia/dân tộc để xem xét, kiểm chứng lại giả thuyết đƣa vô cần thiết (Fang Ma cs, 2013) Hiện chƣa có nghiên cứu đƣợc tiến hành để khảo sát đánh giá tần suất nhƣ mức độ ảnh hƣởng gene hiệu suất thể thao VĐV ngƣời Việt Nam Chính vậy, lựa chọn đề tài nghiên cứu: “Xác định đa hình kiểu gene ACE I/D kỹ thuật PCR ACTN3 R577X kỹ thuật PCR-RFLP số vận động viên điền kinh bơi lội Việt Nam” MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Xác định kiểu gene ACE I/D số vận đông viên điền kinh bơi lội kỹ thuật PCR Bƣớc đầu phân tích phân bố đa hình gene nhóm vận động viên khác nhau, xem xét ảnh hƣởng đa hình gene tới thành tích thể thao vận động viên - Xác định kiểu gene ACTN3 R577X số vận đông viên điền kinh bơi lội kỹ thuật PCR-RFLP Bƣớc đầu phân tích phân bố đa hình gene nhóm vận động viên khác nhau, xem xét ảnh hƣởng đa hình gene tới thành tích thể thao vận động viên NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI - Hệ thống sở lý luận thực tiễn việc nghiên cứu, giải mã gene ngƣời nói chung gene tài thể thao nói riêng - Tiến hành thu thập mẫu VĐV điền kinh bơi lội nhƣ mẫu đối chứng để làm mẫu nghiên cứu - Xây dựng quy trình tách chiết DNA tổng số từ mẫu tế bào niêm mạc miệng mẫu máu thẻ FTA - Thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại xác định kiểu gene ACE I/D ACTN3 R577X - Tối ƣu hóa phản ứng PCR để khuếch đại xác định kiểu gene ACE I/D - Tối ƣu hóa phản ứng PCR-RFLP để khuếch đại xác định kiểu gene ACTN3 R577X - Phân tích tần số kiểu gene ACE I/D ACTN3 R577X đối tƣợng nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu, giải mã hệ gene ngƣời 1.1.1 Giới thiệu chung hệ gene ngƣời Hệ gene ngƣời chứa tồn thơng tin di truyền ngƣời Những hiểu biết hệ gene ngƣời tiền đề cho việc ứng dụng di truyền phân tử lĩnh vực y học lĩnh vực nghiên cứu khoa học khác Lịch sử giải trình tự DNA ngƣời đƣợc bắt đầu vào năm 1977 Sanger công bố phƣơng pháp xác định thứ tự nucleotide phân tử DNA Cùng năm đó, gene ngƣời đƣợc giải mã thành công Năm 2003, sau 13 năm nghiên cứu, dự án hệ gene ngƣời dƣới đứng đầu James Watson (Viện sức khỏe quốc gia - Mỹ) sau Francis Collin hoàn tất trƣớc thời hạn năm, hàng nghìn trình tự hệ gene ngƣời đƣợc giải mã Thành công mở triển vọng việc chẩn đoán chữa trị bệnh cho ngƣời Trình tự hệ gene ngƣời bao gồm 2.851.330.913 nucleotide, nằm phần euchromatic hệ gene Chúng bị dán đoạn 341 chỗ trống (gaps), 33 gaps dài khoảng 198 Mb heterochromatin 308 gaps (dài khoảng 28 Mb) euchromatin Do vậy, hệ gene euchromatin dài xấp xỉ 2.88 Gb hệ gene ngƣời tổng thể dài xấp xỉ 3.08 Gb (International Human Genome Sequencing Consortium, 2004; Elizabeth, 2012) Mặc dù trình tự hệ gene ngƣời đƣợc xác định gần nhƣ hồn chỉnh trình tự DNA, nhƣng hiểu biết chức tất gene lại chƣa đƣợc rõ ràng Hệ gene ngƣời đơn bội chứa khoảng 20.000 gene mã hóa protein, nhiều so với dự đốn Các trình tự mã hóa protein chiếm phần nhỏ gene (chiếm khoảng 1,5%), phần lại liên quan đến phân tử RNA khơng mang mã, trình tự DNA điều hịa, LINEs, SINEs, introns trình tự chƣa biết chức Với chiều dài tổng thể hệ gene ngƣời khoảng tỷ cặp base pair (bp), hệ gene ngƣời đƣợc tổ chức 22 cặp nhiễm sắc thể thƣờng, nhiễm sắc thể X (1 nhiễm sắc thể với nam nhiễm sắc thể với nữ giới) nhiễm sắc thể Y (chỉ có nam giới) Các phân tử DNA dạng thẳng chứa nhân tế bào DNA ty thể dạng vịng có ty thể (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001) Thành phần hệ gene ngƣời thƣờng phân chia thành trình tự DNA mang mã không mang mã DNA mang mã trình tự phiên mã sang mRNA dịch mã sang protein trình sống, trình tự chiếm tỷ lệ nhỏ hệ gene (khoảng dƣới 2%) DNA không mang mã chiếm khoảng 98% hệ gene không đƣợc sử dụng để mã hóa protein Một số DNA khơng mang mã chứa gene cho phân tử RNA với chức sinh học quan trọng, gọi RNA không mang mã Các phân tử RNA khơng mang mã (ncRNA) có vai trò quan trọng tế bào, đặc biệt nhiều phản ứng tổng hợp protein trình chế biến RNA Hệ gene ngƣời chứa gene mã hóa cho 18.400 ncRNA bao gồm tRNA, rRNA, microRNA gene RNA khơng mang mã khác Ngồi ra, DNA khơng mang mã bao gồm pseudogenes, introns, vùng không dịch mã RNA, trình tự DNA điều hịa, trình tự DNA lặp lại trình tự liên quan đến nhân tố di truyền vận động (Ken, 2007; Lisa, 2008) Hệ gene ngƣời có nhiều trình tự điều hịa gene khác có chức quan trọng việc kiểm sốt biểu gene Các trình tự đƣợc biết đến từ năm 60 kỷ 19 chiếm khoảng 8% hệ gene (Dunham cs, 2012) Khoảng 8% hệ gene ngƣời chứa trình tự DNA lặp lại Các trình tự khác cá thể chí cá thể có mối quan hệ gần gũi Vì vậy, trình tự đƣợc sử dụng để xét nghiệm DNA phả hệ phân tích DNA pháp lý Các trình tự lặp lại 10 nucleotide đƣợc gọi trình tự microsatellite Trong trình tự lặp trinucleotide có tầm quan trọng đặc biệt đơi trình tự xảy vùng mã hóa protein dẫn đến rối loạn di truyền Ví dụ, bệnh Huntington kết trình tự lặp trinucleotide xảy bên gene Huntingtin nhiễm sắc thể số Các yếu tố di truyền vận động (transposons) trình tự DNA chép chèn chúng vị trí khác hệ gene vật chủ Các yếu tố chiếm tỷ lệ lớn hệ gene ngƣời Các transposons bên hệ gene ngƣời đƣợc phân loại thành LTR (long terminal repeat) retrotransposons (chiếm 8,3% hệ gene), SINEs (chiếm 13,1% hệ gene) bao gồm yếu tố Alu, LINEs (chiếm 20,4% hệ gene) transposons DNA loại II (chiếm 2,9% hệ gene) (Dunham cs, 2012) Hình 1 Phân loại gene ngƣời theo chức protein đƣợc dịch mã (http://www.pantherdb.org) Hình Sơ đồ tổ chức cấu trúc gene ngƣời (Tom Andrew, 1999) Bộ gene ngƣời có trình tự lặp lại khơng lặp lại: Nhóm DNA lặp lại nhiều chiếm khoảng 10% tổng lƣợng DNA tế bào, thƣờng đoạn DNA ngắn dƣới 10 bp, mức độ lặp lại tới 105 – 107 trình tự DNA tế bào DNA lặp lại nhiều lần nằm quanh tâm động hai đầu nhiễm sắc thể, khơng đƣợc phiên mã Nhóm DNA lặp lại chiếm khoảng 25%, thƣờng đoạn DNA ngắn khoảng 100 bp, mức độ lặp lại trình tự khoảng 1000 – 100.000 lần Nhóm bao gồm gene chịu trách nhiệm tổng hợp tRNA rRNA DNA nhóm đƣợc phiên mã nhƣng khơng đƣợc dịch mã Nhóm DNA khơng lặp lại chiếm khoảng 64% bao gồm DNA gene cấu trúc mã hóa phân tử protein DNA đƣợc phiên mã dịch mã (Hình 1) Bộ gene ngƣời có trình tự mã hóa khơng mã hóa (Hình 2) Các gene mã hóa RNA - khơng mã hóa cho protein cấu trúc chia làm bốn loại: - RNA vận tải (tRNAs): có chức vận chuyển axit amin - RNA ribosome (rRNAs): thành phần ribosome - RNA hạch nhân nhỏ (small nucleolar RNA hay snoRNA) cần thiết cho trình xử lý rRNA, biến đổi base vùng hạch nhân - RNA nhân nhỏ (small nuclear RNA hay snRNA) thành phần splicesome: máy phân tử cắt intron khỏi pre-mRNA nhân Ngồi cịn có RNA khác khơng mã hóa protein với biểu mức thấp Song song với cịn có gene mã hóa cho protein tạo protein Gene mã hóa protein có đặc điểm làm cho protein ngƣời phong phú 1.1.2 Ứng dụng triển vọng nghiên cứu hệ gene ngƣời Hiện nay, hiểu biết hệ gene ngƣời đƣợc ứng dụng ngày mạnh mẽ nhiều lĩnh vực y - sinh học pháp lý Kết hợp với khoa học công nghệ đại, nhiều bệnh tật di truyền đƣợc phát chữa trị Đặc biệt, bệnh liên quan đến đến đột biến bất thƣờng nhiễm sắc thể gây hội chứng nhƣ Down, Turner, Klinefelter, Edwards, … đƣợc phát sớm thai kì (Glenn cs, 2012; Joy cs, 2012) Trên sở tìm phƣơng pháp sàng lọc, chữa trị nhằm sinh thể khỏe mạnh Bên cạnh đó, liệu pháp gene kỹ thuật sử dụng gene để ngăn ngừa điều trị bệnh tật Một số hƣớng nghiên cứu liệu pháp gene nhƣ: Thay gene bệnh, gene đột biến gene khỏe mạnh, làm bất hoạt gene đột biến có sai chức năng, đƣa gene vào thể nhằm chống lại bệnh Liệu pháp gene hƣớng điều trị đầy hứa hẹn cho bệnh di truyền, ung thƣ số bệnh truyền nhiễm virus Hiện nay, liệu pháp gene đƣợc ứng dụng việc chữa trị số bệnh nhƣ: Parkinson (Nikhil, 2007), bệnh ung thƣ (Kenneth, 1994), bệnh suy giảm miễn dịch (Hacein-Bey-Abina cs, 2003) Các trình tự lặp lại ngẫu nhiên hệ gene ngƣời (Short Tandem Repeat STR) đƣợc sử dụng lĩnh vực y sinh học, pháp lý Đây đoạn lặp ngắn, số lần lặp lại đặc trƣng cho cá thể Nhờ STR đƣợc sử dụng việc nhận dạng cá thể ngƣời, truy tìm tội phạm xác định mối quan hệ huyết thống gia đình (Christian cs, 2001) Hƣớng nghiên cứu xác định đa hình gene, tần suất mối liên quan đa hình gene với tính trạng bệnh tật đặc trƣng hƣớng nghiên cứu đƣợc đặc biệt quan tâm Dự án Hapmap quốc tế đƣợc thực hợp tác nhà khoa học từ nhiều nƣớc, nhƣ: Nhật Bản, Anh, Canada; Trung Quốc, Nigeria Mỹ (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov) dự án tiêu biểu cho hƣớng nghiên cứu 1.2 Nghiên cứu, giải mã gene tài thể thao 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới Bản đồ gene ngƣời liên quan đến thành tích thể thao đƣợc Wolfarth cộng bắt đầu có báo cáo định kỳ năm lần từ năm 2000 Báo cáo cập nhật thống kê cơng trình nghiên cứu khắp giới nhiều vấn đề liên quan nhƣ: bền vững hệ thống tim mạch, sức bền VĐV đỉnh cao, sức mạnh bắp, tính trạng liên quan đến thành tích thể thao khác Báo cáo xuất vào năm 2000 (gần nhƣ lúc với công bố thảo hệ gene ngƣời) 29 vị trí gene có liên quan đến thành tích thể thao VĐV Đến năm 2004 số lƣợng gene tăng lần với 140 vị trí gene nhiễm sắc thể thƣờng, vị trí gene nhiễm sắc thể giới tính 16 vị trí gene hệ gene ty thể Đến năm 2006 - 2007 có tổng số 221 vị trí gene nhiễm sắc thể thƣờng nhiễm sắc thể giới tính X, 18 vị trí gene hệ gene ty thể Bảng 1.1 cho ta thấy quan tâm giới khoa học lĩnh vực - Ở nhóm (nhóm VĐV thi đấu mơn thể thao cần lợi sức mạnh/sức nhanh) có mối tƣơng quan mạnh kiểu gene RR thành tích thể thao Nhƣ vậy, việc lựa chọn VĐV ban đầu để đào tạo tốt Đây lựa chọn “may mắn” tố chất nhanh/mạnh VĐV tuyển chọn đƣợc thể rõ dễ đánh giá - Ở nhóm (nhóm VĐV thi đầu mơn thể thao cần lợi sức bền) kiểu gene khơng tn theo giả thuyết đặt Nguyên nhân bắt nguồn từ việc tuyển chọn VĐV để đào tạo việc định hƣớng VĐV viên chạy cự ly chƣa phù hợp Ví dụ: VĐV Nguyễn Văn Lai vừa chạy cự ly dài (5000 m, 10000 m) vừa chạy cự ly trung bình (1500 m) Nếu so sánh VĐV với VĐV Dƣơng Văn Thái (HCV Sea games 27, nội dung chạy 1500 m) có kiểu gene RR VĐV Nguyễn Văn Lai nên chạy cự ly 1500 m phù hợp (đây nhận xét phân tích độc lập gene ACTN3 R577X) Khi tham khảo nghiên cứu Shang cs (2010) thấy kiểu gene ACTN3 XX có mối liên quan đến thành tích VĐV nữ khơng rõ ràng VĐV nam Trung Quốc Tóm lại, cần lƣu ý liệu quan sát đƣợc từ nhóm nhỏ VĐV tiêu biểu coi nhận xét mang tính tƣơng đối Đây chƣa phải kết luận cuối nhóm nghiên cứu Dù vậy, nhận xét nên đƣợc lƣu ý khuyến cáo sử dụng để tham khảo thêm trình tuyển chọn đào tạo VĐV thể thao đỉnh cao Việt Nam nhƣ lƣu ý nghiên cứu mở rộng Chúng muốn nhấn mạnh việc tìm đặc trƣng kiểu gene tần số kiểu gene nhƣ xây dựng đƣợc chƣơng trình đào tạo phù hợp với đặc điểm thể chất (dựa đặc điểm di truyền ngƣời Việt Nam) chìa khóa quan trọng để thể thao Việt Nam phát triển hội nhập với giới Muốn làm đƣợc điều này, thiết nghĩ nên có phối hợp chặt chẽ mang tính chiến lƣợc nghiên cứu, đào tạo huấn luyện (sƣ phạm) kết hợp với nghiên cứu di truyền nhóm VĐV 83 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu đề tài đƣợc trình bày phần cho phép chúng tơi rút số kết luận nhƣ sau: Đã tách chiết thành công DNA tổng số từ mẫu tế bào niêm mạc miệng mẫu máu khô thẻ FTA đối tƣợng nghiên cứu Mẫu DNA thu đƣợc có chất lƣợng tốt, khơng bị nhiễm, khơng đứt gãy, đủ điều kiện phục vụ nghiên cứu Đã xác định đƣợc kiểu gene ACTN3 R577X 34 VĐV bơi lội, 54 VĐV điền kinh 40 mẫu đối chứng phƣơng pháp RFLP-PCR Đã xác định đƣợc kiểu gene ACE I/D 34 VĐV bơi lội, 54 VĐV điền kinh 40 mẫu đối chứng phƣơng pháp PCR điện di gel agarose Bƣớc đầu phân tích tần số kiểu gene ACE I/D ACTN3 R577X nhóm đối tƣợng nghiên cứu, bao gồm: nhóm VĐV thi đấu mơn cần lợi sức nhanh/mạnh; nhóm VĐV thi đấu mơn cần lợi sức bền nhóm đối chứng 84 ĐỀ XUẤT, KIẾN NGHỊ Đề xuất hƣớng nghiên cứu chuyên sâu Dựa kết thu đƣợc thực đề tài, đồng thời tham khảo nghiên cứu khác giới, chúng tơi xin có kiến nghị cho hƣớng nghiên cứu nhƣ sau: - Mở rộng quy mơ nghiên cứu: Ứng dụng quy trình nghiên cứu đƣợc xây dựng từ kết đề tài số lƣợng mẫu VĐV nhóm đối chứng lớn hơn, với tiêu chí đánh giá tuyển chọn rõ ràng; số sinh lý đối tƣợng nghiên cứu, nhƣ VO2 max; nhịp tim tối đa/tối thiểu; khả phản xạ đƣợc thu thập để xác định mối tƣợng quan chúng với kiểu gene nghiên cứu - Mở rộng hướng nghiên cứu: Mở rộng nghiên cứu gene khác, đƣợc xác định khẳng định cơng trình nghiên cứu giới có ảnh hƣởng đến khả hoạt động thể lực ngƣời - Xây dựng quy trình tuyển chọn đào tạo VĐV hồn chỉnh: sử dụng hài hịa hiệu thông tin di truyền, sinh lý tâm lý VĐV làm tiêu chí tuyển chọn Kiến nghị - Các đơn vị quản lý cần tập trung nhóm nghiên cứu mạnh gồm nhà di truyền, sinh học phân tử, sinh học thể thao, giải phẫu tâm lý để phát triển theo hƣớng đẩy mạnh nghiên cứu ứng dụng gene công tác tuyển chọn vận động viên cách toàn diện - Cần phối kết hợp với đơn vị nghiên cứu chuyên sâu công nghệ gene sinh học thể thao - Ban hành văn phù hợp với giai đoạn để tạo điều kiện thuận lợi công tác triển khai - Nâng cao nhận thức huấn luyện viên ý nghĩa hỗ trợ tích cực việc ứng dụng công nghệ gene công tác tuyển chọn vận động viên 85 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alvarez R, Terrados N, Ortolano R (2000) Genetic variation in the reninangiotensin system and athletic performance Eur J Appl Physiol 82: 117-120 Amir O, Amir R, Yamin C, Attias E, Eynon N (2007) The ACE deletion allele is associated with Israeli elite endurance athletes Exp Physiol 92: 881– 886 Berk BC, Vekshtein V, Gordon HM and Tsuda T (1989) Angiotensin IIstimulated protein synthesisin cultured vascularsmooth muscle cells Hypertension 13: 305-314 Bouchard C, Perusse L, Leblanc C, Tremblay A and Theriault G (1988) Inheritance of the amount and distribution of human body fat Int J Obes 12: 205-215 Bohn M, Berge KE, Bakken A, Erikssen J, Berg K (1993) Insertion/deletion (I/D) polymorphism at the locusfor angiotensin I-converting enzyme and myocardial infarction Clin Genet 44: 292-297 Bray MS, Hagberg JM, Perusse L, Roth SM, Wolfarth B, Bouchard C (2007) The human gene map for performance and health related fitness phenotype the 2007 Med Sci Sports Exerc 41: 35-73 Cambien F, Poirier O, Lecerf L, Evans A, Cambou J, Arveiler D (1992) Deletion polymorphism in the gene of angiotensin converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infraction Nature 359: 641–644 Claude B, Eric PH (2011) The Encyclopaedia of Sports Medicine: An IOC Medical Commission Publication Genetic and Molecular Aspects of Sports Performance Christian M, Ruitberg, Dennis J, Reeder, Butler JM (2001) STRBase: a short tandem repeat DNA database for the human identity testing community Nucleic Acids Research 29(1): 320-322 10 Day SH, Gohlke P, Dhamrait SS, Williams AG (2001) No correlation between circulating ACE activity and VO2 max or mechanical efficiency in women Eur J Appl Physiol 99: 11-18 86 11 Druzhevskaya AM, Ahmetov II, Astratenkova IV, Rogozkin VA (2008) Association of the ACTN3 polymorphism with power athlete status in Russians Eur J Appl Physiol 103: 631-634 12 Dunham I, Bernstein A, Birney SF, Dunham PJ, Green CA, Gunter F, Snyder CB, Frietze S, Harrow J, Kaul R, Khatun J, Lajoie BR, Landt SG, Lee BK, Pauli F, Rosenbloom KR, Sabo P, Safi A, Sanyal A, Shoresh N, Simon JM, Song L, Trinklein N D, Altshuler RC, Birney E, Brown JB, Cheng C, Djebali S, Dong X (2012) An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome Nature 489 (7414): 57–74 13 Elizabeth Pennisi (2012) ENCODE Project Writes Eulogy For Junk DNA Science 337 (6099): 1159–1160 14 Fallahi AA, Ravasi AA, Farhud DD (2011) Genetic Doping and Health Damages Iranian J Publ Health 40(1): 1-14 15 Fang Ma, Yu Yang, Xiangwei Li, Feng Zhou, Cong Gao, Mufei Li, Lei Gao (2013) The Association of Sport Performance with ACE and ACTN3 Genetic Polymorphisms: A Systematic Review and Meta-Analysis PLOS ONE 8(1), e54685 16 Gayagay G, Yu B, Hambly B, Boston T, Hahn A, Celermajer DS, Trent RJ (1998) Elite endurance athletes and the ACE I allele – the role of genes in athletic performance Hum Genet 103:48-50 17 Gatorade Sport Science Institute (2001) Genes And Sport: Are Your Parents responsible For Your Wins And Losses Sports Science Exchange 14 18 Geisterfer AA, Peach MJ and Owens GK (1988) Angiotensin IIinduces hypertrophy, not hyperplasia, of cultured rat aortic smooth muscle cells Circ Res 62: 749-756 19 Glenn EP, Edward MK, Geralyn M L-M, James EH, Louis MN, Mathias E, Dirk vdB, Allan TB, Cosmin D, Wayne WG, Stanley FN, Jacob AC (2011) DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation study Genetics in Medicine 13: 913–920 87 20 Giuseppe L, Umile GL, Nicola M (2009) Genetics and sports British Medical Bulletin 93: 27–47 21 Ginevičienė V, Pranckevičienė E, Milašius K, Kučinskas V (2010) Relating fitness phenotypes to genotypes in Lithuanian elite athletes Acta Medica Lituanica 17(1-2): 1-10 22 Gordon SE, Davis BS, Carlson CJ and Booth FW (2001) ANG IIisrequired for optimal overload-induced skeletal muscle hypertrophy Am J Physiol Endocrinol Metab 280: 150-15 23 Hopkins WG (2001) Genes and training for athletic performance Sportscience 5(1) 24 Hagberg JM, Ferrell RE, McCole SD, Wilund, KR & Moore GE (1998) VO2 max is associated with ACE genotype in postmenopausal women Journal of applied Physiology 85(5): 1842-1846 25 Ildus IA and Olga NF (2012) Sports genomics: Current state of knowledge and future directions Cell Mol Excerc Physiol 1(1) 26 Ian Mayne (2006) Examination of the ACE and ACTN3 Genes in UTC Varsity Athletes and Sedentary Students Departmental Honors Thesis, The University of Tennessee at Chattanooga Biology 27 International Human Genome Sequencing Consortium (2004) Finishing the euchromatic sequence of the human genome Nature 431 (7011): 931–45 28 International Human Genome Sequencing Consortium (2011) Initial sequencing and analysis of the human genome Nature 409 (6822): 860–921 29 James SS (2011) Do Genes Determine Champions? Sports Science Exchange 14 (4) 30 John MB (2011) Advanced topics in forensic DNA typing: Methodology Elsevier 31 Joy DA Delhanty, Darren KG, Alan HH, Joyce H, Glenn HGA, Math HEC Pieters, Robert ML Winston (1993) Detection of aneuploidy and chromosomal mosaicism in human embryos during preimplantation sex determination by fluorescent in situ hybridisation Hum Mol Genet (8): 1183-1185 88 32 Ken Waters (2007) Molecular Genetics Stanford Encyclopedia of Philosophy (3) 33 Kenneth W Culver (1994) Gene therapy for cancer Trends in Genetics 10 (5): 174–178 34 Lisa Gannett (2008) The Human Genome Project Stanford Encyclopedia of Philosophy (3) 35 Lindpaintner K, Pfeffer MA, Kreutz R, Stampfer MJ, Grodstein F, LaMotte F, Buring J and Hennekens CH (1995) A prospective evaluation of an angiotensin converting - enzyme gene polymorphism and the risk of ischemic heart disease N Engl J Med 332: 706-711 36 Nazarov IB, Woods DR, Montgomery HE, Shneider OV, Kazakov VI, Tomilin NV, Rogozkin VA (2001) The angiotensin converting enzyme I/D polymorphism in Russian athletes Eur J Hum Genet 9: 797-801 37 Niemi AK, Majamaa K (2005) Mitochondrial DNA and ACTN3 geneotypes in Finnish elite endurance and sprint athletes Eur J Hum Genet 13: 965-969 38 Nikhil S (2007) Gene Therapy for Parkinson's, Scientific American Mind 18: 12 39 North KN, Yang N, Wattanasirichaigoon D, Mill M, Easteal S, Beggs AH (1999) A common nonsense mutation results in α-actinin-3 deficiency in the general population Nature Genetics 21: 353-354 40 Maes HH, Beunen GP, Vlietinck RF, Neale MC, Thomis M, Vanden EB, Lysens R, Simons J, Derom C and Derom R (1996) Inheritance of physical fitness in 10-yr-old twins and their parents Med Sci Sports Exerc 28: 14791491 41 McBride TA (2006) AT1 receptors are necessary for eccentric traininginduced hypertrophy and strength gainsin ratskeletal muscle Exp Physiol 91: 413-421 42 Mills M, Yang N, Weinberger R, Vander Woude DL, Beggs AH, Easteal S, North K (2001) Differential expression of the actin-binding proteins, α-actinin-2 89 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy Human Molecular Genetics 10(13): 1335-1346 43 Miettinen HE, Korpela K, Hamalainen L, Kontula K (1994) Polymorphisms of the apolipoprotein and angiotensin converting enzyme genesin young North Karelian patients with coronary heart disease Hum Genet 94: 189-192 44 Moran CN, Scott RA, Wilson RH, Georgiades E, Goodwin W, Wolde B, Pitsiladis YP (2004) Increased frequency of an ACE polymorphism in Ethiopian elite marathon runners Med Sci Sports Exerc 36(5): 259 45 Murphey LJ, GainerJV, Vaughan DE, Brown NJ (2000) Angiotensinconverting enzyme insertion/deletion polymorphism modulatesthe human in vivo metabolism of bradykinin Circulation 102(8): 829-832 46 Myerson S, Hemingway H, Budget R, Martin J, Humphries S, Montgomery H (1999) Human angiotensin I-converting enzyme gene and endurance performance J Appl Physiol 87(4): 1313-1316 47 Rankinen T, Wolfarth B, Simoneau JA, Maier-Lenz D, Rauramaa R, Rivera MA, Boulay MR, Chagnon YC, Pérusse L, Keul J, Bouchard C (2000) No association between the angiotensin-converting enzyme ID polymorphism and elite endurance athlete status J Appl Physiol 88(5): 1571-1575 48 Roth SM, Walsh S, Liu D, Metter EJ, Ferrucci L, Hurley BF (2008) The ACTN3 R577X nonsense allele is under-represented in elite-level strength athletes Eur J Hum Genet 16(3): 391-394 49 Quinn LS, Ong LD, Roeder RA (1990) Paracrine control of myoblast proliferation and differentiation by fibroblasts Dev Biol 140(1): 8-19 50 Hacein-Bey-Abina S, von Kalle C, Schmidt M, Le Deist F, Wulffraat N, McIntyre E, Radford I, Villeval JL, Fraser CC, Cavazzana-Calvo M, Fischer A (2003) A Serious Adverse Event after Successful Gene Therapy for X-Linked Severe Combined Immunodeficiency N Engl J Med 348(3): 255-256 90 51 Santiago C, González-Freire M, Serratosa L, Morate FJ, Meyer T, Gómez-Gallego F, Lucia A (2008) ACTN3 genotype in professional soccer players British Journal of Sports Medicine 42:71-73 52 Samani NJ, O'Toole L, Martin D, Rai H, Fletcher S, Lodwick D, Thompson JR, Morice AH,Channer K, Woods KL (1996) Insertion/deletion polymorphism in the angiotensin-converting enzyme gene and risk of and prognosis after myocardial infarction J Am Coll Cardiol 28(2): 338-344 53 Scanavini D, Bernardi F, Castoldi E, Conconi F, Mazzoni G (2002) Increased frequency of the homozygous II ACE genotype in Italian Olympic endurance athletes Eur J Hum Genet 10(10): 576-577 54 Scott RA, Moran C, Wilson RH, Onywera V, Boit MK, Goodwin WH, Gohlke P, Payne J, Montgomery H, Pitsiladis YP (2005) No association between Angiotensin Converting Enzyme (ACE) gene variation and endurance athlete status in Kenyans Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 141(2):169-175 55 Sessa F, Chetta M, Petito A, Franzetti M, Bafunno V, Pisanelli D, Sarno M, Iuso S, Margaglione M (2011) Gene polymorphisms and sport attitude in Italian athletes, Genet Test Mol Biomarkers 15(4): 285-290 56 Shang X, Huang C, Chang Q, Zhang L, Huang T (2010) Association between the ACTN3 R577X polymorphism and female endurance athletes in China Int J Sports Med 31(12): 913–916 57 Sturrocka ED, Nateshb R, van Rooyena JM, Acharyab KR (2004) Structure of angiotensin I-converting enzyme Cell Mol Life Sci 61(21): 2677–2686, 58 Tanriverdi H, Evrengul H, Tanriverdi S,Turgut S, Akdag B, Kaftan HA, Semiz E (2005) Improved Endothelium Dependent Vasodilation in Endurance Athletes and Its Relation With ACE I/D Polymorphism Circ J 69(9): 11051110 59 Tom S and Andrew PR (2010) Human Molecular Genetics Garland Science (4) ISBN-10: 1-85996-202-5 91 60 Tsianos G, Sanders J, Dhamrait S, Humphries S, Grant S, Montgomery H (2004) The ACE gene insertion/deletion polymorphism and elite endurance swimming Eur J Appl Physiol 92(3): 360-362 61 Van Damme R, Wilson RS, Vanhooydonck B, Aerts P (2002) Performance constraints in decathletes Nature 415(6873): 755 – 756 62 Vincent B, De Bock K, Ramaekers M, Van den Eede E, Van Leemputte M, Hespel P, Thomis MA (2007) ACTN3 (R577X) genotype is associated with fiber type distribution Physiol Genomics 32(1): 58-63 63 Woods D, Hickman M, Jamshidi Y, Brull D, Vassiliou V, Jones A, Humphries S, Montgomery H (2001) Elite swimmers and the D allele of the ACE I/D polymorphism Hum Genet 108(3): 230-232 64 Yang N, MacArthur DG, Gulbin JP, Hahn AG, Beggs AH, Easteal S, North K (2003) ACTN3 Geneotype is Associated with Human Elite Athletic Performance Am J Hum Genet 73(3): 627-631 65 Yang N, MacArthur DG, Wolde B, Onywera VO, Boit MK, Lau SY, Wilson RH, Scott RA, Pitsiladis YP, North K (2007) The ACTN3 R577X polymorphism in East and West African athletes Med Sci Sports Exerc 39(11): 1985-1988 66 http://ghr.nlm.nih.gov/gene/MSTN 67.http://www.pantherdb.org/chart/summary/pantherChart.jsp?filterLevel=1&ch artType=1&listType=1&type=5&species=Homo%20sapiens 68 http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov 92 PHỤ LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu, giải mã hệ gene ngƣời 1.1.1 Giới thiệu chung hệ gene ngƣời 1.1.2 Ứng dụng triển vọng nghiên cứu hệ gene ngƣời 1.2 Nghiên cứu, giải mã gene tài thể thao 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 17 1.2.3 Ảnh hƣởng di truyền đến sức bền, sức nhanh sức mạnh VĐV 17 1.2.4 Ảnh hƣởng di truyền tới cơ, dây chằng gân 23 1.3 Gene ACE 25 1.3.1 Cấu trúc gene ACE 25 1.3.2 Đặc điểm chức gene ACE 26 1.3.3 Đa hình gene ACE I/D mối liên quan đến tiềm thể thao 26 1.4 Gene ACTN3 31 1.4.1 Cấu trúc gene ACTN3 31 1.4.2 Đặc điểm chức gene ACTN3 32 1.4.3 Đa hình gene ACTN3 R577X mối liên quan đến tiềm thể thao 34 1.5 Các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc sử dụng để xác định đa hình gene ACE ACTN3 36 1.5.1 Kỹ thuật PCR 36 1.5.2 Kỹ thuật RFLP-PCR 38 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu nghiên cứu 39 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 39 2.1.2 Dụng cụ thiết bị 39 2.1.3 Sinh phẩm, hóa chất tiêu hao 40 2.2 Quy trình nghiên cứu 41 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 42 93 2.3.1 Phƣơng pháp thu mẫu tế bào niêm mạc miệng 42 2.3.2 Phƣơng pháp thu mẫu tế máu khô thẻ FTA 42 2.3.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA 43 2.3.4 Phƣơng pháp PCR 45 2.3.5 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR 47 2.3.6 Phƣơng pháp RFLP-PCR 47 2.3.7 Phƣơng pháp điện di 49 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 Tách chiết DNA tổng số 51 3.1.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu khô thẻ FTA 51 3.1.2 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu niêm mạc miệng 52 3.2 Kết phân tích kiểu gene ACE 53 3.2.1 Kết khuếch đại gene ACE I/D với cặp mồi đặc hiệu 53 3.2.2 Giải trình tự để kiểm tra sản phẩm khuếch đại gene ACE 58 3.2.3 Phân tích tần số kiểu gene ACE I/D nhóm đối tƣợng nghiên cứu 61 3.3 Kết phân tích kiểu gene ACTN3 68 3.3.1 Khuếch đại vùng exon 16 gene ACTN3 thông qua phản ứng PCR 68 3.3.2 Tinh sản phẩm PCR 69 3.3.3 Phân tích RFLP-PCR vùng exon 16 gene ACTN3 70 3.3.4 Phân tích tần số kiểu gene ACTN3 nhóm đối tƣợng nghiên cứu 77 KẾT LUẬN 84 ĐỀ XUẤT, KIẾN NGHỊ 84 Đề xuất hƣớng nghiên cứu chuyên sâu 85 Kiến nghị 85 TÀI LIỆU THAM KHẢO 86 94 DANH MỤC BẢNG CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bảng 1 Số lƣợng nghiên cứu gene có liên quan đến thành tích thể thao Bảng Ảnh hƣởng gene tới đặc điểm thể 10 Bảng Ký hiệu, tên đầy đủ vị trí gene có liên quan tới khả thể thao 13 Bảng Những gene ảnh hƣởng đến sức bền VĐV .18 Bảng Những gene ảnh hƣởng đến sức nhanh sức mạnh VĐV 21 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bảng Các cặp mồi đƣợc thiết kế để khuếch đại gene ACE I/D .40 Bảng 2 Các cặp mồi đƣợc thiết kế để khuếch đại gene ACTN3 R577X 41 Bảng Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gene ACE I/D .45 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene ACE I/D .45 Bảng Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gene ACTN3 R577X 46 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene ACTN3 R577X 46 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng cắt Enzyme giới hạn DdeI 49 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng Kết xác định kiểu gene ACE I/D VĐV điền kinh .55 Bảng Kết xác định kiểu gene ACE I/D VĐV Bơi lội 56 Bảng 3 Kết xác định kiểu gene ACE I/D mẫu đối chứng .57 Bảng Phân bố kiểu gene ACE I/D tần số alen I; D 62 Bảng Thành tích kiểu gene ACE số VĐV tiêu biểu 64 Bảng Kết xác định kiểu gene ACTN3 R577X VĐV điền kinh 72 Bảng Kết xác định kiểu gene ACTN3 R577X VĐV Bơi lội 73 Bảng Kết xác định kiểu gene ACTN3 R577X mẫu đối chứng 74 Bảng Phân bố tần số kiểu gene ACTN3 R577X tần số alen R/X 77 Bảng 10 Thành tích kiểu gene ACTN3 số VĐV tiêu biểu .80 95 DANH MỤC HÌNH CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1 Phân loại gene ngƣời theo chức protein đƣợc dịch mã .6 Hình Sơ đồ tổ chức cấu trúc gene ngƣời Hình Bản đồ bao gồm tồn gene có mối liên hệ đến khả thể thao 12 Hình Những gene ty thể có mối liên hệ với kiểu hình ảnh hƣởng đến khả thể thao 13 Hình Vị trí gene ACE nằm nhiễm sắc thể 17 25 Hình Cấu trúc khơng gian Angiotensin converting enzyme 26 Hình Những tác động gene ACE hệ thống Renin-Angiotensin 28 Hình Vị trí gene ACTN3 nhiễm sắc thể số 11 (11q13.2) 32 Hình Sự tham gia gene ACTN3 vào cấu trúc sợi 33 Hình 10 Nguyên lý phản ứng PCR .37 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình Quy trình thực đề tài nghiên cứu 41 Hình 2 Vị trí điểm cắt enzyme DdeI trình tự gene ACTN3 48 Hình Phân tích điểm cắt enzyme giới hạn DdeI gene ACTN3 .50 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách từ mẫu máu thẻ FTA 52 Hình Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách từ mẫu niêm mạc miệng .52 Hình 3 Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gene ACE 54 Hình Trình tự alen I alen D gene ACE 59 Hình Kết giải trình tự alen I alen D mẫu B9 59 Hình Kết giải trình tự gene ACE mẫu B1 60 Hình Kết giải trình tự gene ACE mẫu K12 .61 Hình Biểu đồ phân bố tần số kiểu gene ACE I/D 62 Hình Điện di đồ sản phẩm PCR vùng exon 16 gene ACTN3 69 Hình 10 Điện di đồ sản phẩm PCR sau tinh .70 Hình 11 Điện di đồ sản phẩm sau cắt sản phẩm PCR enzyme giới hạn DdeI 71 Hình 12 Kết giải trình tự gene ACTN3 R577X mẫu B11 75 Hình 13 Kết giải trình tự gene ACTN3 R577X mẫu B9 76 Hình 14 Kết giải trình tự gene ACTN3 R577X mẫu K18 76 Hình 15 Biểu đồ phân bố tần số kiểu gene ACTN3 R577X 78 96 97 ... hƣởng đa hình gene tới thành tích thể thao vận động viên - Xác định kiểu gene ACTN3 R577X số vận đông viên điền kinh bơi lội kỹ thuật PCR- RFLP Bƣớc đầu phân tích phân bố đa hình gene nhóm vận động. .. viên điền kinh bơi lội Việt Nam? ?? MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Xác định kiểu gene ACE I/D số vận đông viên điền kinh bơi lội kỹ thuật PCR Bƣớc đầu phân tích phân bố đa hình gene nhóm vận động viên khác... hƣởng gene hiệu suất thể thao VĐV ngƣời Việt Nam Chính vậy, tơi lựa chọn đề tài nghiên cứu: ? ?Xác định đa hình kiểu gene ACE I/D kỹ thuật PCR ACTN3 R577X kỹ thuật PCR- RFLP số vận động viên điền