Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** NGUYỄN CẨM HÀ NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC SQUALENE TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI TẢO BIỂN PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, năm 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** Nguyễn Cẩm Hà NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC SQUALENE TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI TẢO BIỂN PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số : 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. Đặng Diễm Hồng Hà Nội, năm 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đặng Diễm Hồng – Trưởng phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi đều kiện, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi mong muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban giám hiệu Trường Đại học Thái Nguyên, cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Bên cạnh đó, tôi cũng đã nhận được sự ủng hộ nhiệt tình và các ý kiến đóng góp quý báu của tất cả các Anh/Chị và các Bạn đồng nghiệp của Phòng Công nghệ Tảo. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn mọi sự giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng tôi xin được gửi lời cảm ơn đến người Mẹ của tôi, đến gia đình người thân cũng như Bạn bè đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên cao học Nguyễn Cẩm Hà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Nguyễn Cẩm Hà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về squalene 3 1.1.1. Nguồn gốc squalene 3 1.1.2. Cấu trúc squalene 3 1.1.3. Tính chất hóa học của squalene 4 1.1.4. Con đường sinh tổng hợp cholesterol 5 1.2. Vai trò của squalene 6 1.2.1. Squalene là một tác nhân chống lão hóa 6 1.2.2. Vai trò của squalene đối với sức khỏe con người 9 1.2.2.1. Trong điều trị và ngăn ngừa bệnh ung thư 9 1.2.2.2. Vai trò của squalene trong giải độc 11 1.2.2.3. Đối với các bệnh khác 11 1.2.3. Vai trò của squalene trong công nghiệp mỹ phẩm 12 1.2.4. Vai trò của squalene đối với các ngành công nghiệp khác 14 1.3. Các nguồn khai thác squalene 14 1.4. Nghiên cứu khai thác squalene từ vi tảo trên thế giới 18 1.5. Một số hướng nghiên cứu về squalene trên thế giới 20 1.6. Nghiên cứu trong nước về squalene 21 1.7. Một số giới thiệu về chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium của Việt Nam 22 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 25 2.1.1. Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy 25 2.1.2. Hóa chất 26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.1.3. Thiết bị 26 2.2. Phương pháp 27 2.2.1. Xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào 27 2.2.2. Xác định hình thái và kích thước tế bào bằng kính hiển vi quang học 27 2.2.3. Xác định sinh trưởng qua sinh khối khô 28 2.2.4. Phương pháp nhuộn lipid bằng Nile red 28 2.2.5. Tách chiết lipit 29 2.2.6. Định lượng squalene bằng phương pháp so màu 29 2.2.7. Tách chiết và tinh sạch squalene thô 30 2.2.7.1. Tách chiết squalene thô 30 2.2.7.2. Tinh sạch squalene thô 31 2.2.8. Xác định squalene bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng 31 2.2.9. Tinh sạch squalene bằng phương pháp sắc kí cột 32 2.2.10. Xác định squalene bằng sắc ký lỏng cao áp 32 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Nuôi trồng đủ sinh khối vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng làm nguyên liệu cho tách chiết squalene 33 3.2. Sàng lọc nhanh các chủng vi tảo có tiềm năng sản xuất squalene cao 36 3.2.1. Phát hiện nhanh lipit nội bào bằng nhuộm Nile Red 36 3.2.2. Phân tích lipit tổng số của các loài vi tảo biển được sử dụng trong nghiên cứu 38 3.2.3. Xác định hàm lượng squalene trong sinh khối tảo bằng phương pháp so màu 38 3.2.4. Xác định hàm lượng squalene trong sinh khối bình lên men 30 lít bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp 43 3.2.4. 1. Tách chiết lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số 43 3.2.4.2. Xác định squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp 43 3.2.4.3. Sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) - bản nhỏ để sàng lọc nhanh chóng các chủng vi tảo biển chứa hàm lượng squalene cao 47 3.3. Tinh sạch squalene bằng phương pháp sắc kí cột 48 3.3.1. Xác định squalene bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.3.2. Phân tách và tinh sạch squalene bằng sắc ký cột silicagel 49 3.4. Quy trình tách chiết squalene từ sinh khối tảo dị dưỡng S. mangrovei PQ6 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Nguyễn Cẩm Hà - K16 i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Từ viết tắt Viết đầy đủ 1 Cs Cộng sự 2 DHA Docosahexaenoic Acid (C22: 6n-3) 3 EPA Eicosapentaenoic Acid (C20:5n-3) 4 GC Gas chromatography (sắc ký khí) 5 GC-MS Gas chromatography mass spectrometry 6 GOT Glutamatoxaloacetat transaminase 7 GPT Glutamate pyruvate transaminase 8 HCB Hexan chloro benzene 9 HPLC High performance liquid chromatography (sắc ký lỏng cao áp) 10 HMG-C Hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A 11 LDL-C Low Density Lipoprotein –Cholesterol (lipoprotein tỷ trọng thấp gắn với cholesterol) 12 MJA Methyl jasmonate 13 PFAD Palm fatty acid distillate 14 Ras Rat sarcoma 15 Rf Retention factor 16 17 SKK SKT Sinh khối khô Sinh khối tươi 18 19 20 TLC TBFN VTB Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng) Terbinafine Vi tảo biển Nguyễn Cẩm Hà - K16 ii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các thông số lý hóa của squalene 5 Bảng 1.2. Thành phần bã nhờn ở người 13 Bảng 1.3. Hàm lượng squalene trong các loại dầu 16 Bảng 3.1. Danh sách 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng, 2 loài dị dưỡng và điều kiện nuôi cấy chúng trong điều kiện phòng thí nghiệm 34 Bảng 3.2. Hàm lượng lipit của một số loài VTB đã được sử dụng trong nghiên cứu 38 Bảng 3.3. Hàm lượng squalene của 7 loài vi tảo biển nghiên cứu 41 Bảng 3.4. Hàm lượng squalene của chủng PQ6 được phân tích bằng TLC và HPLC 46 Nguyễn Cẩm Hà - K16 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene (C 30 H 50 ) 4 Hình 1.2. Squalene synthase trong con đường sinh tổng hợp cholesterol 7 Hình 1.3. Mặt cắt các tuyến bã nhờn ở da người 13 Hình 1.4. Hình thái của tế bào Schizochytrium 23 Hình 3.1. Hình thái tế bào của 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng chụp dưới kính hiển vi quang học 34 Hình 3.2. Hình chụp khuẩn lạc và tế bào của chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 (A) và Thraustochytrium striatum (B) 35 Hình 3.3. Hệ thống nuôi trồng các loài vi tảo biển quang tự dưỡng ở các quy mô bình từ 250 mL đến bình 10 lít 35 Hình 3.4. Hình ảnh minh họa nuôi trồng chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 và 36 Hình 3.5. Ảnh chụp tế bào dưới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển vi huỳnh quang sau khi nhuộm Nile Red (B) của 5 chủng vi tảo quang tự dưỡng và 2 chủng vi tảo dị dưỡng với độ phóng đại 1500 lần. 37 Hình 3.6. Ảnh minh họa cho các giai đoạn khác nhau của phản ứng tạo màu đối với squalene chuẩn (1, 2, 3, 4, 5, 6 tương ứng với các nồng độ 0,01; 0,04; 0,05; 0,06; 0,08; 0,10 mg) trong phương pháp xác định squalene bằng so màu. 39 Hình 3.7. Ảnh minh họa quá trình xác định hàm lượng squalene ở các loài tảo quang tự dưỡng và dị dưỡng bằng phương pháp so màu 40 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng squalene chuẩn và OD 400 40 Hình 3.9. Ảnh minh họa cho quá trình phân tách lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số 43 Hình 3.10. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipit không xà phòng hóa tách chiết từ sinh khối chủng PQ6 44 Hình 3.11. Đường chuẩn về mối tương quan giữa hàm lượng squalene và diện tích peak 45 Hình 3.12. Sắc ký đồ của squalene chuẩn xác định bằng sắc ký lớp mỏng TLC và HPLC 45 [...]... nghệ Tảo, Vi n Công nghệ sinh học, Vi n Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Vi t Nam hiện đang có một tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng của Vi t Nam Nhiều loài vi tảo trong tập đoàn giống có thể là nguồn cung cấp cho vi c tách chiết squalene trên quy mô lớn Chính vì vậy, chúng tôi mong muốn tiến hành đề tài nghiên cứu Nghiên cứu sàng lọc squalene từ một số chủng vi tảo biển phân lập ở Vi t... sạch squalene Nguyễn Cẩm Hà - K16 23 Nhằm đi đến mục tiêu lớn là cung cấp được các sản phẩm giàu squalene phục vụ cho sức khỏe cộng đồng từ nguồn tài nguyên thiên nhiên sẵn có trong nước trong đó có tảo, chúng tôi mong muốn tiến hành đề tài nghiên cứu Nghiên cứu sàng lọc squalene từ một số chủng vi tảo biển phân lập ở Vi t Nam nhằm cung cấp cơ sở khoa học ban đầu về hàm lượng squalene ở vi tảo biển Vi t... văn nghiên cứu có một số nội dung như sau: 1 Sàng lọc một số chủng vi tảo biển của Vi t Nam có khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn và có hàm lượng squalene cao 2 Xây dựng các phương pháp xác định nhanh chóng hàm lượng squalene phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Vi t Nam để sử dụng cho vi c sàng lọc nhanh các chủng tiềm năng cho sản xuất squalene 3 Bước đầu tách chiết và làm sạch squalene từ chủng. .. Vi t Nam nhằm cung cấp cơ sở khoa học ban đầu về hàm lượng squalene ở vi tảo biển Vi t Nam, có được các phương pháp nghiên cứu phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm về tách chiết, xác định squalene trong sinh khối vi tảo biển để bước đầu tìm ra được một số chủng tiềm năng cho vi c nghiên cứu sâu hơn theo định hướng sử dụng squalene làm thực phẩm chức năng và dược phẩm trong tương lai ở Vi t Nam Luận... hưởng từ các đề tài nghiên cứu trước đây, một số loài vi tảo biển quang tự dưỡng hội tụ được một số tiêu chuẩn về năng xuất nuôi trồng, khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn với công nghệ nuôi trồng đã được nghiên cứu tương đối kỹ ở Vi t Nam, chúng tôi sẽ tập trung vào một số loài như Nannocloropsis oculata, Chlorella sp., Tetraselmis sp… Tuy nhiên, với một số loài vi tảo biển quang tự dưỡng nêu trên vi c... như là một nguồn tự nhiên cho sản xuất thương mại hóa squalene có chất lượng cao 1.6 Nghiên cứu trong nƣớc về squalene Ở Vi t Nam cho đến nay chưa có một công trình nghiên cứu khoa học nào về squalene từ các cơ thể sống (kể cả động, thực vật và vi sinh vật) Trong khi đó, Vi t Nam lại là một quốc gia biển, rất đa dạng về tảo biển, có rất nhiều loài đặc hữu hứa hẹn là nguồn tiềm năng sản xuất squalene. .. dược phẩm Vi c sàng lọc nhanh được các chủng tảo có khả năng tổng hợp squalene tự nhiên cao cũng như nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh khối tảo giàu squalene là rất cần thiết Vi c sàng lọc nhanh các chủng/ loài vi tảo biển có hàm lượng squalene cao cho mục đích sản xuất thương mại squalene sau này cần phải hội tụ một số tiêu chuẩn như sau: - Phải là chủng/ loài có chứa hàm lượng squalene cao;... vật có khả năng sản xuất squalene, cần phải sàng lọc được các chủng từ môi trường biển tự nhiên khác nhau Các chủng phân lập được cần phải xác định được khả năng sản xuất trên quy mô lớn các axít béo hoặc lipít Trong số các chủng phân lập được, cần xác định được các chủng mới có khả năng sản xuất một lượng lớn squalene hay không? Tốc độ sản xuất squalene của các chủng phân lập được cũng cần phải được... tảo biển Vi t Nam; có được các phương pháp nghiên cứu phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm về tách chiết, xác định squalene trong sinh khối vi tảo biển để bước đầu tìm ra được một số chủng tiềm năng cho vi c nghiên cứu sâu hơn theo định hướng sử dụng squalene làm thực phẩm chức năng và dược phẩm trong tương lai ở Vi t Nam Nguyễn Cẩm Hà - K16 24 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu,... quan chặt chẽ đến khu vực địa lý, sinh thái nơi phân bố chủng Hầu hết các chủng có hàm lượng squalene cao được phân lập từ vùng bờ biển Okinawa, một khu vực cận nhiệt đới của Nhật Bản trong khi các chủng chứa lượng squalene thấp hơn được phân lập từ các khu vực địa lý rộng từ vùng nhiệt đới đến cận Bắc Cực Một số chủng Aurantiochytrium có chứa hàm lượng cao squalene đã được phát hiện như Yonez5-1 (317,74 . cấp cho vi c tách chiết squalene trên quy mô lớn. Chính vì vậy, chúng tôi mong muốn tiến hành đề tài nghiên cứu Nghiên cứu sàng lọc squalene từ một số chủng vi tảo biển phân lập ở Vi t Nam nhằm. VẬT *** Nguyễn Cẩm Hà NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC SQUALENE TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI TẢO BIỂN PHÂN LẬP Ở VI T NAM Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số : 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ. thác squalene 14 1.4. Nghiên cứu khai thác squalene từ vi tảo trên thế giới 18 1.5. Một số hướng nghiên cứu về squalene trên thế giới 20 1.6. Nghiên cứu trong nước về squalene 21 1.7. Một số