B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO B NÔNG NGHIP VÀ PTNT HC VIN NỌNG NGHIP VIT NAM DƠNG XUÂN TÚ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CH THỊ PHÂN TỬ DNA TRONG CHN TẠO GING LÚA THƠM KHÁNG BNH BẠC LÁ Chuyên ngành: Di truyền và chn ging cây trồng Mư s: 62 62 01 11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hà Nội, năm 2015 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Phan Hữu Tôn Phản biện 1: PGS.TS. Phạm Văn Cường Học Viện Nông nghiệp Việt nam Phản biện 2: TS. Khuất Hữu Trung Viện Di truyền Nông nghiệp Phản biện 3: PGS.TS. Lã Tuấn Nghĩa Trung Tâm Tài nguyên thực vật Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi: giờ ngày tháng năm 2015 Có thể tìm hiểu Luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Thư viện Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm 1 M ĐU 1. Tính cp thit ca đề tƠi Phát triển m rộng diện tích lúa thm chất lượng cao nhằm tăng hiệu quả sản xuất lƠ hướng lựa chọn ưu tiên trong sản xuất lúa gạo của Việt Nam hiện nay. Bộ giống lúa thm, chất lượng cho sản xuất  Việt Nam còn thiếu cả về số lượng vƠ chất lượng, năng suất thấp, nhiễm bạc lá, hiệu quả sản xuất thấp, khó m rộng diện tích. Công tác chọn tạo giống lúa của ta vẫn chủ yếu lƠ phưng pháp truyền thống dựa trên chọn lọc kiểu hình nên rất khó chọn được giống lúa mới mang đồng thi nhiều tính trạng mong muốn. Hiện nay, chỉ thị phơn tử DNA đã được sử dụng như lƠ một công cụ hỗ trợ có hiệu quả trong các chưng trình chọn tạo giống cơy trồng, có thể chọn được giống mang nhiều tính trạng mong muốn trong cùng thi điểm, rút ngắn thi gian chọn tạo. Do vậy, nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phơn tử DNA đồng thi chọn kiểu gen mùi thm vƠ kháng bệnh bạc lá để tạo ra được những giống lúa thm mới, kháng tốt với bệnh bạc lá đáp ứng được yêu cầu cho sản xuất lúa thm chất lượng cao hiện nay lƠ cần thiết. 2. Mục tiêu ca đề tƠi Lựa chọn chỉ thị phơn tử liên kết với gen mùi thm vƠ gen kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn gơy bệnh bạc lá phổ biến có độ chính xác cao sử dụng trong lai tạo vƠ chọn lọc giống lúa thm kháng bệnh bạc lá cho các tỉnh phía Bắc Chọn tạo được một số dòng lúa thm kháng bệnh bạc lá (mang gen thm vƠ 1 hoặc 2 gen kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn gơy bệnh bạc lá), năng suất khá cho phát triển sản xuất vƠ lƠm vật liệu cho công tác lai tạo tiếp. 3. Ý nghĩa khoa học vƠ thực tin 3.1. Ý nghĩa khoa học Phưng pháp phơn tích di truyền từ bố mẹ đến thế hệ F2 để xác định chỉ thị phơn tử DNA liên kết với gen mùi thm vƠ gen kháng bệnh bạc lá  cơy lúa, có độ chính xác cao để sử dụng cho lai tạo vƠ chọn lọc giống lúa thm, kháng bệnh bạc lá trên nguồn vật liệu hiện có: Chỉ thị 4 mồi ESP, IFAP, INSP vƠ EAP nhận diện gen thm fgr với độ chính xác 2 đến 94%, chỉ thị Nbp181 nhận diện gen kháng Xa4 với độ chính xác đến 97%, chỉ thị RG556 nhận diện gen kháng xa5 với độ chính xác đến 76% vƠ chỉ thị P3 nhận diện gen kháng Xa7 với độ chính xác đến 92% giữa gen kháng tính kháng. Khảng định hiệu quả của phưng pháp lai tạo vƠ chọn lọc kiểu hình kết hợp với sử dụng chỉ thị phơn tử DNA chọn kiểu gen mục tiêu (MAS) trong chọn tạo giống lúa thm kháng bệnh bạc lá. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Chọn tạo được 15 dòng lúa thm mới, mang 1 – 2 gen kháng bệnh bạc lá (trong các gen Xa4, xa5 vƠ Xa7), thể hiện kháng tốt với các chủng vi khuẩn gơy bệnh bạc lá phổ biến  các tỉnh phía Bắc. Các dòng lúa nƠy được sử dụng lƠm vật liệu lai tạo trong các chưng trình chọn giống lúa thm kháng bệnh bạc lá tiếp theo. Trong đó, 2 dòng lúa lƠ T7.19-2 (mang gen thm fgr vƠ gen kháng Xa7) vƠ dòng T25.82-3 (mang gen thm fgr vƠ gen kháng xa5) đáp ứng được mục tiêu chọn tạo về thi gian sinh trưng, năng suất, chất lượng, mùi thm vƠ kháng bệnh bạc lá sẽ được tiếp tục phát triển cho sản xuất tại các tỉnh phía Bắc trong thi gian tới. 4. Những đóng góp mới ca đề tƠi Lựa chọn được chỉ thị phơn tử DNA liên kết với gen mùi thm (fgr) vƠ gen kháng bệnh bạc lá (Xa4, xa5 vƠ Xa7) sử dụng cho chọn tạo giống lúa thm kháng bệnh bạc lá cho các tỉnh phía Bắc với độ chính xác đến 94% (đối với gen mùi thm fgr) vƠ đến 92% (đối với gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5 vƠ Xa7) Đã xác đinh được 12 mẫu giống lúa thm, chất lượng cao vƠ 12 mẫu giống lúa mang gen kháng bệnh bạc lá sử dụng lƠm bố mẹ cho các tổ hợp lai định hướng trong chọn tạo giống lúa thm, kháng bệnh bạc lá tại các tỉnh phía Bắc. Chọn tạo được 15 dòng lúa thm mới, đồng thi mang 1 – 2 gen kháng bệnh bạc lá phổ biến  các tỉnh phía Bắc. Các dòng lúa nƠy được sử dụng lƠm vật liệu mới cho lai tạo trong các chưng trình chọn giống lúa thm kháng bệnh bạc lá tiếp theo. Trong đó, 2 dòng lúa lƠ 3 T7.19-2 vƠ dòng T25.82-3 đáp ứng được mục tiêu chọn tạo sẽ được tiếp tục phát triển cho sản xuất tại các tỉnh phía Bắc trong thi gian tới. 5. Bố cục ca lun án Luận án chính gồm 137 trang: M đầu (5 tr); Tổng quan tƠi liệu (41 tr); Phưng pháp nghiên cứu (13 tr); Kết quả vƠ thảo luận (76 tr); Kết luận vƠ kiến nghị (2 tr). Phần danh mục tƠi liệu tham tham khảo (13 tr). Luận án có 39 bảng biểu, 18 hình, 13 phụ lục vƠ 3 công trình đã công bố vƠ một số hình ảnh minh họa. Chng 1. TNG QUAN TÀI LIU Bệnh bạc lá lƠ một trong những loại dịch hại nguy hiểm nhất đối với sản xuất lúa thm chất lượng cao, không thể sử dụng thuốc hóa học thông thưng để phòng trừ. Do vậy, sử dụng giống kháng đối với bệnh nƠy lƠ cách lựa chọn tốt nhất hiện nay. Bằng phưng pháp chọn lọc truyền thống thì rất khó để chọn tạo được giống lúa thm đồng thi kháng tốt với các chủng vi khuẩn gơy bệnh bạc lá. Hiện nay, phưng pháp chọn lọc truyền thống kết hợp với sử dụng chỉ thị phơn tử DNA chọn kiểu gen thm vƠ gen kháng với các chủng vi khuẩn gơy bệnh bạc lá sẽ giúp cho việc chọn tạo giống lúa thm kháng bệnh bạc lá hiệu quả hn. Các kết quả nghiên cứu về di truyền vƠ chỉ thị phơn tử liên kết với gen kiểm soát tính trạng mùi thm, tính kháng bệnh bệnh bạc lá trong cơy lúa đã được công bố  trong vƠ ngoƠi nước lƠ c s cho việc tiến hƠnh đề tƠi “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá” trên nguồn vật liệu cụ thể để chọn tạo giống lúa thm kháng bệnh bạc lá cho các tỉnh phía Bắc của Việt Nam. Chng 2. PHNG PHÁP NGHIÊN CU 2.1. Vt liu nghiên cu 2.1.1. Các dòng, giống lúa sử dụng làm vật liệu 33 mẫu giống lúa thm chất lượng; 18 dòng đẳng gen mang bản chất di truyền của giống IR24, chỉ khác nhau mang 1 – 2 gen kháng với bệnh bạc lá: Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, xa11 vƠ Xa21; giống lúa IR24 sử dụng lƠm đối chứng nhiễm chuẩn với bệnh bạc lá; Giống lúa Q5 vƠ KD18 sử dụng lƠm đối chứng không có mùi thm. 4 2.1.2. Các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá 4 chủng vi khuẩn: chủng 2B, chủng 3, chủng 4 vƠ chủng 5A được cung cấp bi Bộ môn Sinh học phơn tử vƠ Công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam 2.1.3. Các mồi chỉ thị phân tử sử dụng 31 cặp mồi SSR sử dụng trong phơn tích đa dạng di truyền vật liệu khi đầu; Các mồi chỉ thị liên kết với gen thm fgr: RM342, RM223, RG28, L06 vƠ BADH2 (4 mồi ESP, IFAP, INSP vƠ EAP); Các mồi chỉ thị liên kết với các gen kháng bệnh bạc lá  lúa Xa4, xa5 và Xa7. 2.2. Nội dung nghiên cu 2.2.1. Nội dung 1 Lựa chọn chỉ thị phơn tử liên kết với gen qui định mùi thm vƠ tính kháng với các chủng vi khuẩn gơy bệnh bạc lá lúa  các tỉnh phía Bắc 2.2.2. Nội dung 2 Đánh giá đa dạng di truyền tập đoƠn vật liệu lúa thm, kháng bệnh bạc lá 2.2.3. Nội dung 3 Lai tạo các tổ hợp lai định hướng tạo vật liệu cho chọn lọc dòng lúa mới theo mục tiêu 2.2.4. Nội dung 4 Sử dụng chỉ thị phơn tử chọn cá thể mang kiểu gen thm vƠ gen kháng bệnh bạc lá từ các thế hệ phơn ly, kết hợp với đánh giá kiểu hình để chọn dòng lúa mới theo mục tiêu 2.3. Đa điểm vƠ thi gian nghiên cu 2.3.1. Đa điểm nghiên cu Các thí nghiệm đánh giá vật liệu, lai tạo chọn dòng vƠ đánh giá dòng chọn trên đồng ruộng được thực hiện tại khu thí nghiệm đồng ruộng; các thí nghiệm về sinh học phơn tử được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học phơn tử; Phơn tích chất lượng hạt được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh lý – Sinh hóa vƠ Chất lượng nông sản của Viện Cơy lưng thực vƠ Cơy thực phẩm, Gia Lộc – Hải Dưng. 5 2.3.2. Thời gian nghiên cứu Các thí nghiệm của đề tƠi được thực hiện trong thi gian từ tháng 6/2010 đến 7/2014 (từ vụ mùa 2010 đến vụ xuơn 2014) 2.4. Phng pháp nghiên cu 2.4.1. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn vật liệu lúa thơm kháng bệnh bạc lá 2.4.1.1. Thí nghiệm đồng ruộng * Bố trí thí nghiệm: theo phưng pháp khảo sát tập đoƠn, 5m 2 /ô * Đánh giá các chỉ tiêu: dựa theo tiêu chuẩn “Đánh giá nguồn gen cơy lúa” của IRRI (1996). * Đánh giá Mùi thơm: Theo Nguyễn Thị Lang vƠ Bùi Chí Bửu (2004). Mỗi cá thể lấy 15 hạt được bóc vỏ trấu vƠ nghiền nhỏ sau đó đặt trong đĩa pettry. Mỗi hộp được cho vƠo 0,5 ml dung dịch KOH pha loãng (1,7%) sau đó đậy lại, đặt trong điều kiện 30 0 C trong 30 phút. Sau đó các hộp được m ra lần lượt để đánh giá mùi thm theo cảm quan với 3 mức: không thm, thm nhẹ vƠ thm. * Xử lý số liệu: Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm excel. 2.4.1.2. Đánh giá khả năng chống chịu với bệnh bạc lá trong điều kiện nhân tạo Phưng pháp lơy bệnh theo Furuya et al. (2003. Đánh giá mức kháng nhiễm theo chiều dƠi vết bệnh: Kháng (R): Chiều dƠi vết bệnh < 8cm; Nhiễm vừa (M): Chiều dƠi vết bệnh từ 8 - 12cm; Nhiễm nặng (S): chiều dƠi vết bệnh > 12cm. 2.4.1.3. Phân tích di truyền bằng sử dụng chỉ thị phân tử DNA * Tách chiết DNA: DNA được tách chiết vƠ tinh sạch theo phưng pháp CTAB của Doyle and Doyle (1990). * Phản ứng PCR: Theo phưng pháp của Chen et al. (2006) có cải tiến tùy theo chỉ thị. * Điện di sản phẩm PCR: được điện di trên gel polyacrylamide. Soi vƠ chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel DigiDoc-It. * Xử lí số liệu trong phân tích đa dạng di truyền: - Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo 6 công thức của Weir et al. (1996): PIC=1- Pi 2 . Trong đó P i lƠ tần số xuất hiện của alen thứ i. - Phơn tích hệ số tưng đồng di truyền vƠ xơy dựng cơy quan hệ di truyền theo chưng trình NTSYSpc 2.1 2.4.2. Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen qui định mùi thơm và tính kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá 2.4.2.1. Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen qui định mùi thơm Sử dụng các chỉ thị RG28, RM223, RM342, L06 vƠ BADH2 (4 mồi ESP, IFAP, INSP vƠ EAP). Kiểm tra di truyền của các chỉ thị vƠ độ chính xác của các chỉ thị liên kết với gen thm fgr vƠ mùi thm trên quần thể phơn ly F2 của một số tổ hợp lai giữa các giống lúa thm vƠ không thm để từ đó đưa ra kết luận cho lựa chọn 2.4.2.2. Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh bạc lá Sử dụng một số chỉ thị liên kết với các gen kháng với các chủng vi khuẩn gơy bệnh  Việt Nam: Npb 181 vƠ RM224 (gen Xa4), RG556 vƠ RM122 (gen xa5), P3 vƠ RM5509 (gen Xa7). Kiểm tra di truyền vƠ độ chính xác của các chỉ thị liên kết với gen kháng vƠ tính kháng trên quần thể phơn ly F2 của một số tổ hợp lai giữa giống lúa kháng vƠ nhiễm để từ đó đưa ra kết luận. 2.4.2.3. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phơn phối khi bình phưng ( 2 ) để kiểm định kiểu gen phơn ly trong quần thể F2 theo tỷ lệ phơn ly mong đợi - Độ chính xác của chỉ thị liên kết với gen mùi thm fgr = số cá thể hạt có mùi thm trong số cá thể được chọn kiểu gen thm/tổng số cá thể hạt có mùi thm - Độ chính xác của chỉ thị liên kết với gen kháng bệnh bạc lá = số cá thể mang tính kháng trong số cá thể được chọn kiểu gen kháng/tổng số cá thể mang tính kháng. 2.4.3. Lai tạo các tổ hợp lai định hướng tạo vật liệu cho chọn lọc dòng lúa mới theo mục tiêu * Phép lai đơn: Sử dụng các dòng, giống lúa thm lai với các dòng, giống lúa mang gen kháng bệnh bạc lá (Xa4, xa5 vƠ Xa7). * Lai kép (lai nhiều bố mẹ): Tạo ra F1 tiếp tục lai với nhau để tổng 7 hợp nhiều tính trạng của nhiều giống vƠo con lai. * Lai lại (backcross): Các dòng, giống lúa thm đang được trồng phổ biến nhưng thiếu gen kháng bệnh bạc lá (thể nhận) lai với dòng mang gen kháng bệnh bạc lá (thể cho). Sử dụng chỉ thị phơn tử xác định gen mục tiêu để xác định cơy nhận để hỗ trợ trong phép lai. 2.4.4. Sử dụng chỉ thị phân tử chọn cá thể mang kiểu gen thơm và gen kháng bệnh bạc lá từ các thế hệ phân ly, kết hợp với đánh giá kiểu hình để chọn dòng lúa mới theo mục tiêu - Chọn lọc theo phưng pháp phả hệ, kết hợp với sử dụng chỉ thị phơn tử chọn gen mục tiêu  các thế hệ sớm. Đối chứng lƠ giống lúa thm hiện trong sản xuất như HDT8, BT7. - Sử dụng chỉ thị phơn tử chọn các thể mang gen mục tiêu  trạng thái đồng hợp tử từ thế hệ sớm F2 – F3 vƠ kiểm tra lại  thế hệ F6 - Đánh giá vƠ chọn lọc kiểu hình theo mục tiêu  các thế hệ phơn ly từ F3 – F6. Chng 3. KT QU VÀ THO LUN 3.1. Lựa chọn ch th phơn tử liên kt với gen qui đnh mùi thm vƠ tính kháng với các chng vi khuẩn gơy bnh bc lá lúa  các tnh phía Bắc 3.1.1. Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen thơm ở cây lúa 3.1.1.1. Nhận diện gen thơm fgr trong tập đoàn vật liệu lúa thơm bằng các chỉ thị liên kết Một số chỉ thị phơn tử RG28, RM223, RM342, L06 vƠ BADH2 (4 mồi ESP, IFAP, INSP vƠ EAP) đã được công bố có liên kết với gen fgr qui định tổng hợp chất 2AP tạo mùi thm trong cơy lúa. Sử dụng các chỉ thị nƠy để nhận diện gen mùi thm fgr trong các mẫu giống lúa thm, kết quả cho thấy: Trong 33 giống lúa có mùi thm, kiểu gen thm fgr đồng hợp tử được nhận diện bằng chỉ thị RG28 lƠ 18 giống, chỉ thị RM342 lƠ 11 giống, chỉ thị RM223 lƠ 15 giống, chỉ thị L06 lƠ 21 giống vƠ chỉ thị BADH2 lƠ 33 lƠ giống. 3.1.1.2. Phân ly tính trạng mùi thơm ở thế hệ F2 của các tổ hợp lai giữa giống lúa thơm và không thơm Kết quả cho thấy: chỉ thị L06 vƠ BADH2 có độ tin cậy cao, cho tỷ 8 lệ phơn ly nhận dạng kiểu gen thm fgr trên quần thể phơn ly F2  cả 2 tổ hợp lai BT7 x Q5 vƠ HT1 x KD18 với được đưa ra được gần đúng với tỷ lệ phơn ly theo lý thuyết lƠ 1 : 2: 1. Kết quả phơn tích kiểu gen kết hợp với đánh giá mùi thm trong hạt của quần thể phơn ly F2  mỗi tổ hợp lai được đưa ra trong bảng 3.1. Những giống có mùi thm vƠ mùi thm nhẹ được xếp vƠo nhóm thm. Độ chính xác của chỉ thị liên kết với gen mùi thm fgr được tính bằng số cá thể hạt có mùi thm trong số cá thể được chọn kiểu gen thm trên tổng số cá thể hạt có mùi thm. Kết quả cho thấy: độ chính xác của chỉ thị RG28 lƠ 64% - 74%, chỉ thị RM342 lƠ 48% - 59%, chỉ thị RM223 lƠ 43% - 47%, chỉ thị L06 lƠ 78% - 79%, chỉ thị BADH2 lƠ 91% vƠ 94%. Như vậy, chỉ thị BADH2 có độ chính xác cao nhất trong nhận diện gen thm frg vƠ ổn định  cả 2 tổ hợp lai BT7 x Q5 vƠ HT1 x KD18. Bng 3.1. Phơn tích gen thm fgr bằng ch th phơn tử kt hợp vi đánh giá mùi thm trong ht  qun thể phơn ly F2 Ch th Kiểu gen Số cá thể Thm Thm nhẹ Không thm Chính xác (%) BT7 x Q5 160 24 10 126 RG28 FgrFgr 53 3 1 49 64 Fgrfgr 68 1 7 60 fgrfgr 39 20 2 17 RM342 FgrFgr 62 2 3 57 59 Fgrfgr 58 5 4 49 fgrfgr 40 17 3 20 RM223 FgrFgr 47 5 4 38 47 Fgrfgr 65 3 6 56 fgrfgr 48 16 0 32 L06 FgrFgr 52 0 1 51 79 Fgrfgr 67 2 4 61 fgrfgr 41 22 5 14 BADH2 FgrFgr 50 0 0 50 95 9 Ch th Kiểu gen Số cá thể Thm Thm nhẹ Không thm Chính xác (%) Fgrfgr 77 0 2 75 fgrfgr 33 24 8 1 HT1 x KD18 160 31 15 114 RG28 FgrFgr 37 2 5 30 74 Fgrfgr 70 4 1 65 fgrfgr 53 25 9 19 RM342 FgrFgr 25 3 3 19 48 Fgrfgr 85 11 7 67 fgrfgr 50 17 5 28 RM223 FgrFgr 58 8 6 44 43 Fgrfgr 75 10 2 63 fgrfgr 27 13 7 7 L06 FgrFgr 47 1 0 46 83 Fgrfgr 65 3 4 58 fgrfgr 48 27 11 10 BADH2 FgrFgr 30 0 2 28 92 Fgrfgr 80 1 1 78 fgrfgr 50 30 12 8 3.1.2. Nghiên cứu lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh bạc lá lúa 3.1.2.1. Phản ứng của các mẫu giống lúa vật liệu với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ biến ở các tỉnh phía Bắc Đánh giá phản ứng của các mẫu giống lúa vật liệu với 4 chủng vi khuẩn gơy bệnh bạc lá, kết quả được đưa ra như sau: Đối với 33 mẫu giống lúa thm, phần lớn  mức nhiễm đến nhiễm nặng với các chủng vi khuẩn gơy bệnh lơy nhiễm. Trong đó có 17 mẫu giống có phổ kháng nhiễm tưng tự với IR24 (nhiễm nặng), 16 mẫu giống còn lại có mức độ nhiễm thấp hn so với giống IR24. 10 Đối với các dòng lúa đẳng gen mang gen xa5, Xa7, Xa21 vƠ các tổ hợp 2 gen của những gen nƠy đều thể hiện tính kháng cao với các chủng vi khuẩn gơy bệnh. Mẫu giống mang gen Xa4 thể hiện mức nhiễm nhẹ với cả 4 chủng vi khuẩn. Giống IR24  mức nhiễm cao với vi khuẩn chủng 2B, chủng 3, chủng 4 vƠ  mức trung bình với chủng 5A. 3.1.2.2. Mức đa hình của một số chỉ thị trên giống lúa nhiễm và kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá Kiểm tra mức đa hình của các chỉ thị liên kết với gen kháng Xa4, xa5 vƠ Xa7 trên các mẫu giống lúa kháng vƠ nhiễm với các chủng vi khuẩn gơy bệnh bạc lá, kết quả cho thấy: chỉ thị Npb181 cho đa hình phơn biệt được các giống lúa nhiễm nặng (IR24, BT7) vƠ giống kháng cao (IRBB4); Chỉ thị RG556 cho đa hình phơn biệt các mẫu giống nhiễm nặng vƠ giống kháng cao (IRBB5); Đối với gen kháng Xa7, cả 2 chỉ thị chỉ thị P3 vƠ RM5509 cho đa hình phơn biệt phơn biệt được các mẫu giống nhiễm nặng (IR24, BT7) vƠ giống kháng cao (IRBB7). 3.1.2.3. Kiểm tra độ chính xác của chị thị liên kết với gen Xa4, xa5 và Xa7 ở quần thể F2 Chỉ thị Nbp181 được kiểm tra liên kết với gen kháng Xa4  tổ hợp lai BT7 x IRBB4 vƠ IR24 x IRBB4; Chỉ thị RG556 vƠ RM122 được kiểm tra liên kết với gen kháng xa5 trên tổ hợp lai HDT2 x IRBB5 vƠ IR24 x IRBB5; Chỉ thị P3 vƠ RM5509 được kiểm tra liên kết với gen kháng Xa7 trên tổ hợp lai D68-10 x IRBB7 vƠ IR24 x IRBB7. Phơn tích 160 cá thể F2  mỗi tổ hợp lai, sử dụng phưng pháp kiểm định “Khi bình phưng” ( 2 ) giữa tỷ lệ phơn ly kiểu gen theo lý thuyết vƠ tỷ lệ phơn ly kiểu gen thực tế được xác định bằng các mồi của chỉ thị. Kết quả cho thấy: Chỉ thị Nbp181 trong nhận diện gen Xa4, chỉ thị RG556 vƠ RM122 trong nhận dạng gen xa5, chỉ thị P3 trong nhận dạng gen kháng Xa7 trên quần thể phơn ly F2 của các tổ hợp lai có độ tin cậy cao, đưa ra tỷ lệ phơn ly kiểu gen gần đúng với tỷ lệ 1 : 2 : 1. Kết hợp với đánh giá mức kháng nhiễm của từng cá thể F2  mỗi tổ hợp lai, được trình bƠy trong bảng 3.2. 11 Bng 3.2. Kiểu gen kháng vƠ mc kháng/nhim với vi khuẩn gơy bnh bc lá  th h F2 ca các t hợp lai Ch th Kiểu gen Số cá thể Mc kháng/ nhim C hính xác (%) R M S Nbp181 - Xa4 BT7 x IRBB4 160 84 30 46 97 RR 46 34 10 2 Rr 70 49 18 3 rr 44 1 2 41 IR24 x IRBB4 160 93 26 41 96 RR 50 38 8 4 Rr 70 55 13 2 rr 40 0 5 35 RG556 - xa5 HDT2 x IRBB5 160 47 16 97 76 RR 35 2 6 27 Rr 75 3 4 68 rr 50 42 6 2 IR24 x IRBB5 160 29 22 109 65 RR 33 0 6 27 Rr 90 2 10 78 rr 37 27 6 4 RM122 – xa5 HDT2 x IRBB5 160 47 16 97 73 RR 32 3 4 25 Rr 78 5 5 68 rr 50 39 7 4 IR24 x IRBB5 160 29 22 109 61 RR 51 3 5 43 Rr 72 3 9 60 rr 37 23 8 6 P3 - Xa7 D68-10 x IRBB7 160 111 21 28 92 RR 47 41 3 3 Rr 82 67 11 4 rr 31 3 7 21 IR24 x IRBB7 160 98 32 30 82 RR 34 27 7 0 12 Ch th Kiểu gen Số cá thể Mc kháng/ nhim C hính xác (%) R M S Rr 75 68 4 3 rr 51 3 21 27 RM5509 - Xa7 D68-10 x IRBB7 160 111 21 28 89 RR 53 41 9 3 Rr 72 63 5 4 rr 35 7 7 21 IR24 x IRBB7 160 96 34 30 84 RR 48 27 14 7 Rr 85 60 8 17 rr 27 9 12 6 Trên quần thể phơn ly F2, những cá thể kháng (R) vƠ nhiễm vừa (M) đều được đánh giá lƠ có tính kháng. Độ chính xác của chỉ thị liên kết với gen kháng được tính bằng số cá thể có tính kháng trong số cá thể được chọn kiểu gen kháng trên tổng số cá thể có tính kháng trong quần thể. Chỉ thị Nbp181 nhận diện gen Xa4 chính xác từ 96 - 97%; Chỉ thị RG556 nhận diện gen xa5 chính xác từ 65 - 76%; Chỉ thị RM122 nhận diện gen xa5 chính xác từ 61 – 73%; Chỉ thị P3 nhận diện gen Xa7 chính xác 82 - 92%; Chỉ thị RM5509 nhận diện gen Xa7 cũng có độ chính cao từ 84 – 89%. 3.1.2.4. Sử dụng các chỉ thị phân tử kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá trên các mẫu giống lúa vật liệu Trong vụ mùa 2011, các chỉ thị Nbp181, RG556 vƠ P3 được sử dụng để phát hiện gen kháng tưng ứng lƠ Xa4, xa5 vƠ Xa7 cùng với kết quả đánh giá khả năng kháng/nhiễm trên 51 dòng giống giống lúa vật liệu. Kết quả cho thấy: Chỉ thị Nbp181 xác định được 15 mẫu giống lúa mang gen Xa4, trong đó có 6 mẫu giống được đánh giá lƠ kháng cao, 8 mẫu nhiễm vừa vƠ 1 mẫu (chiếm 5%) được đánh giá lƠ nhiễm nặng. Với chỉ thị RG556 đã xác định được 4 mẫu giống lúa mang gen kháng xa5  trạng thái đồng hợp tử, trong đó có 3 mẫu giống được đánh giá lƠ nhiễm vừa vƠ 2 mẫu giống lƠ kháng cao. Chỉ thị P3 xác định được 4 mẫu giống lúa mang gen kháng Xa7, trong đó 2 mẫu giống được đánh giá lƠ nhiễm vừa vƠ 2 mẫu lƠ kháng cao. Như vậy, phần lớn các mẫu giống lúa mang 13 gen kháng được phát hiện bằng chỉ thị Nbp181, RG556 vƠ P3 đã thể hiện khả năng kháng cao vƠ nhiễm vừa với chủng vi khuẩn gơy bệnh. Đối với những kiểu gen kháng được phát hiện bằng những chỉ thị nƠy thì tỷ lệ kháng thực tế lƠ rất cao đạt từ 95 – 100%. Do vậy, sử dụng các chỉ thị nƠy để nhận diện gen kháng trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá sẽ cho độ chính xác cao. 3.2. Đánh giá đa dng di truyền tp đoƠn vt liu lúa thm kháng bnh bc lá 3.2.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học, mùi thơm và khả năng kháng bệnh bạc lá của các mẫu giống trong tập đoàn vật liệu 3.2.1.1. Thời gian sinh trưởng Các mẫu giống lúa có TGST trong vụ mùa tập trung trong khoảng từ 98 ngƠy đến 113 ngƠy, được phơn vƠo 2 nhóm: 4 mẫu giống thuộc nhóm cực ngắn ngƠy (TGST <100 ngƠy) vƠ 47 mẫu giống thuộc nhóm ngắn ngƠy (TGST từ 100 – 115 ngƠy). 3.2.1.2. Khả năng đẻ nhánh Số nhánh hữu hiệu của các mẫu giống dao động từ 4,0 nhánh đến 5,2 nhánh trong vụ xuơn vƠ từ 4,0 nhánh đến 6,9 nhánh trong vụ mùa. Trong vụ xuơn, có 37 mẫu giống thuộc nhóm đẻ nhánh ít (< 5 nhánh), 14 mẫu giống đẻ nhánh trung bình (5-8 nhánh). Trong vụ mùa, có 28 mẫu giống thuộc nhóm đẻ nhánh thấp, 23 mẫu giống thuộc nhóm đẻ nhánh trung bình. 3.2.1.3. Chiều cao cây Chiều cao cơy của các mẫu giống lúa phần lớn thuộc nhóm có chiều cao cơy thấp vƠ trung bình: từ 87,7cm đến 112,8 cm trong vụ xuơn vƠ từ 92,4cm đến 115,5 cm trong vụ mùa 3.2.1.4. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất * Số bông trên khóm: Các mẫu giống lúa có số bông trên khóm tập trung  mức thấp, dao động từ 4,0 bông/khóm đến 5,3 bông/khóm trong vụ xuơn vƠ từ 4,0 bông/khóm đến 6,9 bông/khóm trong vụ mùa. * Số hạt trên bông: Các mẫu giống lúa có số hạt trên bông dao động từ 135 hạt đến 187 hạt trong vụ xuơn vƠ từ 130 hạt đến 173 hạt trong vụ mùa. 14 * Tỷ lệ hạt chắc: tỷ lệ hạt chắc của các mẫu giống lúa dao động động tưng đối lớn, từ 75,0% đến 94,7% trong điều kiện vụ xuơn vƠ từ 71,0% đến 92,5% trong điều kiện vụ mùa. Phần lớn các mẫu giống được xếp vƠo nhóm chắc (80,4% trong vụ xuơn vƠ 90,2% trong vụ mùa) vƠ nhóm chắc cao (17,6% trong vụ xuơn vƠ 2% trong vụ mùa). * Khối lượng 1000 hạt (M1000 hạt) của các mẫu giống lúa không có sự sai khác nhiều giữa vụ xuơn vƠ vụ mùa, biến động từ 20,0g đến 27,5g. Phần lớn (47/51 mẫu giống) có M1000 hạt tập trung trong khoảng 20,0 – 25,0 g; chỉ có 4 mẫu giống có M1000 hạt từ 25,1 g đến 27,5g. * Năng suất hạt: Trong vụ xuơn, năng suất của các mẫu giống dao động từ 49,35 tạ/ha đến 93,78 tạ/ha đối với NSLT vƠ từ 46,96 đến 81,79 tạ/ha đối với NSTT. Trong vụ mùa, năng suất của các mẫu giống lúa dao động từ 38,73 tạ/ha đến 83,47 tạ/ha đối với NSLT vƠ từ 36,92 đến 74,12 tạ/ha đối với NSTT. Các mẫu giống được phơn nhóm theo NSTT với khoảng cách 5 tạ/ha. Với khoảng cách nƠy, 51 mẫu giống được phơn thƠnh 10 nhóm. Trong vụ xuơn, có 32 mẫu giống chiếm 63% có NSTT đạt trên 60,0 ta/ha, trong đó NSTT của 10 mẫu giống trong khoảng 75 – 80 tạ/ha vƠ 2 mẫu trong khoảng 80 – 85 tạ/ha. Trong vụ mùa, 32 mẫu giống lúa có NSTT trên 55,0 tạ, trong đó 3 mẫu giống có NSTT cao nhất, trong khoảng 70,0 – 75,0 tạ/ha. 18 mẫu giống lúa mang gen kháng bệnh bạc lá có NSTT ≤ 55,0 tạ/ha, phần lớn (12 mẫu giống) trong khảng 40,0 – 45,0 tạ/ha. Mục tiêu chọn tạo lƠ giống lúa thm, chất lượng cao, thi gian sinh trưng ≤ 110 ngƠy trong vụ mùa, năng suất đạt trên 60,0 tạ/ha trong vụ xuơn vƠ trên 55,0 tạ/ha trong vụ mùa. Như vậy, nguồn vật liệu khi đầu nghiên cứu lƠ hoƠn toƠn phù hợp về năng suất với mục tiêu chọn tạo đã được đưa ra. 3.2.1.5. Đặc điểm về chất lượng của các mẫu giống lúa nghiên cứu * Hình dạng hạt: trong 51 mẫu giống lúa nghiên cứu, có 19 mẫu thuộc nhóm hạt dƠi, chiếm tỷ lệ 37,3%; 31 mẫu thuộc nhóm hạt bầu, chiếm tỷ lệ 60,8% vƠ chỉ có 1 mẫu có dạng hạt tròn, chiếm tỷ lệ 2%. 15 * Tỷ lệ bạc bụng: Phần lớn các mẫu giống lúa vật liệu (47/51 mấu giống) có tỷ lệ bạc bụng  mức trung bình (10 – 20% bạc bụng). * Tỷ lệ gạo nguyên: biến động từ 67,4% của mẫu giống đến 96,3%. Trong đó, 4 mẫu có tỷ lệ gạo nguyên > 90%, 15 mẫu có tỷ lệ gạo nguyên từ 80 – 90%, 30 mẫu có tỷ lệ gạo nguyên từ 70 – 80% vƠ chỉ có 2 mẫu có tỷ lệ gạo nguyên < 70%. * Hàm lượng amylose: 51 mẫu giống lúa nghiên cứu đều thuộc nhóm nonwaxy. Trong đó, 78,4% số mẫu thuộc nhóm amylose thấp vƠ 21,6% số mẫu thuộc nhóm amylose trung bình. * Nhiệt hóa hồ: ToƠn bộ các dòng lúa đẳng gen gen kháng bệnh bạc lá (18 mẫu giống) có nhiệt hóa hồ cao. Trong 33 mẫu giống lúa thm chỉ có 5 mẫu thuộc nhóm có nhiệt hóa hồ cao, còn lại 28 mẫu lƠ có nhiệt hóa hồ từ thấp đến trung bình. * Mùi thơm: 33 mẫu giống được đánh giá  mức thm vƠ thm nhẹ. 18 dòng lúa đẳng đẳng gen kháng bệnh bạc lá lƠ không thm. 3.2.2. Đánh giá đa dạng nguồn gen di truyền bằng sử dụng chỉ thị phân tử DNA 3.2.2.1. Hệ số đa hình (PIC) và số allele thu được ở các mồi chỉ thị 31 mồi chỉ thị SSR cho kết quả đa hình với 81 loại allen, trung bình 2,61 allen/1 mồi. Hệ số đa hình (PIC) của 31 chỉ thị thay đổi từ 0,00 ( mồi xuất hiện 1 allele) đến giá trị PIC cao nhất lƠ 0,69 ( mồi xuất hiện 8 allele - RM224). Giá trị PIC trung bình của 31 cặp mồi nghiên cứu lƠ 0,31. 3.2.2.2. Mối quan hệ di truyền của các mẫu lúa nghiên cứu Hệ số tưng đồng di truyền của 51 giống lúa nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,36 đến 1.  hệ số tưng đồng di truyền 0,63 thì tổng số 51 mẫu lúa nghiên cứu được chia thƠnh 8 nhóm: Nhóm I: 19 mẫu giống vƠ được chia thƠnh 4 phơn nhóm phụ; Nhóm II: 6 mẫu giống; Nhóm III: 4 mẫu giống; Nhóm IV: 6 mẫu giống; Nhóm V: 2 mẫu giống; Nhóm VI: 12 mẫu giống vƠ được chia thƠnh 2 phơn nhóm phụ; Nhóm VII: 1 mẫu giống vƠ Nhóm VIII có 1 mẫu giống lƠ HT1. 16 3.2.3. Định hướng bố mẹ trong lai tạo giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá cho các tỉnh phía Bắc Trên c s kết quả đánh giá đặc tính nông sinh học cùng với phơn tích đa dạng di truyền vƠ nguồn gen mục tiêu của 51 mẫu giống lúa trong tập đoƠn vật liệu khi đầu, danh sách bố mẹ được lựa chọn cho các tổ hợp lai định hướng trong chọn tạo giống lúa thm kháng bệnh bạc lá cho các tỉnh phía Bắc được đưa ra trong bảng 3.3 vƠ 3.4. Bng 3.3. Vt liu lúa thm cho các t hợp lai TT Tên dòng, giống Nhóm Đặc điểm chính lựa chọn cho mục tiêu chọn to TGST vụ mùa (ngƠy) NSTT vụ xuơn (tạ/ha) NSTT vụ mùa (tạ/ha) HƠm lượng amylose (%) Gen thm Gen kháng bệnh bạc lá 1 HDT8 VI 100 81,79 66,48 17,5 fgrfgr - 2 HDT2 VI 100 79,76 66,82 15,5 fgrfgr - 3 D19-10 III 108 75,65 64,19 11,3 fgrfgr - 4 D21-10 III 106 65,30 62,91 13,8 fgrfgr - 5 D68-10 II 110 77,53 74,12 17,3 fgrfgr - 6 D26-10 IV 106 65,69 62,97 13,8 fgrfgr - 7 D127-10 VI 112 72,71 67,52 15,3 fgrfgr - 8 D257-10 VI 105 76,83 68,39 14,8 fgrfgr - 9 D227-10 VI 98 74,44 62,95 12,8 fgrfgr Xa4 10 D395-10 IV 103 78,61 64,36 16,1 fgrfgr - 11 SH8 VI 108 77,39 68,12 18,5 fgrfgr - 12 D129-10 III 106 70,49 63,60 14,2 fgrfgr - Bng 3.4. Ngun gen kháng bnh bc lá cho các t hợp lai TT Tên dòng, giống Nhóm Gen kháng TT Tên dòng, giống Nhóm Gen kháng 1 HDT8 VI Xa4 7 IRBB4/5 I Xa4, xa5 2 D227-10 VI Xa4 8 IRBB7/10 I Xa4, Xa10 3 IRBB7 I Xa7 9 IRBB3/7 I Xa4, Xa3, Xa10 4 IRBB4 VI Xa4 10 IRBB5/7 I Xa5, Xa7 5 IRBB5/7 I Xa5, Xa7 11 IRBB5 I xa5 6 BB4/10 I Xa4, Xa10 12 IRBB21 I Xa21 [...]... Sử dụng các dòng lúa th m, kháng bệnh bạc lá chọn được từ đề tƠi lƠm nguồn vật liệu cho lai tạo trong các chư ng trình chọn tạo giống lúa th m kháng bệnh bạc lá tiếp theo 24 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1 Dương Xuân Tú, Nguyễn Văn Khởi và Phan Hữu Tôn (2013) Sử dụng chỉ thị phân tử SSR đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen lúa thơm và kháng bệnh bạc lá, Tạp chí Nông. .. 94%; chỉ thị Nbp181 nhận diện gen kháng Xa4 với độ chính xác đến 97%; chỉ thị RG556 nhận diện gen kháng xa5 với độ chính xác đến 76% vƠ chỉ thị P3 nhận diện gen kháng Xa7 với độ chính xác lƠ 92% giữa gen kháng tính kháng Các chỉ thị nƠy được sử dụng trong lai tạo vƠ chọn lọc giống lúa th m, kháng bệnh bạc lá cho các tỉnh phía Bắc 2) Đánh giá đa dạng di truyền của 51 mẫu giống lúa bao gồm 33 mẫu giống lúa. .. chính xác h n Trong quá trình chọn lọc các dòng lúa th m, kháng bạc lá, chúng tôi nhận thấy việc chọn ra được dòng lúa kháng bạc lá mƠ có năng suất cao lƠ rất khó Trong những cá thể tốt chọn được thế hệ F3, sau khi kiểm tra gen th m vƠ gen kháng bệnh bạc lá, thì những cá thể không mang gen kháng nƠo thư ng lƠ những cá thể đẹp Phư ng pháp chọn lọc truyền thống kết hợp với chỉ thị phơn tử chọn gen mục... bệnh bạc lá và mùi thơm trong hạt của các dòng lúa: Vụ xuơn 2014, các dòng lúa được đánh mức kháng/ nhiễm với các chủng vi khuẩn gơy bệnh bạc lá bằng lơy nhiễm nhơn tạo Đồng th i các dòng lúa nƠy cũng được thu hạt dề phơn tích mùi th m trong hạt - Đánh giá bệnh bạc lá: kết quả cho thấy có 15/19 dòng chọn thể hiện mức kháng cao đến nhiễm vừa, đư ng với mức kháng/ nhiễm của các dòng đối chứng IRBB4, IRBB5... tục đánh giá 15 dòng lúa th m, kháng bệnh bạc lá triển vọng đã được chọn trong đề tƠi nƠy các vụ tiếp theo để chọn những dòng lúa ưu tú cho khảo nghiệm vƠ phát triển sản xuất Tiếp tục chọn lọc trên các thế hệ phơn ly của các tổ hợp lai: lai đ n, lai 4 bố mẹ vƠ lai hồi qui được tạo ra từ đề tƠi nƠy để tiếp tục chọn lọc những dòng lúa th m, kháng bạc lá đáp ứng được các tiêu chí trong mục tiêu chọn giống. .. được chọn để đánh giá dòng trong vụ xuơn 2014 3.4.2.2 Đánh giá dòng chọn theo mục tiêu * Kết quả kiểm tra gen mục tiêu của các dòng lúa Vụ xuơn 2014, các dòng lúa thế hệ F6 được kiểm tra gen th m vƠ gen kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phơn tử Kết quả kiểm tra đã đưa ra sự sai khác về kiểu gen mục tiêu 3/19 dòng lúa chọn từ thế hệ F3 so với thế hệ F6 (bảng 3.6) * Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá và... giống lúa vật liệu, đã lựa chọn được các mẫu giống lúa sử dụng lƠm bố mẹ cho các tổ hợp lai định hướng cho mục tiêu chọn giống lúa th m kháng bệnh bạc lá các tỉnh phía Bắc, bao gồm: 12 dòng giống lúa th m, chất lượng cao, th i gian sinh trư ng ngắn ( . tính kháng bệnh bệnh bạc lá trong cơy lúa đã được công bố  trong vƠ ngoƠi nước lƠ c s cho việc tiến hƠnh đề tƠi Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa thơm kháng bệnh. gian chọn tạo. Do vậy, nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phơn tử DNA đồng thi chọn kiểu gen mùi thm vƠ kháng bệnh bạc lá để tạo ra được những giống lúa thm mới, kháng tốt với bệnh bạc lá đáp ứng. chí trong mục tiêu chọn giống. Sử dụng các dòng lúa thm, kháng bệnh bạc lá chọn được từ đề tƠi lƠm nguồn vật liệu cho lai tạo trong các chưng trình chọn tạo giống lúa thm kháng bệnh bạc lá