1 MỞ ðẦU 1. 1. Tính cấp thiết của ñề tài Ngô là một trong các cây lương thực quan trọng, góp phần nuôi sống khoảng 1/3 dân số trên thế giới. Diện tích trồng ngô trên thế giới năm 2010 ñạt khoảng 159,32 triệu ha, năng suất 5,24 tấn/ha và sản lượng ñạt 853,03 tấn (FAO STAS, USAD 2010) [59]. Những nước trồng ngô chính ở trên thế giới là Hoa Kỳ, Trung Quốc và Brazil. Gần ñây bắp ngô bao tử ñược coi như một loại thực phẩm cao cấp. Ở Việt Nam, cây ngô ñược trồng cách ñây khoảng 300 năm (Ngô Hữu Tình và CTV, 1997) [33]. Ngô là cây lương thực thứ hai sau cây lúa, ñược trồng nhiều ở các tỉnh như Sơn La, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng, Hòa Bình, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An, Lâm ðồng, ðắc Lắc, ðắc Nông, Ninh Thuận, Bình Thuận, ðồng Nai, An Giang, ðồng Tháp. Diện tích trồng ngô ở Việt Nam ngày càng tăng. Năm 1990 diện tích ñạt 432.000 ha, sản lượng 671 tấn/ha và năng suất ñạt 1,55 tấn/ha. Năm 2010 diện tích 1.126.900 ha, sản lượng 4.600.000 tấn/ha và năng suất ñạt 4,09 tấn/ha (Bộ NN&PTNT, 2011) [4]. Tuy nhiên, sản lượng ngô trong nước vẫn chưa ñáp ứng ñủ nhu cầu hàng năm nước ta còn phải nhập khẩu ngô (trị giá trên 500 triệu USD) ñể sản xuất thức ăn gia súc. Cây ngô ngày càng có vai trò quan trọng ở nước ta. Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt ñới gió mùa trong năm có mùa ñông lạnh ở phía Bắc. ðây là ñiều kiện ñể bệnh virus hại ngô ở Việt Nam phát triển phong phú về số lượng và chủng loại. Bệnh virus ngô ñã gây ra những thiệt hại và là mối ñe dọa cho nghề trồng ngô trong một tương lai không xa. Bệnh virus gây thoái hóa dẫn ñến tàn lụi cây ngô có thể hủy diệt những diện tích nhỏ trong sản xuất. Bệnh làm giảm năng suất và phẩm chất ngô hạt. Bệnh khảm lùn ngô do virus Sugarcane mosaic virus - SCMV gây là bệnh virus phổ biến nhất trên ngô và mía ở Việt Nam. Cây ngô bị bệnh có triệu chứng khảm rất dễ nhận biết. Toàn cây ñược biến dạng, lùn thấp, cây có thể ra bắp hoặc không ra bắp nhưng nếu có bắp thì bắp teo lép, nhỏ, ngắn ảnh hưởng rất lớn ñến năng suất và sản lượng ngô. Xuất phát từ tình hình trên, chúng tôi thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngô (Sugarcane mosaic virus - SCMV), tại vùng Chương Mỹ, ðan Phượng (Hà Nội) và sản xuất kháng huyết thanh chẩn ñoán bệnh”. 2. Mục ñích và yêu cầu 2.1. Mục ñích Xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh, mức ñộ phổ biến bệnh và sản xuất kháng huyết thanh chẩn ñoán nhanh bệnh hại. 2.2. Yêu cầu - Xác ñịnh virus gây bệnh khảm lùn ngô. - Nghiên cứu khả năng lan truyền của virus gây bệnh. 2 - Xác ñịnh triệu chứng bệnh trên ngô và ñiều tra mức ñộ phổ biến của virus gây bệnh trên ñồng ruộng. - Sản xuất kháng huyết thanh chẩn ñoán bệnh hại. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Virus khảm lùn ngô là virus gây hại nặng ở nhiều nước trên thế giới; virus cũng là bệnh gây hại phổ biến trên cây ngô ở nước ta. Việc nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh và sản xuất kháng huyết thanh chẩn ñoán có ý nghĩa khoa học giúp bổ sung tài liệu về danh mục bệnh virus ở Việt Nam. Kết quả của ñề tài cũng giúp cho việc xác ñịnh biện pháp phòng trừ bệnh có hiệu quả. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu virus gây bệnh khảm lùn giúp bước ñầu phát hiện, mô tả các dạng triệu chứng bệnh khảm lùn, ñể làm cơ sở cho phân biệt với các dạng triệu chứng khác do virus gây ra trên cây ngô. Sản xuất kháng huyết thanh nhằm sử dụng dùng trong chẩn ñoán, phát hiện nhanh nguyên nhân gây bệnh và chọn lọc giống ngô nhằm tạo các giống ngô sạch bệnh, kháng bệnh do virus khảm lùn ngô gây ra. 4. Những ñóng góp mới của ñề tài Bổ sung thêm các kết quả nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngô ñể khẳng ñịnh Sugarcane mosaic virus - SCMV là nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngô ở Việt Nam. Lần ñầu tiên ñã sản xuất ñược kháng huyết thanh chẩn ñoán nhanh bệnh virus khảm lùn ngô SCMV ở Việt Nam. 5. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu 5.1. ðối tượng nghiên cứu - Bệnh virus khảm lùn ngô SCMV vùng Chương Mỹ và ðan Phượng (Hà Nội). 5.2. Phạm vi nghiên cứu - ðề tài tiến hành từ năm 2007 ñến năm 2011 - Nghiên cứu khả năng lan truyền của virus khảm lùn ngô. - Xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh virus khảm lùn ngô - Tìm hiểu một số tác hại và mức ñộ phổ biến của bệnh virus khảm lùn ngô. - Nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh chẩn ñoán nhanh bệnh virus khảm lùn ngô. 6. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 128 trang (không kể phần phụ lục), trong ñó: Mở ñầu 3 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 35 trang; Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu 16 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 72 trang; phần kết luận và ñề nghị 2 trang. Ngoài ra, luận án còn có: 04 công trình ñã công bố liên quan ñến luận án. Luận án có 38 bảng số liệu, 38 hình. ðã tham khảo 92 tài liệu, trong ñó có 41 tài liệu tiếng Việt và 52 tài liệu tiếng Anh. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cơ sở khoa học của ñề tài Bệnh khảm lùn ngô là bệnh phổ biến trên cây ngô, làm giảm năng suất, chất lượng ngô ở Việt Nam. Nguyên nhân gây bệnh là virus nên việc chẩn ñoán và công tác phòng trừ bệnh là rất quan trọng. Các triệu chứng bệnh trên ngô còn gây nhầm lẫn với các bệnh khác. Ở nước ta những nghiên cứu về bệnh khảm lùn ngô còn ít, các nghiên cứu trước ñây chưa xác ñịnh ñầy ñủ về nguyên nhân gây bệnh và chưa sản xuất ñược kháng huyết thanh chẩn ñoán bệnh. Vì vậy, việc chẩn ñoán còn gặp khó khăn. Nghiên cứu chính xác nguyên nhân gây bệnh bằng sử dụng kỹ thuật ELISA, RT-PCR, hiển vi ñiện tử và thử nghiệm chế tạo kháng huyết thanh ñể chẩn ñoán nhanh bệnh là cần thiết hiện nay ñể kịp thời phòng trừ hạn chế dịch bệnh xảy ra. 1.2. Những nghiên cứu ngoài nước 1.2.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới Cây ngô là một trong bốn loại cây lương thực chính của thế giới: Ngô (Zea mays L.), lúa nước (Oryza sativa L.), lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot esculenta Crantz). Trong ñó, ba loại cây gồm ngô, lúa gạo và lúa mì chiếm khoảng 87% sản lượng lương thực toàn cầu và khoảng 43% calori từ tất cả mọi lương thực, thực phẩm. Trong ba loại cây này, ngô là cây trồng có sự tăng trưởng mạnh cả về diện tích, năng suất, sản lượng và là cây có năng suất cao nhất. Vào năm 1961, năng suất ngô trung bình của thế giới chỉ xấp xỉ 2 tấn/ha, năm 2010 tăng gấp hơn 2,5 lần (ñạt 5,24 tấn/ha), sản lượng ñã tăng từ 204 triệu tấn lên 853,03 triệu tấn (gấp 4 lần), diện tích tăng từ 104 triệu lên 159,32 triệu hecta (hơn 1,5 lần). 1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại ngô trên thế giới Virus hại ngô là một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng cho cây ngô, có thể làm giảm năng suất ngô từ 15 - 30% phụ thuộc vào tuổi cây lúc lây nhiễm, ñiều kiện sinh thái, canh tác, giống ngô (Wilidins, Gordon and Nauled - 1967) [89]. Ở một số nước Châu Phi bệnh virus ngô gây thiệt hại tới 25% năng suất ngô. Ở Trung Quốc bệnh virus ngô gây thiệt hại từ 20 - 80% năng suất ngô. Bệnh gây thoái hóa giống, ảnh hưởng ñến phẩm chất, làm giảm giá trị thương phẩm của cây ngô (Chen et al, 2002) [47]. Hiện nay trên thế giới theo tổ chức phân loại virus ICTV (International Comittee on Taxonomy of Viruses) và theo Van Regenmortel et al (2000) [85]; Van Regenmortel et al (2002) [86] có 12 bệnh virus hại ngô ñã ñược phân loại ñó là: - Maize chlorotic dwarf virus (MCDV) họ Secoviridae. - Maize chlorotic mottle virus (MCMV) họ Tombusviridae. - Maize dwarf mosaic virus (MDMV) họ Potyviridae. 4 - Maize mosaic virus (MMV) họ Rhabdoviridae. - Maize rayado fino virus (MRFV) họ Marafiviruses - Maize rough dwarf virus (MRDV) họ Reoviridae. - Maize stem borer virus (MSBV) Unassignedviruses - Maize sterile stunt virus (MSSV) họ Rhabdoviridae. - Maize streak virus (MSV) họ Geminiviridae. - Maize strip virus (MStpV) thuộc Bunyaviridae - Maize white line mosaic satellite virus (MWlMV) thuộc Satelliteviruses - Maize white line mosaic virus (MWLMV) họ Unassignedviruses Trong ñó có nhiều bệnh phổ biến ở các vùng trồng ngô thế giới. 1.2.3. Giới thiệu chung về chi Potyvirus Bệnh khảm lùn ngô Sugarcane mosaic virus - SCMV do một virus của chi potyvirus gây ra. Vì vậy, ñặc tính chung của virus khảm lùn ngô hoàn toàn giống với virus thuộc chi potyvirus họ Potyviridae. Chi potyvirus thuộc họ Potyviridae là họ virus thực vật lớn nhất với trên 200 loài. Tất cả thành viên trong họ ñều có bộ gen RNA sợi ñơn, cực dương, có cấu trúc hình sợi mềm ñường kính 11-15 nm và dài 650 – 950 nm (Berger, 2005) [43]. Hiện nay, các potyvirus ñược phân loại thành 6 chi trên cơ sở (i) tổ chức bộ gen, (ii) môi giới truyền bệnh và (iii), so sánh trình tự. ðặc ñiểm bộ gene, mối quan hệ vector và số loài của các chi. Trong số 6 chi, chi Potyvirus là quan trọng nhất, cả về số lượng loài cũng như các bệnh có ý nghĩa kinh tế mà chúng gây ra (Berger, 2005) [43]. Các virus của 5 chi Potyvirus, Macluravirus, Ipomovirus, Rymovirus và Tritimovirus có bộ gen không phân ñoạn tức bộ gen chỉ gồm 1 phân tử RNA duy nhất nên gọi là virus có bộ gen ñơn. Các virus của chi còn lại, chi Bymovirus, có bộ gen kép gồm 2 phân tử RNA-1 và RNA-2. ðối với các bymovirus, phân tử RNA-1 tương ñương với 2/3 kích thước tính từ ñầu 3’ còn phân tử RNA-2 tương ñương phần còn lại của bộ gen của các virus có bộ gen ñơn. 1.3. Những nghiên cứu bệnh virus hại ngô ở Việt Nam 1.3.1. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam Trước ñây, sản xuất ngô ở Việt Nam còn nhỏ lẻ và phân tán, chủ yếu là tự cung tự cấp theo nhu cầu của hộ nông dân. Tại một số vùng miền núi do khó khăn về sản xuất lúa nước nên nông dân phải trồng ngô làm lương thực chính. Các giống ngô ñược trồng ñều là các giống truyền thống của ñịa phương, giống cũ nên năng suất rất thấp (Bộ môn cây lương thực, 1977) [1]. Vào thập kỷ 60 của thế kỷ trước, diện tích ngô Việt Nam chưa ñến 300 nghìn hecta, năng suất chỉ ñạt trên 1 tấn/ha, ñến ñầu những năm 1980 cũng không cao hơn nhiều, chỉ ở mức 1,1 tấn/ha, sản lượng ñạt khoảng hơn 400.000 tấn do vẫn 5 trồng các giống ngô ñịa phương với kỹ thuật canh tác lạc hậu (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2011) [4]. Năm 2010, diện tích ñạt 1.126.900 ha, tổng sản lượng khoảng 4.600.000 tấn. Các giống ngô lai của Việt Nam bước ñầu cũng ñã xuất bán sang các nước Bangladesh, Cam-pu-chia, Lào, Quảng Tây -Trung Quốc, Pakistan, Indonesia, Ấn ðộ… (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2011) [4]. 1.3.2. Những nghiên cứu về bệnh virus hại ngô Trên ngô, theo tài liệu ñiều tra cơ bản bệnh hại cây trồng ở Miền Bắc 1973 - 1974 của Viện Bảo vệ thực vật (NIPP) mới phỏng ñoán có thể có hai bệnh trên ngô do virus gây ra. Bệnh virus ngô ở Việt Nam lần ñầu tiên ñược Vũ Triệu Mân nghiên cứu theo ñề tài khoa học của Sở khoa học và Công nghệ Hà Nội tiến hành ñiều tra từ năm 1986 [39]. Bằng các phương pháp phát hiện triệu chứng sử dụng kỹ thuật hiển vi ñiện tử, lây bệnh nhân tạo, sử dụng kháng huyết thanh và ELISA (Vũ Triệu Mân và CTV) ñã ñi ñến một số kết luận sau: ðã phát hiện ở Việt Nam có một số virus hại ngô chính. + Bệnh virus khảm lá ngô (Maize mosaic virus). + Bệnh virus khảm lùn cây ngô (Maize dwarf mosaic virus) tác giả cho là một chủng của virus SCMV. + Bệnh khảm sọc lá ngô (Maize strreak virus). + Bệnh khảm ñốm lá ngô (Maize chlorotic mottle virus). Năm 1986, Vũ Triệu Mân và Hà ðình Tuấn bằng phương pháp sử dụng kính hiển vi ñiện tử phát hiện ra hai loại virus hình sợi là: + Virus khảm lá: Sợi mềm với kích thước 486 - 500nm x 13,1nm (Vũ Triệu Mân, 1991) [15]. + Virus khảm lùn cây: Dạng sợi với kích thước 855,2 x 13,1nm (Vũ Triệu Mân, 1991) [15]. (Sử dụng kính hiển vi ñiện tử JEM 100 CXII ở ñộ phóng ñại 40.000lần). Virus ngô truyền bằng rệp ngô Rhopalosiphum maydis với mật ñộ 4 - 5 con/cây với bệnh khảm lá và khảm lùn, 30% số cây ñã xuất hiện bệnh sau khi lây 10 - 15 ngày (1986 - 1987) và 7 ngày (1987 - 1988) (Vũ Triệu Mân, 1991) [15]. Bệnh khảm lá và khảm lùn còn truyền qua tiếp xúc có học nhờ bột Carborandium 600 Mesh, sau 12 - 15 ngày lây bệnh (Vũ Triệu Mân, 1991) [15]. Về môi giới truyền bệnh: Loại nhện ñỏ Tetranychus cinnabarius không truyền bệnh virus trên ngô. Trong số côn trùng môi giới truyền bệnh thì rệp ngô Rhopalosiphum maydis có khả năng truyền bệnh virus lớn nhất. Bằng thí nghiệm lây bệnh nhân tạo (cơ học tiếp xúc, côn trùng môi giới) ñã xác ñịnh ñược thời gian ủ bệnh của bệnh khảm lá và khảm lùn ngô (Vũ Triệu Mân, 1991) [15]. Năm 2003 - 2005 nhóm nghiên cứu Vũ Triệu Mân, Hà Viết Cường, Ngô Bích Hảo, Trần Thị Như Hoa ñã nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh và kit ELISA, 6 ứng dụng phương pháp RT-PCR chẩn ñoán hơn 30 loại virus gây bệnh ở Việt Nam (Vũ Triệu Mân, 2003) [25]. Trong hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam lần thứ 10, Hà Viết Cường ñã báo cáo có 52 virus thực vật thuộc 52 loài ñã ñược xác ñịnh ở Việt Nam trong ñó có Sugarcane mosaic virus – SCMV (Hà Viết Cường, 2011) [7]. 1.3.3. Phân loại SCMV ở Việt Nam Ở Việt Nam bệnh virus khảm lùn ngô ñã ñược Vũ Triệu Mân nghiên cứu tác giả cho rằng bệnh khảm lùn ngô là một chủng của virus khảm lá mía (SCMV) Vũ Triệu Mân, 1991 [15]. Theo Hà Viết Cường ở Việt Nam, bệnh khảm lá ngô ñã ñược quan sát thấy từ lâu. Các nghiên cứu gần ñây ñã phát hiện ñược 2 potyvirus hại họ hòa thảo là SCMV và SrMV (Hà Viết Cường, 2010) [6]. SCMV gây bệnh khảm lá ngô, mía và hoàng tinh. ðây là bệnh virus phổ biến nhất trên ngô và mía ở Việt Nam. Phân tích phả hệ dựa vào trình tự gen CP cho thấy virus ở Việt Nam khá ña dạng, phân nhóm với các mẫu có nguồn gốc ký chủ khác nhau thuộc nhiều khu vực ñịa lý là châu Mỹ, châu Âu và châu Á. ðặc biệt 3 mẫu SCMV phân lập từ mía ở Việt Nam tạo thành một nhóm riêng biệt (nhóm IV) chia sẻ chung tổ tiên với tất cả các mẫu SCMV trên thế giới (Hà Viết Cường, 2008) [64]. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Mẫu giống ngô, cây thí nghiệm và côn trùng môi giới - Mẫu lá ngô nghi nhiễm bệnh ñược thu thập trên những cây có triệu chứng bị virus ñiển hình, trên ruộng sản xuất tại các ñiểm ñiều tra. Cắt các phần lá non có triệu chứng bệnh ñiển hình cho vào túi nilong bảo quản ở nhiệt ñộ -4 0 C và -20 0 C trong phòng thí nghiệm. - Bảo quản khô bằng cách cho mẫu vào vào lọ nhựa có chứa các hạt silicagel ñã ñược làm khô. Mô tả triệu chứng bệnh, ñánh dấu ký hiệu lọ ñựng mẫu. - Hạt ngô sạch, cây chỉ thị ñược gieo trên ñất ñã khử trùng và trồng cách ly. Cây ngô sạch ñược thử ELISA trước khi lây bệnh nhân tạo. Thu mẫu và bảo quản mẫu lá cây chỉ thị sau khi lây bệnh nhân tạo. ðược bảo quản ở - 20 0 C và bảo quản khô bằng siliagel. - Hạt cây chỉ thị dùng trong thí nghiệm do Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới cung cấp có nguồn gốc từ Nhật Bản, ðan Mạch và Australia. Bao gồm: Họ Rau muối Chenopodiaceae: Rau muối thân tím Chenopodium amaranticolor Coste.; rau muối hoang dại Chenopodium album L.; rau muối trắng Chenopodium quinoa Willd. Họ cà Solanaceae: Thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin, N.tabacum cv. Samsun, N. tabacum cv. White Burley, N. tabacum cv. Xanthi – nc. - Tập ñoàn giống ngô do Viện nghiên cứu ngô cung cấp bao gồm các giống: 7 LVN 10; LVN 14; LVN 99; KK 159. - Củ giống Hoàng tinh Maranta arundinacea, mía Saccharum ssp, Cỏ voi Pennisetum purpurrerum dùng trong lây nhiễm bệnh nhân tạo. Danh pháp tên gọi, phân loại thực vật thành phần cây thí nghiệm dựa theo tài liệu mô tả của Dương Văn Chín và CTV (2000) [5]; Hoàng Thị Sản (2009) [30] và danh pháp gốc của phòng thí nghiệm. - Sử dụng côn trùng môi giới là rệp ngô Rhopalosiphum maydis thuộc họ Aphididae, bộ Cánh ñều Homoptera (Bộ môn côn trùng, 2004) [2]. Rệp ñược nuôi trên cây ngô trong lồng cách ly. - Thỏ thí nghiệm nặng trên 2 kg nuôi tại Trung tâm bệnh cây nhiệt ñới Trường ðại học Nông nghiêp. 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hoá chất nghiên cứu Máy ñọc bản ELISA, máy PCR của hãng Biotech (Mỹ). Tủ lạnh bảo quản mẫu Sanyo (Nhật Bản), tủ ñịnh ôn hãng Binder (ðức) cân ñiện tử, bể nhiệt hãng Prolabo (Pháp), máy siêu ly tâm Beckman 90.000 vòng/phút hãng (Mỹ). Các hóa chất dùng trong thí nghiệm ñều ñược mua từ Cộng hòa liên bang ðức. 2.2. Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 2.2.1.Thời gian Từ năm 2007 - 2011 2.2.2 ðịa ñiểm nghiên cứu - Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt ñới, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. - Trường Cao ñẳng Nông nghiệp và PTNT Bắc Bộ, Xuân Mai – Chương Mỹ - Hà Nội. - Viện nghiên cứu ngô - ðan Phượng - Hà Nội - Vùng sản xuất ngô ñại trà ở huyện ðan Phương và Chương Mỹ (Hà Nội). 2.3. Nội dung nghiên cứu - Xác ñịnh nguyên nhân và triệu chứng bệnh. - Nghiên cứu các phương thức truyền bệnh do virus SCMV. - ðiều tra diễn biến bệnh khảm lùn cây ngô trên các giống ngô tại các ñiểm ñiều tra. - Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh SCMV. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp ELISA Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp dựa theo tài liệu mô tả của Gibbs & Harrison (1980) [61]. 2.4.2. Phương pháp RT-PCR Quy trình chiết tách RNA tổng số bằng kít Tripure theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc bằng phương pháp CTAB/LiCl của Chang et al (1993). 8 Phương pháp làm sạch SCMV theo phương pháp của Von Baumgarten & Ford, 1981 [88]. 2.4.3. Xác ñịnh virus bằng phương pháp hiển vi ñiện tử Sử dụng phương pháp lát cắt cực mỏng của tác giả Milne (1972). Lúc ñầu mô bệnh ñược cố ñịnh trong dung dịch glutaraldehyde tiếp theo là osmium tetroxide. Mẫu ñược làm khô rồi ñược ñúc trong viên con nhộng epoxy và ñược ñưa vào máy ultramicrotome cắt lát cắt cực mỏng từ 50 – 100 nm chiều dày mẫu ñược nhuộm màu trong urannyl acetate và lead citrate và ñược kiểm tra bằng kính hiển vi ñiện tử JEOL 1010. 2.4.4. Phương pháp ñiều tra ngoài ñồng Áp dụng phương pháp nghiên cứu, ñiều tra và phát hiện bệnh hại theo “Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật” của Viện Bảo vệ thực vật, 2003 [40]. Áp dụng phương pháp nghiên cứu, ñiều tra và phát hiện bệnh hại theo Vũ Triệu Mân (2003) [25]. ðiều tra theo phương pháp 5 ñiểm trên ñường chéo góc, mỗi ñiểm 100 cây ñối với ruộng có diện tích lớn, ñiều tra 100% số cây ñối với cây có diện tích nhỏ. Nếu cây biểu hiện triệu chứng ñặc trưng sau 10 ñến 20 ngày kể từ ngày xuất hiện những biểu hiện ñầu tiên thì ñược coi là nhiễm bệnh. Tại Viện nghiên cứu ngô tiến hành ñiều tra toàn bộ số cây ở ô thí nghiệm bộ giống chín trung bình tại Bộ môn Canh Tác theo tiêu chuẩn ngành 10 TCN 341:2006 [3]. Theo dõi ñịnh kỳ 10 ngày một lần, thu thập số liệu và tính tỷ lệ bệnh. Tỷ lệ bệnh: TLB (%) = 100× b a Trong ñó: a: Số cây có triệu chứng nhiễm bệnh virus; b: Tổng số cây ñiều tra. ðiều tra tình hình cây bị rệp trên ruộng sản xuất ñại trà ñiều tra 500 cây/ha và tính tỷ lệ cây bị rệp theo công thức sau: Số cây có rệp Tỷ lệ cây bị rệp (%) = × 100 Tổng số cây ñiều tra 2.4.5. Phương pháp xác ñịnh sự lan truyền của virus - Phương pháp xác ñịnh sự lan truyền của virus khảm lùn cây ngô (SCMV) bằng tiếp xúc cơ học dựa theo tài liệu mô tả của Vũ Triệu Mân (2003) [25] và phương pháp của D.spire phòng thí nghiệm Versailles IRRA Pháp. - Phương pháp xác ñịnh sự lan truyền của virus khảm lá ngô (SCMV) bằng côn trùng môi giới theo Nguyễn Thị Kim Oanh (1996)[29] và Bộ môn Côn trùng (2004) [2]. 2.4.6. Phương pháp tính và xử lý số liệu Số liệu thu thập ñược xử lý trong Microsoft Office Excel và SPSS 15.0. 9 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngô Sự nhận biết các biểu hiện triệu chứng có thể nhìn thấy ở một cây ngô bị bệnh virus là một phương pháp ñơn giản nhất. Tuy vậy, việc phân tích triệu chứng khảm lá trên cây ñơn tử diệp là một việc làm có nhiều khó khăn; Vì dạng khảm và sọc hay ñốm thường ñều xuất hiện theo chiều dài gân lá. Chúng tôi lấy các triệu chứng chủ yếu ñiển hình nhất cho từng nhóm ñể dạng triệu chứng (Theo phân nhóm của Vũ Triệu Mân và CTV, 1988 - 2000) kết hợp với thử ELISA và RT-PCR ñể khẳng ñịnh cây bị nhiễm bệnh. 3.1.1. Mô tả triệu chứng bệnh virus khảm lùn ngô Quan sát bệnh virus trên ngô tại các vùng trên thấy bệnh virus khảm lùn ngô xuất hiện phổ biến và hại trên lá non, lá bánh tẻ. Các mẫu bệnh trên ñược thu thập ở các vùng ñiều tra và kiểm tra bằng phương pháp ELISA trực tiếp. ðể có thể không bị nhầm lẫn giữa các triệu chứng do virus khảm lùn gây ra với các loại hình triệu chứng khác chúng tôi mô tả chi tiết như sau: Biểu hiện triệu chứng trên lá bệnh ở giai ñoạn ñầu rất khó phát hiện, rất nhầm với bệnh khảm lá ngô. Bệnh có thể xuất hiện sớm nhưng biểu hiện triệu chứng ñặc trưng dễ nhận biết nhất khi cây ngô ñược 8 – 10 lá. ðặc ñiểm chính của bệnh là toàn cây ñược biến dạng, cây có sự giảm rất mạnh về chiều cao do các dóng ngắn lại. Cây có thể lùn thấy ở mức ñộ khác nhau tùy thuộc vào thời gian nhiễm bệnh. Chiều dài và chiều rộng của lá bị thu lại, bản lá hẹp lại, hai mép lá hơi cong lên các áo lá xếp xích nhau. Lá có xu hướng xòe ngang so với thân cây, tạo bởi gốc lá và thân cây rất lớn (70 o -80 o ) toàn cây thường có màu xanh ñậm hơn so với cây khỏe hoặc có màu vàng. Có hiện tượng khảm ñặc biệt rõ ở lá non và lá bánh tẻ. Cây ngô bị nhiễm bệnh nhẹ vẫn có thể trỗ cờ, nhưng cờ ngô có số lượng phấn không ñáng kể và thường nhánh cờ cũng xòe ngang ngắn hơn bình thường so với trục chính. Cây có thể ra bắp hoặc không ra bắp nhưng nếu có bắp thì bắp teo lép, nhỏ, ngắn. Cây ngô bị nhiễm bệnh nặng không trỗ cờ ñược hoặc chỉ nhú lên một ñoạn dù không bật ra khỏi lá bao ñược. Nếu nhổ cây ngô ñó lên thì thấy hệ thống rễ co ngắn lại, các ñốt rễ xếp xít nhau, rễ có màu nâu tối so với cây khỏe và có nhiều lông nhỏ ở rễ chính. Các lá thường chết héo trước lúc thu hoạch, thân khô héo rũ xuống. Các cây bị bệnh có triệu chứng như trên ñược thu về kiểm tra lại bằng kháng huyết thanh của virus SCMV của hãng Agdia (Mỹ) ñều cho kết quả dương tính. 10 3.1.2. Kiểm tra một số loại virus gây hại ngô ngoài ñồng tại các vùng khác nhau, vụ xuân 2009 - 2010 bằng phương pháp ELISA gián tiếp Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra virus SCMV gây hại trên ngô và cây ký chủ ngoài ñồng, vụ xuân 2009 - 2010 bằng phương pháp ELISA gián tiếp STT Tên mẫu ðịa ñiểm Giá trị (OD) Kết luận 1 LVN 10 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 1,025 + 2 LVN 66 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,316 + 3 LVN 14 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,530 + 4 LVN 4 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,355 + 5 LVN 99 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,686 + 6 LS09.97 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,242 + 7 KK 159 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,388 + 8 VS 096 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,211 + 9 SB 08-228 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,338 + 10 B09-2 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,803 + 11 LVN 37 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,429 + 12 SB 09-9 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,282 + 13 LS 08-1 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,241 + 14 CN 091 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,325 + 15 VS 0922 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,401 + 16 KH 08-7 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,291 + 17 H 08-8 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 3,376 + 18 NH 4 Viện nghiên cứu ngô – Hà Nội 0,388 + 19 LVN 10 Chương Mỹ - Hà Nội 0,745 + 20 LVN 10 ðan Phượng – Hà Nội 0,686 + 21 LVN 10 Gia Lâm – Hà Nội 0,429 + 22 LVN 10 Lương Sơn – Hòa Bình 0,505 + 23 Mía ñỏ ðan Phượng – Hà Nội 0,465 + 24 Mía ñỏ Chương Mỹ - Hà Nội 0,427 + 25 Mía ñỏ Gia Lâm – Hà Nội 0,411 + 26 Cỏ voi Chương Mỹ - Hà Nội 0,379 + 27 Ngô khỏe ðan Phượng – Hà Nội 0,110 - 28 Mía khỏe Chương Mỹ - Hà Nội 0,081 - 29 ðối chứng (+) 1,245 30 ðối chứng (-) 0,121 31 ðệm 0,088 Ghi chú: ðiều tra ở ngoài ñồng và trên tập ñoàn giống ngô giai ñoạn cây 7- 9 lá. Mẫu bệnh nghi nhiễm bệnh virus trên 18 giống ngô ñược thu thập ở Viện nghiên cứu ngô ðan Phượng và các giống ngô ñược trồng sản xuất ñại trà vụ xuân và vụ thu 2008 - 2009 - 2010 ñược trồng tại 3 huyện (Chương Mỹ, ðồng Tháp, Gia Lâm) – Hà Nội và Huyện Lương Sơn (Hòa Bình). Thu thập các mẫu cây bị bệnh trên cây mía, hoàng tinh, cỏ voi. Mẫu bệnh thu thập ñược kiểm tra bằng phương pháp ELISA gián tiếp (bảng 3.1). [...]... t cây ngô b nh trên th và sau ñó ng d ng kháng huy t thanh t o ñư c ñ ch n ñoán virus 3.4.3 Ki m tra s có m t c a kháng th SCMV trong cơ th th thí nghi m sau các tu n tiêm Khi ñã có kháng nguyên virus sau khi làm s ch, kháng nguyên ñư c tiêm vào cơ b p c a th 4 l n, m i l n cách nhau 7 ngày Ti n hành l y máu th ñ ki m tra s có m t c a kháng th virus sau 2, 3 và 4 tu n tiêm S d ng cây ngô b nh và có... và dung d ch ñ m Vì v y, hoàn toàn có th s d ng trong ch n ñoán b nh virus SCMV Hình 3.38 Ki m tra SCMV trên ngô, cao lương, c voi Hình 3.39 K t qu ki m tra ELISA trên t p ñoàn gi ng ngô Vi n nghiên c u ngô ðan Phư ng, Hà N i 24 4 K T LU N VÀ ð NGH 4.1 K t lu n Th c hi n ñ tài: Nghiên c u b nh virus kh m lùn ngô (Sugarcane mosaic virus SCMV), t i vùng Chương M , ðan Phư ng (Hà N i) và s n xu t kháng. .. RT-PCR nh m phát hi n chính xác virus kh m lùn ngô (Sugarcane mosaic virus - SCMV) K t qu ki m tra ñư c th hi n b ng 3.2 và hình 3.4 B ng 3.2 K t qu ki m tra virus kh m lùn ngô (SCMV) b ng phương pháp RT-PCR STT 1 2 3 4 Ký hi u m u NB-ðP-11 NB-CM-11 MB-11 CB-11 Tri u ch ng Kh m lùn Kh m lùn Kh m lùn Kh m lùn K t lu n v RT-PCR ð ng Tháp - ðan Phư ng - Hà N i + Th y Xuân Tiên – Chương M - Hà N i + Gia Lâm... kh m lùn ngô SCMV có th r t d nh m v i các b nh do môi trư ng và b nh virus khác trên cây ngô M c dù b nh có th ch n ñoán chính xác b ng RT-PCR nhưng k thu t này quá ñ t không cho phép th trên m t lư ng m u l n Chính vì v y, nhu c u t o kháng huy t thanh ñ c hi u virus SCMV Vi t Nam là ñi u c n thi t Chúng tôi ñã th nghi m s n xu t kháng huy t thanh ñ c hi u virus SCMV b ng cách gây mi n d ch virus. .. hình b nh virus kh m lùn ngô trên gi ng LVN – 4 t i xã Th y Xuân Tiên – Chương M - Hà N i - v xuân và v thu năm 2007 ñ n 2010 Ngay nay nhu c u s d ng cây ngô ngày càng tăng trong khi ñó tình hình d ch h i trên cây ngô và ñi u ki n th i ti t di n bi n ngày m t ph c t p hơn Ti n hành ñi u tra di n bi n b nh virus ngô trên ru ng s n xu t ñ i trà và t p ñoàn gi ng ngô c a Vi n nghiên c u ngô K t qu thu ñư... thu t ch n ñoán ñơn 19 gi n, r và có th th c hi n ñư c trên s lư ng m u l n Các hãng s n xu t kít như Agria, Biotech (M ) và nhi u hãng c a Pháp, Nh t, Th y S , ð c ñã s n xu t ñ cung c p ñáp ng nhu c u nghiên c u K thu t ELISA ñòi h i ph i có m t kháng th hay kháng huy t thanh ñ c hi u virus Hi n nay, Vi t Nam chưa s n xu t ñư c kháng huy t thanh virus SCMV Không gi ng như nhi u b nh virus có tri... huy t thanh ch n ñoán b nh” chúng tôi có các k t lu n sau: 1 Nguyên nhân gây b nh kh m lùn ngô - Dùng phương pháp RT-PCR trên các m u có tri u ch ng ñi n hình vùng Hà N i ñã phát hi n virus kh m lùn ngô Sugarcane mosaic virus- SCMV S n ph m RT-PCR ñ c trưng là 1,6 kb - Ki m tra ELISA c a 26 gi ng ngô Vi n nghiên c u ngô và trên ru ng s n xu t ñ i trà ñã phát hi n 100% m u có tri u ch ng kh m lùn ñ... này 3 S n xu t kháng huy t thanh ch n ñoán nhanh b nh virus kh m lùn ngô (SCMV) v i ngư ng pha loãng t 1/100 ñ n 1/300 So sánh ph n ng trên cùng m t m u v i kháng huy t thanh c a hãng Agdia (M ) nh p kh u có tính ñ c hi u tương ñương, giá tr OD th p hơn nhưng so v i ñ i ch ng âm - cây kh e (c a hãng Agdia) và ph n ng c a huy t thanh s n xu t cao g p 2,3 - 6,3 l n Kháng huy t thanh s n xu t hoàn toàn... ng lư ng h t khô c a cây b b nh virus kh m lùn gi m r t rõ r t so v i cây kh e ch còn 69,88% ñ n 88,79% Virus gây b nh kh m lùn nh hư ng r t l n ñ n năng su t ngô Tuy nhiên ngư i dân chưa th t s quan tâm và coi b nh là b nh nguy hi m trên cây ngô 3.4 Th nghi m t o kháng huy t thanh ñ c hi u virus SCMV 3.4.1 Gi i thi u Ch n ñoán b nh virus nhanh b ng phương pháp huy t thanh h c ELISA v n là phương pháp... nm Hình 3.36 ELISA ki m tra s có m t kháng th virus SCMV trong kháng huy t thanh 21 3.4.4.2 K t qu xác ñ nh ngư ng pha loãng kháng huy t thanh B ng 3.28 K t qu xác ñ nh ngư ng pha loãng kháng huy t thanh virus SCMV M u th nghi m CB-1 CB-2 CB-3 CB-4 XCây b nh SD CK-1 CK-2 CK-3 XCây kho SD ð m1 ð m2 ð m3 Xð m SD Ngư ng pha loãng kháng huy t thanh 1/100 1/200 1/300 OD KL OD KL OD 0,305 + 0,258 + 0,269 0,636 . virus khảm lùn ngô. - Xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh virus khảm lùn ngô - Tìm hiểu một số tác hại và mức ñộ phổ biến của bệnh virus khảm lùn ngô. - Nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh chẩn ñoán. suất và sản lượng ngô. Xuất phát từ tình hình trên, chúng tôi thực hiện ñề tài: Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngô (Sugarcane mosaic virus - SCMV), tại vùng Chương Mỹ, ðan Phượng (Hà Nội) và sản. bệnh khảm lùn ngô ở Việt Nam. Lần ñầu tiên ñã sản xuất ñược kháng huyết thanh chẩn ñoán nhanh bệnh virus khảm lùn ngô SCMV ở Việt Nam. 5. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu 5.1. ðối tượng nghiên