BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI          ……… VŨ NGỌC LAN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG INVITRO KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ĐIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG VÀ MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG HAI LOÀI LAN BẢN ĐỊA (DENDROBIUM NOBILE LINDL., DENDROBIUM CHRYSANTHUM LINDL.) TẠI HÀ NỘI Chuyên ngành : Trồng trọt Mã số : 62 62 01 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2012 Công trình hoàn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh 2. TS. Nguyễn Văn Giang Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 1 MỞ ðẦU 1. Tính cấp thiết của ñề tài Hoàng Thảo là một trong những chi lớn nhất của của họ Lan (Orchidaceae). Ở Việt Nam hiện biết 107 loài và 1 thứ thuộc chi Hoàng thảo, phân bố chủ yếu ở vùng núi suốt từ Bắc vào Nam và trên một số ñảo ven biển (ðào Thị Thanh Vân, ðặng Thị Tố Nga, 2008) [55]. Do vừa có giá trị làm cây hoa cảnh vừa làm cây dược liệu nên hai loài lan bản ñịa của vùng núi và trung du phía Bắc là Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.) và Ngọc vạn vàng (Dendrobium chrysanthum Lindl.) thuộc chi Hoàng thảo ñã bị khai thác kiệt dẫn ñến nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên. Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt nam, phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp nhân giống cây lan cho hệ số nhân cao, số lượng cây giống lớn và giá thành cây giống hợp lý (Trần Hợp, 1990) [12] và (Lê Văn Hòa, 2008) [9]. Tuy nhiên, cho ñến nay ở nước ta, việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô ñặc biệt sử dụng nuôi cấy mô cải tiến hai loài lan bản ñịa: Dendrobium nobile Lindl. (D.nobile) và Dendrobium chrysanthum Lindl. (D.chrysanthum) chưa có ñề tài nghiên cứu nào ñề cập ñến một cách chính tắc (Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm, 2007) [16]. Xuất phát từ những vấn ñề nêu trên, chúng tôi ñã tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng hai loài lan bản ñịa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội” với mong muốn góp phần làm cơ sở cho việc tạo ñược nguồn cây giống không chứa các chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật tổng hợp phục vụ cho sản xuất nguyên liệu dược. 2. Mục tiêu và yêu cầu của ñề tài 2.1. Mục tiêu của ñề tài Xây dựng quy trình nhân giống in vitro không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật tổng hợp ñể góp phần làm cơ sở duy trì, phát triển nguồn gen ñồng thời thúc ñẩy việc nuôi trồng cây lan rừng bản ñịa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. như một nghề sản xuất nguyên liệu dược mang lại hiệu quả kinh tế. 2.2. Yêu cầu của ñề tài. + Xác ñịnh ñược phương pháp thích hợp ñể tạo nguồn vật liệu in vitro ñối với loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. + Xác ñịnh ñược các bước kỹ thuật nhân nhanh in vitro theo hướng không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng tổng hợp ñối với loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. + Xác ñịnh ñược một số khâu kỹ thuật cải tiến trong nhân giống loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. ñể có hệ số nhân giống cao và chất lượng cây in vitro tốt. 2 + Xác ñịnh ñược một số khâu kỹ thuật nuôi trồng loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. trong giai ñoạn vườn ươm. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả của ñề tài có thể ñược sử dụng làm tài liệu tham khảo cho việc nghiên cứu, giảng dạy về hoa lan nói chung và chi lan Hoàng Thảo nói riêng. - Kết quả nghiên cứu của ñề tài là dẫn liệu khoa học có giá trị về khả năng nhân giống in vitro không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng và những chỉ dẫn ảnh hưởng của giá thể, chế phẩm dinh dưỡng ñến sinh trưởng của hai loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. thuộc chi Hoàng Thảo ñang có nguy cơ tuyệt chủng ở Việt Nam. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Góp phần bảo tồn và phát triển loài lan rừng bản ñịa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. - ðề tài ñã ñề xuất ñược quy trình nhân giống in vitro không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng và bước ñầu ñưa ra kỹ thuật chăm sóc cây thu thập của loài lan rừng bản ñịa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl tại Gia Lâm - Hà Nội 4. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài 4.1. ðối tượng nghiên cứu của ñề tài - Hai loài lan rừng bản ñịa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. thuộc chi Hoàng thảo. - Các nền môi trường nuôi cấy cơ bản của Vacin and Went, 1949 (VW); KnudsonC, 1965 (KC), Murashige-Skoog, 1962 (MS), Robert Ernst, 1979 (RE) - Dịch chiết hữu cơ từ các loại củ quả: khoai tây, cà rốt, táo, chuối chín - Các yếu tố ảnh hưởng ñến nhân nhanh in vitro: saccaroza, than hoạt tính, - Hệ thống bioreactor do hãng Sartorius sản xuất, mã hiệu máy Biostat Bplus có thể tích tối ña 10 lít. - Các giá thể: Bột dừa, xơ dừa, than củi, gỗ nhãn, dương xỉ. - Các chế phẩm dinh dưỡng: Antonic, Yogen, Komix, Growmore, ðầu trâu 4.2. Phạm vi nghiên cứu của ñề tài Các nghiên cứu ñược tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội; Học viện Hậu Cần - Ngọc Thụy - Long Biên - Hà Nội. 5. ðóng góp mới của luận án - ðã xây dựng ñược quy trình nhân giống in vitro cho hai loài lan bản ñịa D.nobile Lindl. và D.chrysanthum Lindl. có nguy cơ tuyệt chủng không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng. - ðã sử dụng thành công kỹ thuật cải tiến trong nhân nhanh hai loài lan bản ñịa bằng kỹ thuật thoáng khí và biorector ñạt hệ số nhân cao. 3 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) và hai loài lan bản ñịa Dendrobium nobile Lindl. (D.nobile) và Dendrobium chrysanthum Lindl. (D.chrysanthum) 1.1.1 Nguồn gốc và phân bố của chi Hoàng Thảo (Dendrobium) Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) ñược ñặt tên vào năm 1799, Dendrobium ñược hiểu là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là chi lan Hoàng Thảo, là chi lan phong phú nhất, trong họ lan có 1600 loài nguyên thủy ñược phân chia thành 40 nhóm, phân bố ở các vùng nhiệt ñới châu Á, tập trung nhiều nhất ở ðông Nam Á và châu Á. 1.1.2 Phân bố của chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) tại Việt Nam. Chi lan Hoàng thảo ở Việt nam rất ña dạng và phong phú nhưng sự phân bố của chúng khá ñặc thù cho các vùng ñịa lý khác nhau. Hai loài lan Thạch hộc (D.nobile) và Ngọc vạn vàng (D.chrysanthum) chỉ ñược tìm thấy ở vùng Tây bắc, ðông bắc và trung du Bắc bộ nước ta (Phạm Hoàng Hộ, 2000) [10] 1.1.3 ðặc ñiểm thực vật học chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) Rễ: có lớp mô xốp màu trắng ngà, nhiều công dụng như: hút nước, các muối khoáng, ngoài ra còn còn có khả năng bám chặt vào các giá thể mà chúng cần tiếp xúc. Thân: thuộc loại ña thân, hình chùy hoặc hình trụ, lóng dài. Lá: Lá hình mác có ñỉnh chia 2 thùy tù lệch, mọc cách hoặc mọc ñối nhau Hoa: thuộc cụm hoa bên, 2- 4 hoa, mọc trên thân còn lá, màu trắng tím trắng, có ñường kính 5- 6 cm. Cánh môi hình phễu, viền trắng, giữa môi có 1 ñốm lớn màu tím, khi trải phẳng có hình bầu dục, nở hoa vào các tháng trong năm. Quả: loại quả nang hình chùy, vỏ quả vừa phải, quả có 4 khối phấn, chứa rất nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh. 1.1.4 Một số ñặc ñiểm chính về 2 loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum Ngoài các ñặc ñiểm chung ra, 2 loài lan ñều thuộc loài có nguy cơ tuyệt chủng do chúng còn là nguyên liệu trong các bài thuốc gia truyền. Loài D.nobile chuyên trị ho khan, khô cổ; ñau lưng mỏi gối, thiểu năng sinh dục, còn loài D.chrysanthum thì chuyên trị khô miệng, phổi kết hạch; dạ dày thiếu vị chua; di tinh, ra mồ hôi trộm, thắt lưng ñau mỏi. 1.1.5 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác một số loài lan Hoàng Thảo bản ñịa tại miền Bắc Việt Nam. Hai loài lan D.nobile, D.chrysanthum vừa có giá trị thẩm mỹ và ñặc biệt là giá trị làm dược liệu cao nên chúng ñều ở mức ñộ nguy cấp tuyệt chủng trong tự nhiên. Các loài lan rừng Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl. rất cần ñược ưu tiên nghiên cứu nhân giống, nuôi trồng nhằm bảo tồn phát triển ñược nguồn tài nguyên thực vật quý giá của Việt Nam. 1.2 Cơ sở khoa học của các kỹ thuật nuôi cấy nhân giống trong ñề tài 1.2.1 Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô, tế bào (nhân giống in vitro) dựa trên cơ sở về tính toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào, mô 4 thực vật. ðây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật ñã thực sự mang lại hiệu quả kinh tế to lớn (Vũ Văn Vụ và cs, 2001) [57], (Hoàng Minh Tấn và cs, 2006) [37]. Ngoài ra, nhân giống vô tính in vitro cho phép nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các ñối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), hệ số nhân cao và cho ra các cá thể sạch bệnh, hoàn toàn ñồng nhất về mặt di truyền. ðó là ưu việt mà các phương pháp nhân giống khác không có ñược (Razan MK ., 1994) [89], (Hoàng Thị Lan Hương và cs, 2004) [18], (Võ Hà Giang, Ngô Xuân Bình, 2010) [8]. 1.2.2 Nhân giống bằng bioreactor Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô truyền thống, thường ñược sử dụng trên môi trường có agar (thạch) phải trải qua nhiều công ñoạn nuôi cấy, tỷ lệ mẫu nhiễm tăng, nhân công lao ñộng nhiều qua các khâu trong quá trình nhân giống, do ñó cần có một hệ thống nhân giống hiện ñại bioreactor có thể nâng tần suất nhân giống lên quy mô công nghiệp là cần thiết ñể giảm thấp chi phí sản xuất, giảm giá thành cây giống (Trần Văn Minh, 1999) [3] và (Nguyễn ðức Lương và cs, 2002) [26]. 1.2.3 Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro Môi trường nuôi cấy là ñiều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết ñịnh cho sự phân hóa tế bào và cơ quan trong nuôi cấy. Có nhiều loại môi trường nuôi cấy cho các loại thực vật khác nhau và mục ñích nuôi cấy khác nhau. Dựa vào thành phần và hàm lượng chất dinh dưỡng vô cơ có thể phân các môi trường nuôi cấy thành bốn nhóm sau (Trigiano R.N và Gray D.J., 1999) [101], (Nguyễn Quang Thạch, 2009) [43]. 1.3 Các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây lan 1.3.1 Nghiên cứu lựa chọn mẫu nuôi cấy ðể tạo các dòng vô tính mang ñặc tính di truyền của cơ thể mẹ, bắt buộc nguồn mẫu cấy ban ñầu phải là các mô, cơ quan sinh dưỡng của cây mẹ. Từ các mô, cơ quan sinh dưỡng này cần phải tạo ñược thể sinh chồi (protocorm) nhờ môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất ñiều tiết sinh trưởng thích hợp. Theo George, 1993 [62] ñã tổng hợp một số công trình nhân giống vô tính in vitro các loài lan chi Hoàng Thảo của các tác giả nước ngoài. 1.3.2 Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy Các tác giả Bùi Thị Tường Thu và Trần Văn Minh (2010) [47] cũng ñã thu ñược kết quả tương tự khi nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau ñến nuôi cấy mô lan. Trong năm loại môi trường nghiên cứu (MS, VW, KC, Orchmax và Lindemann), môi trường tốt nhất cho cây Dendrobium lai là MS và cho cây Cymbidium lai là Orchimax. Nền môi trường nuôi cấy với nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau của các nguyên tố khoáng ña, vi lượng, vitamin…có ảnh hưởng rất rõ ñến kết quả nuôi cấy in vitro cây lan. Nhiều tác giả ñã xác nhận dùng các môi trường Vacin và Went (VW), Murashige và Skoog (MS), Knudson C (KC) rất tốt cho cấy mô các loài thuộc họ lan. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của ba loại môi trường trên ñối với nuôi cấy 5 mô cây Dendrobium “Sonia”, các nhà nghiên cứu tại ðại học Mauritius kết luận môi trường MS có hiệu quả nhất trong nhân nhanh PLB (Puchoa, 2004). 1.3.3 Ảnh hưởng của nguồn các bon hữu cơ Ảnh hưởng của nguồn các bon hữu cơ ñến nuôi cấy in vitro cây lan ñã ñược nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu. Roslina Jawan và cộng sự ñã chứng minh ñược chồi Vanda dearei sinh trưởng tốt hơn trên môi trường nuôi cấy bổ sung ñường saccharose so với ñường glucose và fructose. ðồng thời trong 3 nồng ñộ ñường saccharose nghiên cứu (1, 2, 4%) thì nồng ñộ 2% là thích hợp nhất (Roslina Jawan et al., 2010) [91]. Nồng ñộ ñường 2% cũng ñược cho là phù hợp nhất trong nuôi cấy lan Cymbidium (Mamoru, 1980) [81]. Với cây Cattleya granulosa thì nồng ñộ saccaroza thích hợp cho sự sinh trưởng của chồi là 1,5% và cho sự tạo rễ là 3% (Pinto et al., 2010) [87]. 1.3.4 Ảnh hưởng của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên Ở nước ta, việc sử dụng các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên trong nuôi cấy in vitro cây lan ñã ñược nhiều tác giả thực hiện. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2003) [39] ñã khẳng ñịnh các hợp chất BA, Kinetin không có tác ñộng tích cực trong giai ñoạn nhân nhanh thể PLB và chồi của lan Hồ ñiệp. Mặt khác ñể tăng hệ số nhân và chất lượng của chồi in vitro nên sử dụng các loại dịch nghiền của khoai tây, cà rốt, chuối… Khi nuôi cấy in vitro D.pirimulinum, Nguyễn Thị Trang (2009) cũng chứng minh ñược môi trường MS không chứa chất ñiều tiết sinh trưởng là thích hợp ñể hình thành PLB từ hạt và ñể nhân nhanh PLB thì môi trường (MS+10% nước dừa+1g pepton+30g khoai tây+30g cà rốt)/l là hiệu quả nhất. Hiệu quả của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên cũng ñược khẳng ñịnh trong nuôi cấy in vitro cây Paphiopedilum hangianum Gurss (Nguyễn Quang Thạch và CS., 2010) [43]. 1.3.5 Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy Với cây lan nói chung, một số tác giả ñã bước ñầu nghiên cứu nhân giống in vitro trong bioreactor, nhằm nâng cao hệ số nhân, nâng cao chất lượng và giảm giá thành. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và ứng dụng hệ thống bioreator ñể nhân giống cây trồng còn ít, mới mẻ. Các nghiên cứu ñược thực hiện thời gian gần ñây ở trong và ngoài nước chỉ trên một số ñối tượng, ñặc biệt chưa có nơi nào thực hiện nghiên cứu trên các ñối tượng lan rừng D.nobile và D.chrysanthum 1.3.6 Nhân giống in vitro D.nobile và D.chrysanthum Năm 2002, Nihar Ranjan Nayak và cộng sự ñã nghiên cứu tạo protocorm từ lát cắt chồi lan D.nobile trên môi trường MS bổ sung một trong ba chất ñiều tiết sinh trưởng ZR 14.0 µM, N6-benzyladenine (BA) 11.0 µM hoặc kinetin (Kn). Kết quả 80% mẫu cấy của D.nobile hình thành protocorm. Kết quả tương tự cũng ñã thu nhận ñược bởi Malabaddi và cộng sự (2004) [92]. Cũng thời gian này, Ricardo T. de Faria và cộng sự (2004) [102] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng ñường trong môi trường ñến nuôi cấy in vitro lan D.nobile. Các tác giả Trung Quốc ñã tạo ñược thể PLB từ ñỉnh chồi D.nobile khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1-3mg/l hợp chất BA. Các tác giả này cũng ñã thiết lập ñược hệ thống nhân 6 nhanh PLB với hai công ñoạn là: ñầu tiên cảm ứng tạo PLB trên môi trường lỏng và sau ñó nhân PLB trên môi trường ñặc (Liao et al., 2006) [88]. Năm 2009, Rajeswari Vasudevan và Johannes van Stade [103] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi quả D.nobile ñến khả năng nảy mầm của hạt trên môi trường MS và P668. Sana Asghar và cộng sự (2011) [104] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Kinetin, IBA, αNAA và nước dừa ñến sự sinh trưởng in vitro của chồi D.nobile. Họ ñã xác ñịnh ñược môi trường MS bổ sung 2mg/ BA là tốt nhất ñể nhân nhanh chồi và môi trường MS+2mg/ IBA là tốt nhất cho sự ra rễ của chồi. Các công trình công bố về nuôi cấy in vitro D.chrysanthum còn khá hạn chế. Kalyan Kumar De và cộng sự [85] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa (15 và 25%) và αNAA (0,1mg/l và 0,5mg/l) ñến sự nảy mầm của hạt tách từ quả 70 ngày tuổi trên môi trường KC. Các tác giả này ñã thu ñược kết quả là: môi trường KC+ 15% nước dừa+0,1% αNAA cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất (90%) và các cây con in vitro khi chuyển ra vườm ươm có tỷ lệ sống ñạt 98-99% (Kalyan Kumar De et al., 2006) [85]. Koravisd Nathalang (Thái Lan) [86] ñã gieo hạt của quả D.chrysanthum trên môi trường KC bổ sung 15% nước dừa và 1g/l than hoạt tính. Các chồi mầm sau 8 tháng ñã ñược chuyển sang môi trường KC+15% nước dừa và bổ sung thêm αNAA (0, 0.5, 1, 1.5, 2 và 2.5 ppm), các axít amin (200 ppm của glutamine, alanine và methionine) và saccarose (20, 40 và 60 g/l). 1.4 Các nghiên cứu về nuôi trồng lan Hoàng thảo 1.4.1 Các ñiều kiện cơ bản ñể trồng lan Dendrobium Chi Dendrobium gồm nhiều loài thích nghi với các ñiều kiện sinh thái khác nhau. Yêu cầu nhiệt ñộ có thể chia Dendrobium làm 2 nhóm chính: nhóm ưa lạnh và nhóm ưa nóng (Dương ðức Huyến, 2007) [17]. Dendrobium cũng như ña số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong ñiều kiện không khí ẩm nhưng thoáng khí, vào ban ngày cây cần ñộ ẩm khoảng 40-60%, ban ñêm ñộ ẩm thích hợp từ 60-90% thì cây sẽ phát triển tốt hơn (http://orcchid.com.vn .) [110]. Thời gian chiếu sáng trong ngày cũng là ñiều kiện quyết ñịnh sự ra hoa của một số loài chịu ảnh hưởng bởi quang kỳ, ví dụ: lan Giả Hạc, Long Tu, Kim ðiệp chỉ ra hoa với ñiều kiện ánh sáng có thời gian chiếu ít hơn 10 giờ trong ngày. (http://orcchid.com.vn .) [110]. Giá thể của Dendrobium cần ñảm bảo chậu trồng phải thoáng, không úng nước. Ngoài ra, Dinh dưỡng ñóng vai trò rất quan trọng ñối với cây lan, nhất là ñối với việc trồng qui mô lớn nhằm khai thác hàng hoá. Trong cả chu kỳ sống của cây lan cần 13 chất dinh dưỡng khoáng, thuộc các nhóm ña, trung và vi lượng. Dinh dưỡng ña lượng là ðạm (N), Lân (P) và Kali (K). Dinh dưỡng trung lượng bao gồm Lưu huỳnh (S), Magiê (Mg) và Canxi (Ca). Dinh dưỡng vi lượng là Sắt (Fe), Kẽm (Zn), ðồng (Cu), Mangan (Mn), Bo (B), Molypñen (Mo) và Clo (Cl) (Nguyễn Hạc Thủy, 2000) [48] và (Trần Văn Huân, 2002) [15]. Khi nuôi trồng cây tại vườn ươm và vườn sản xuất, cây lan thường gặp một số sâu bệnh phổ biến do nấm, vi khuẩn, sâu, chúng ta phải thực hiện chế ñộ vệ sinh vườn, phun phòng trừ ñịnh kỳ (www.hoacaycanh.com) [107]. 7 1.4.2. Nghiên cứu về nuôi trồng cây lan Dendrobium sau nuôi cấy mô Giá thể có ý nghĩa quan trọng ñối với nuôi trồng cây lan, ñặc biệt là trong giai ñoạn vườm ươm. Sử dụng giá thể phù hợp sẽ giữ ẩm giúp cho cây sinh trưởng, phát triển tốt. Nhiều tác giả Trung quốc ñã quan tâm nghiên cứu về ảnh hưởng của giá thể ñến sinh trưởng, phát triển của cây lan Dendrobium. Gong Jian-ying và cộng sự (2007) [63] nhận thấy giá thể gồm ñá núi lửa + xơ dừa + than củi theo tỷ lệ 1:2:1 thích hợp cho trồng lan Dendrobium. Theo Pan Chun- xiang và cộng sự (2009) [85] các loại giá thể vỏ cây, mùn cưa, gạch vụn…ñã ảnh hưởng ñến cấu trúc rễ của cây D.chrysanthum. Fan Min Fu Yulan (2008) [60] cho rằng giá thể phù hợp ñể trồng D.nobile là vỏ cây + rong biển (dớn). Trong khi Zhang Feng-yin và cộng sự (2009) [105] kết luận, sau khi ra cây trên 6 loại giá thể khác nhau lại khẳng ñịnh giá thể tốt nhất cho cây D.nobile cấy mô là xơ dừa. Wen Gang và cộng sự (2009) [106] cho rằng mùn cưa là giá thể tốt hơn cho D.nobile so với vỏ cây, rêu hay ñất mùn. Ngoài ra, trong giai ñoạn vườn ươm, cây lan cấy mô ñược cung cấp dinh dưỡng dưới dạng phun dung dịch phân bón lên toàn bộ bề mặt cây. Theo Ken Leonhardt (1999) [72] cây lan Dendrobium cấy mô sau khi ra cây 2 tuần mới cần cung cấp dinh dưỡng và tỷ lệ phân bón N:P:K phù hợp là 3:1:1 hoặc 3:1:2 với chu kỳ phun là 01lần/tuần, khi cây chuyển sang chậu ñơn thì dùng tỷ lệ phân bón N:P:K là 14:14:14. Fan Min Fu Yulan (2008) [60] cũng nhận ñược kết quả tốt nhất khi dùng tỷ lệ phân bón N:P:K là 1:1:1 với nồng ñộ 0,7% cho cây lan D.nobile một năm tuổi. Bên cạnh phân bón, một số chế phẩm sinh học cũng ñã ñược sử dụng ñể kích thích sinh trưởng, phát triển của lan Dendrobium. Leena Kechacupt (1987) [78] ñã phun Triacontanol cho cây Dendrobium Hepa ở giai ñoạn tám tháng tuổi và kết luận rằng dung dịch Triacontanol nồng ñộ 1mg/l ñã làm tăng số số lượng cành hoa/cây và làm cây ra hoa sớm hơn ñối chứng. Uthairatanakij và cộng sự (2008) [104] ñã sử dụng dung dịch Chitosan với nồng ñộ từ 200 ñến 600mg/l ñể làm tăng khối lượng cành hoa, kích thước cánh hoa của lan Dendrobium “Sonia”. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) ñược thu thập tại: Hòa Bình. + Chồi mầm, quả, cây thu thập của hai loài lan nghiên cứu D.nobile và D.chrysanthum + Các nền môi trường nuôi cấy mô cơ bản theo Vacin and Went, 1949 (VW); KnudsonC, 1965 (KC), Murashige-Skoog, 1962 (MS), Robert Ernst, 1979 (RE) + Dịch chiết hữu cơ từ các loại củ quả: khoai tây, cà rốt, táo, chuối chín + Các yếu tố ảnh hưởng ñến nhân nhanh in vitro: saccaroza, than hoạt tính. + Hệ thống bioreactor do hãng Sartorius sản xuất, mã hiệu máy Biostat Bplus, bình nuôi có thể tích tối ña 10 lít. 8 + Các giá thể: Bột dừa, xơ dừa, than củi, gỗ nhãn, dương xỉ. + Các chế phẩm dinh dưỡng: Antonic, Yogen, Komix, Growmore, ðầu trâu. 2.2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu lựa chọn phương pháp khử trùng và cơ quan nuôi cấy ñể tạo nguồn vật liệu in vitro với hai loài lan bản ñịa nghiên cứu D.nobile và D.chrysanthum Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ñến khả năng nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh in vitro ñối với hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum theo phương pháp nuôi cấy mô truyền thống. Nghiên cứu khả năng nhân nhanh in vitro ñối với hai loài lan bản ñịa nghiên cứu theo phương pháp nuôi cấy cải tiến. Nghiên cứu ảnh hưởng thời vụ ra cây, giá thể, chế phẩm dinh dưỡng ñến tỷ lệ sống và ñộng thái tăng chiều cao, số lá của cây con in vitro hai loài lan bản ñịa nghiên cứu D.nobile và D.chrysanthum tại vườn ươm, vườn sản xuất. Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể, chế phẩm dinh dưỡng ñến sinh trưởng phát triển trong giai ñoạn nuôi trồng cây thu thập của hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum. 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Bố trí các thí nghiệm theo nội dung nghiên cứu Thí nghiệm 1: Xác ñịnh hiệu quả khử trùng ñối với chồi mầm trong H 2 O 2 2% và HgCl 2 0,1% của hai loài lan D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 2: Xác ñịnh phương pháp khử trùng ñối với quả lan trên hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi của hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan bản ñịa D.nobile Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi của hai loài lan D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi của hai loài lan nghiên cứu D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi trên hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của nền môi trường cơ bản ñến sinh trưởng của chồi lan với hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng tới khả năng [...]... lư ng cây con ngoài vư n ươm c a 02 loài lan r ng D .nobile và D .chrysanthum B ng 3.19 nh hư ng c a th i v tr ng ñ n t l s ng và hình thái cây con in vitro ngoài vư n ươm c a 02 loài lan r ng D .nobile và D .chrysanthum (Sau 01 tháng nuôi tr ng) CT V xuân, 8 /2/ 2011 V hè, 2/ 5 /20 10 V thu, 3/9 /20 10 T l s Dn 89,60 62, 22 79,30 ng (%) Dc 92, 25 62, 22 79,30 Hình thái cây con in vitro Dn Dc Cây xanh ñ m, ra r m... Dc H2O2 2% kép, l n 1 trong 5 23 ,33 phút và l n 2 trong 2 phút L n 1 trong H2O2 2% 5 phút, l n 61,11 2 trong HgCl2 0,1% 1 phút HgCl2 0,1% kép, l n 1 trong 3 37,78 phút và l n 2 trong 1 phút T l m u nhi m (%) Dn Dc T l m u s ng (%) Dn Dc 24 ,56 72, 23 72, 30 4,44 3,14 57, 42 36,67 40,56 2, 22 2, 02 40, 02 53,33 56,50 8,89 3,48 3.1 .2 Xác ñ nh phương pháp kh trùng ñ i v i qu lan B ng 3 .2 nh hư ng c a phương pháp. .. D .chrysanthum Thí nghi m 20 : nh hư ng c a ch ph m dinh dư ng qua lá ñ n sinh trư ng c a 02 loài lan r ng thu th p D .nobile và D .chrysanthum Thí nghi m 21 : Nghiên c u nh hư ng c a các ch ph m dinh dư ng ñ n chi u cao, s lá cây in vitro trên hai loài lan (D .nobile và D .chrysanthum) ngoài vư n ươm Thí nghi m 22 : Nghiên c u nh hư ng c a giá th tr ng ñ n sinh trư ng trên hai loài lan r ng thu th p D .nobile. .. protocorm/ c m H s nhân Ngày Sau (l n) c y c y8 m u tu n 50 21 0,67 4 ,21 50 22 2,54 4,45 50 125 ,68 2, 51 50 89,67 1,79 50 80,53 1,61 50 1 12, 37 2, 25 50 80,58 1,61 50 71,69 1,45 0,74 0, 92 0, 82 0,13 1,5 sung (N n môi S T l ch i t o phát ch i sinh (%) 50 50 50 69,15 1,38 89,11 1,78 81 ,27 1,63 11,31 0,15 2, 7 2, 7 trư ng KC + 100ml nư c 19 10 16 27 22 25 28 13 8,4 4,3 11,3 23 ,1 21 ,6 18,3 25 ,7 15,3 10 14 18 12, 5 13,5 18,0... D .nobile và D .chrysanthum vư n s n xu t Thí nghi m 23 : nh hư ng c a ch ph m dinh dư ng qua lá ñ n sinh trư ng c a hai loài lan b n ñ a thu th p D .nobile và D .chrysanthum Các thí nghi m t 19 ñ n 23 ñư c b trí theo phương pháp thí nghi m ñ ng ru ng c a Ph m Chí Thành 2. 3 .2 Các ch tiêu theo dõi và phương pháp ñánh giá 2. 3 .2. 1 Các ch tiêu theo dõi trong nuôi c y invitro * Các ch tiêu theo dõi trong nuôi c y in. .. 7,0 7,0 7 ,2 5,7 0 ,2 3 ,2 5,5 7 ,2 7,4 7,6 7,4 0 ,2 3,7 6,8 7,8 7,6 8,64 7,96 0,48 3,4 Ghi chú: Dn: D .nobile ; Dc: D .chrysanthum 3.5 Nghiên c u nh hư ng c a m t s tác nhân trong giai ño n nuôi tr ng cây thu th p c a hai loài lan r ng D .nobile và D .chrysanthum 3.5.1 Nghiên c u nh hư ng c a giá th tr ng ñ n sinh trư ng trên 02 loài lan r ng thu th p D .nobile và D .chrysanthum vư n s n xu t V i loài D .nobile, ... ng th H s nhân sinh ch i/c m th sinh ch i/ th sinh ch i (l n) c m (mg) ban ñ u 50,0 52, 0 21 ,5 1,04 50,0 165,5 22 ,4 3,31 50,0 20 1,7 23 ,0 4,04 50,0 318,3 22 ,8 6,37 50,0 96,7 22 ,0 1,93 5,11 0,14 2, 3 2, 3 ng KC + 100ml nư c d a + 60g khoai tây + 6g agar)/lít 19 Như v y nuôi c y trong môi trư ng ñ c có màng l c thoáng khí ñã c i thi n h s nhân protocorm t 4 ,22 l n/8 tu n khi s d ng nút bông trong nuôi c y... cao 4,88 cm/cây; 4,44 lá/cây; 3,69 r /cây v i D .nobile và v i D .chrysanthum là 5 ,28 cm/cây; 4,34 lá/cây; 4,89 r /cây 3 .2. 5 Nghiên c u nh hư ng c a cư ng ñ ánh sáng t i kh năng sinh trư ng c a ch i lan r ng D .nobile và D .chrysanthum B ng 3. 12 nh hư ng c a cư ng ñ chi u sáng ñ n sinh trư ng ch i c a 02 loài lan r ng D .nobile và D chrysanthum (Sau 30 ngày nuôi c y) Ch tiêu Chi u cao TB/cây (cm) Dn Dc S... TB/cây r TB (chi c) (cm) Sau 30 ngày Sau 30 ngày Dn Dc Dn Dc 8,89 6,67 80,00 83,33 3, 02 3,39 1 ,27 1,37 ðC+0,5g 66,67 THT ðC+1,0g 44,44 THT 15,56 100,00 100,00 3,46 3,44 2, 12 2 ,20 72, 22 100,00 100,00 3 ,22 3,76 2, 03 2, 28 38,89 66,67 100,00 100,00 3,09 3,43 2, 30 2, 30 15,56 52, 22 100,00 100,00 2, 91 3,13 2, 54 2, 65 0 ,22 3,5 0 ,26 5,8 Hình thái r Sau 30 ngày Dn Dc V a, V a, tr ng ngà tr ng ngà M p, tròn, V a,... 11,4 12, 7 10 ,2 12, 1 0,48 2, 2 4, 82 5 ,22 4,44 5,05 7,4 9,1 7,15 7,55 0, 42 2,8 Dài cánh môi (cm) 2, 77 3 ,27 2, 68 2, 4 R ng cánh môi (cm) 1,96 2, 29 1,98 1, 92 23 Trong 4 ch ph m dinh dư ng ñư c s d ng trong thí nghi m thì Yogen (CT2) có hi u qu cao nh t v t l cây ra hoa, s hoa trung bình/cành, ñư ng kính hoa so v i các công th c s d ng các lo i ch ph m dinh dư ng khác, ñ sai khác tin c y 95% S d ng phun dinh . VW 4,4 7 4,0 7 4,1 1 4,0 6 2, 29 4 ,2 9 CT2: KC 3,6 8 3,0 7 3 ,2 9 3,5 9 2, 56 4,5 0 CT3: MS 3,8 7 3 ,2 7 4,1 6 3,8 6 3,3 7 4,3 7 CT4: RE 4,8 8 5 ,2 8 4,4 4 4,3 4 3,6 9 4,8 9 LSD 0,0 5 0,3 8 0,1 9 0 ,2 9 0 ,2 5 0,0 3. 1 5,0 0 1 5,0 0 4 3,7 0 4 0,5 5 2, 91 2, 70 KC 1 5,0 0 1 5,0 0 4 5,4 0 4 1,0 5 3,0 3 2, 74 MS 1 5,0 0 1 5,0 0 4 7,1 3 4 3,4 0 3,0 8 2, 89 RE 1 5,0 0 1 5,0 0 4 0, 38 3 8,3 8 2, 69 2, 56 LSD 0,0 5 2, 36 2, 56 0,0 3 0,0 4 CV ( %) 4,0 . ( %) VW 0,5 1,8 5 50 17 6, 32 3,5 3 22 1 1,1 KC 0,5 2, 26 50 21 0,0 6 4 ,2 0 18 7,9 MS 0,5 2, 10 50 19 0,5 3 3,8 1 20 9,5 RE 0,5 1,8 4 50 16 6,4 8 3,3 3 25 1 3,0 LSD 0.05 0,1 3,6 0,1 CV ( %) 3,8 4,0 4,0