LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp tại trường tôi luôn nhận được sự quan tâm giúp đỡ của các thấy cô, gia đình và bạn bè. Nhân đây cho tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô giáo khoa Thú y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ suốt 5 năm học vừa qua. Đặc biệt, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Bùi Trần Anh Đào người đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để giúp tôi hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp của mình. Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị Phòng Thí Nghiệm trọng điểm CNSH thú y, các thầy cô giáo làm việc tại Bộ Môn Bệnh lý đã giúp đỡ tôi suốt thời gian qua. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn động viên và là chỗ dựa vững chắc cho tôi suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thu Hồng i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1. Nguồn gốc các lợn con sau cai sữa trong nghiên cứu Error: Reference source not found Bảng 4.2. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn sau cai sữa mắc PCV2 Error: Reference source not found Bảng 4.3. Bệnh tích đại thể của lợn sau cai sữa mắc PCV2 Error: Reference source not found Bảng 4.4. Biến đổi bệnh tích vi thể một số cơ quan lợn sau cai sữa mắc PCV2 Error: Reference source not found Bảng 4.5. Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang 45 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hình ảnh của Porcine circovirus Error: Reference source not found Hình 4.1. Lợn còi cọc, lông xù Error: Reference source not found Hình 4.2. Lợn còi cọc, ỉa chảy Error: Reference source not found Hình 4.3. Sưng hạch bẹn nông Error: Reference source not found Hình 4.4. Lợn còi cọc Error: Reference source not found Hình 4.5. Lợn bị viêm da Error: Reference source not found Hình 4.6. Lợn biểu hiện thở khó Error: Reference source not found Hình 4.7. Gan sưng, tụ máu Error: Reference source not found Hình 4.8. Phổi xuất huyết Error: Reference source not found Hình 4.9. Hạch màng treo ruột sưng Error: Reference source not found Hình 4.10. Ruột xuất huyết Error: Reference source not found Hình 4.11 Thận sưng, xuất huyết Error: Reference source not found Hình 4.12 Hạch lympho sưng, xuất huyết Error: Reference source not found Hình 4.13. Gan sung huyết và thâm nhiễm tế bào viêm ( HE 10X ) Error: Reference source not found Hình 4.14. Thâm nhiễm tế bào viêm ở gan lợn mắc PCV2 ( H.E 40X ) Error: Reference source not found Hình 4.15. Lách xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm ( HE 10X ) Error: Reference source not found Hình 4.16. Tim sung huyết, thâm nhiễm tế bào viêm ( HE 10X )Error: Reference source not found Hình 4.17. Phổi lợn mắc PCV2 sung huyết nghiêm trọng ( HE 10X ) Error: Reference source not found Hình 4.18. Viêm phổi kẽ ( HE 40X ) Error: Reference source not found Hình 4.19. Suy giảm tế bào lympho ở hạch bạch huyết (HE 40X) Error: Reference source not found iv Hình 4.20. Thâm nhiễm tế bào bạch cầu ái toan và tế bào khổng lồ ở hạch ( HE 40X ) Error: Reference source not found Hình 4.21. Tế bào khổng lồ ở lách Error: Reference source not found Hình 4.22. Thận xuất huyết Error: Reference source not found Hình 4.23. Tế bào khổng lồ nhiều nhân ở hạch lympho ( HE 40X) Error: Reference source not found Hình 4.24. Ruột thâm nhiễm tế bào viêm (HE 40X ). Error: Reference source not found Hình 4.25. Hình ảnh virus phân lập ở hạch lympho (IF10X) Error: Reference source not found v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AND : Deoxyribonucleic acid DTL : Dịch tả lợn ELISA : Enzym Linked Immunosorbent Assay IHC : Immunohistochemistry IFA : Indirect Immunofluorescense Assay IPMA : Immuno Peroxidae Monolayer Assay HE : Hematoxilin – Eosin nPCR : Nested Polymerase Chain Reaction ORF : Open Reading Frame PBS : Phosphate- Buffered- Saline PCR : Polymerase Chain Reaction PCR-RELP : PCR- Restriction fragment lenghth polymorphism PCV : Porcine Circo Virus PCV 1 : Porcine Circo Virus type 1 PCV 2 : Porcine Circo Virus type 2 PCVAD : Porcine Circo Virus Associated Disease PDNS : Porcine Dermatitis PK15 : Pig Kidney 15 PMWS : Postweaning multisystemic wasting syndrome PNP : Proliferaning Necrotizing Pneumonia PRDC : Porcine Respiratory Disease Complex PRRS : Porcine Reproductive & Respiratory syndrome PRRSV : Porcine Reproductive & Respiratory syndrome Virus vi PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, ngành chăn nuôi lợn ở Việt Nam đã có những bước phát triển mạnh mẽ để đáp ứng nhu cầu thực phẩm trong nước cũng như một phần phục vụ xuất khẩu. Chăn nuôi lợn đã góp phần tạo việc làm, nâng cao đời sống cho người dân và là một trong những ngành nghề góp phần dịch chuyển cơ cấu nền kinh tế nông nghiệp. Tuy nhiên, chăn nuôi lợn luôn phải đối mặt với tình hình dịch bệnh diễn biến rất phức tạp và gây ra nhiều thiệt hại lớn về năng suất chất lượng vật nuôi, kinh tế và đời sống người dân. Một trong số đó là bệnh do circovirus gây ra ở lợn (Porcine Circovirus disease). Trong những năm cuối thập niên 1990, một loại circovirus mới (Porcine Circovirus – PCV) gây bệnh trên lợn. Virus này khác với PCV thích ứng trên môi trường tế bào thận lợn PK15 đã biết trước đó. Vì vậy, người ta phân chia circovirus thành 2 type là porcine circovirus type 1(PCV1) và porcine circovirus type 2(PCV2). PCV1 không có tính gây bệnh, còn PCV2 được xem là có liên quan đến Hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome – PMWS); Hội chứng viêm da và viêm thận (Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome – PDNS); Hội chứng viêm đường hô hấp (Porcine Respiratory Diseases Complex - PRDC) và Hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive Disorders - PRD). Cho đến nay, PCV2 có mặt tại hầu hết khắp quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Tỷ lệ nhiễm PCV2 ở Việt Nam tương đối cao và tăng qua các năm. Bệnh xảy ra quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ, thường xuất hiện ở lợn con từ 2-17 tuần tuổi. Bệnh tiến triển chậm nhưng lợn bệnh thường có tỉ lệ chết cao. Bệnh do PCV2 gây ra có những triệu chứng điển hình là còi cọc, chậm lớn, khó thở, viêm da, hạch lympho sưng to. Lợn chết chủ yếu có hiện tượng gan 1 sung huyết, tim sưng to, trên bề mặt có nhiều điểm hoại tử. Bệnh tích vi thể rõ nhất là hiện tượng cơ tim bị viêm tơ huyết và hoại tử. Đối với ngành công nghiệp chăn nuôi lợn, PCV2 làm thiệt hại lớn về kinh tế, đặc biệt là chăn nuôi theo quy mô công nghiệp với mật độ chăn nuôi dày, môi trường không được kiểm soát tốt cũng như các biện pháp quản lý phòng bệnh chưa hợp lý. Vì vậy vấn đề chẩn đoán và phát hiện bệnh là rất quan trọng, hiện nay đã có rất nhiều phương pháp chẩn đoán PCV2 như kỹ thuật PCR (Lâm T.T.Hương và ctv, 2005), huyết thanh học (Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv, 2006), phản ứng miễn dịch gắn Enzym ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC). Tuy nhiên, phương pháp miễn dịch huỳnh quang (Immuno fluorescent test – IF) vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh do PCV2 gây ra. Đây cũng là một trong những kỹ thuật mới được sử dụng và hứa hẹn sẽ đem lại những hiệu quả cao cho việc chẩn đoán lợn mắc bệnh do PCV2. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc circovirus và ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để chẩn đoán bệnh” 1.2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI - Làm rõ các đặc điểm triệu chứng lâm sàng, bệnh lý đại thể, vi thể của một số cơ quan trên lợn mắc circovirus. - Ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang chẩn đoán bệnh. 2 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ PORCINE CIRCOVIUS TYPE 2 2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Hiện nay, PCV2 đã được ghi nhận ở nhiều nước trên thế giới. Thái Lan: Năm 1998 những trường hợp đầu tiên của Hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome – PMWS) được mô tả ở Thái Lan vào năm 1998 nhưng có nghiên cứu chỉ ra đã phát hiện PMWS trên lợn từ năm 1993. Dựa vào phương pháp PCR khảo sát sơ bộ tỷ lệ nhiễm cricovirus ở Thái Lan 10%. Phân loại các chủng PCV2 dựa trên nucleotide 262-267 của các trình tự ORF2 phát hiện tại Thái Lan PCV2 đang tồn tại một subtype mới là PCV2e (PCV2b chiếm ưu thế) đang tồn tại trong đàn của Thái Lan. Canada: John. C.S.Harding và cs năm 1998 đã xác định dịch tễ học và triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PMWS: Ở lợn sau cai sữa tỷ lệ tử vong đạt mức cao nhất vào tháng 9 của dịch (7,67), sau đó trở lại 16 tháng sau với tỷ lệ 2,1% ; -2,5%. Các nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất là còi cọc (giảm cân, hốc hác), vàng da (bệnh gan) và khó thở (bệnh đường hô hấp). Bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào PK-15 nhiễm PCV1 và PCV2. Kết quả thu được sau 3 năm nghiên cứu là tỷ lệ huyết thanh dương tính với PCV2 nhiều hơn PCV1, PCV2 là loại virus lưu hành chính và lưu hành ít nhất trong 10 đàn lợn tại Canada trước khi hội chứng PMWS được báo cáo. Tại Qenbac – Canada bằng phương pháp PCR được Gagnon C.A và cs (2007) sử dụng và đã phát hiện ra kiểu gen mới khác với kiểu gen PCV2 trên lợn nhưng không phải là loài mới và được gọi là “PCV-2b”. 3 Nhật Bản: Shibahara T và cộng sự, năm 2000 đã chứng minh rằng sự suy giảm tế bào bạch huyết với cơ chế apoptosis (Sự chết rụng tế bào: là một quá trình của sự chết tế bào được lập trình (programmed cell death - PCD) xảy ra trong các sinh vật đa bào) của tế bào lympho B là do PCV2. Họ cho rằng một số cơ quan dung giải tế bào là do cơ chế này. Như vậy, PCV2 kích thích sự phát triển hội chứng gầy mòn trên lợn con sau cai sữa (PMWS) bằng cơ chế gây suy giảm hệ thống miễn dịch. Hy Lạp: Năm 2002, Pallares, F và cs đã có nghiên cứu đầu tiên về chẩn đoán lợn mắc PMWS trong một con lợn nái rừng Châu Âu, nhóm tác giả này đã sử dụng kỹ thuật để phát hiện DNA của virus trong các cơ quan khác nhau bao gồm cả tử cung và trong tổn thương mô bệnh học. Đây là trường hợp đầu tiên phát hiện thấy PCV2 trong tử cung một con lợn rừng hoang dã. Năm 2005, trên một con lợn rừng 6-8 tuổi hấp hối, có triệu chứng gầy còm, khó thở và chết, virus PCV2 đã được phát hiện trong các mẫu mô, tổn thương mô bệnh học phù hợp với biểu hiện trường hợp mắc PMWS. Hai lợn rừng đều thuộc lân cận miền Trung Hy Lạp. Virus PCV2 tách ra từ hai lợn rừng tiến hành phân tích đặc tính di truyền và so sánh đặc tính di truyền virus PCV2 lợn rừng và virus PCV2 lợn trong nước, kết quả thấy PCV2 của hai lợn rừng liên quan chặt chẽ tới nhau và cùng nhóm với chủng phân lập từ lợn Hungari. Trung Quốc: Từ tháng 5-2003 đến tháng 8-2005 Zong và cs đã tiến hành thu thập ngẫu nhiên 1250 mẫu huyết thanh và các mẫu mô lợn nghi nhiễm PCV2 bao gồm: Lách, gan, hạch lynpho từ 6 quận huyện ở Hàng Châu, tỉnh Chiết Giang. Sử dụng phương pháp ELISA đã phát hiện thấy 40% mẫu huyết thanh dương tính với PCV2. Đồng thời, bằng phương pháp PCR trên các mẫu mô cho thấy tại Hàng Châu đang lưu hành ngoài chủng PCV2 Trung Quốc còn lưu hành rộng rại các chủng PCV2 khác. Ireland: John và cộng sự đã phát hiện ra PCV2 từ mẫu phân từ các trại lợn ở Bắc Ireland tháng 8 năm 2005. Bằng phương pháp PCR cho thấy ở đảo Ireland 4 [...]... phát huỳnh quang Phản ứng âm tính thì không có hiện tượng phát sáng 29 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CHỦ YẾU CỦA LỢN MẮC PCV2 Để thuận tiện cho việc nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn nghi mắc circovirus và ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trong chẩn đoán bệnh Trong thời gian thực hiện đề tài chúng tôi tập trung nghiên cứu trên đối tượng lợn. .. bệnh lý khoa Thú y; Học Viện Nông nghiệp Việt Nam - Địa điểm lấy mẫu: Khu vực trên địa bàn Hà Nội 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1 Nội dung - Xác định một số triệu chứng lâm sàng lợn mắc circovirus - Xác định những biến đổi bệnh tích đại thể ở một số cơ quan của lợn mắc circovirus - Xác định những biến đổi bệnh tích vi thể ở một số cơ quan của lợn mắc circovirus - Ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang chẩn. .. Cần chẩn đoán phân biệt triệu chứng hô hấp ở lợn mắc bệnh Tai xanh với hội chứng PMWS Trong trường hợp PDNS, cần chẩn đoán phân biệt với một số nguyên nhân gây viêm da cũng như các bệnh xuất huyết ở thận; đặc biệt phải chẩn đoán phân biệt với bệnh dịch tả lợn cổ điển, dịch tả lợn Châu Phi Bên cạnh đó, cũng cần phân biệt hội chứng rối loạn sinh sản do PCV2 với các bệnh sảy thai và con chết yểu, bệnh. .. trên một nhóm lợn thì điều trị thường không có hiệu quả cao Lợn khoảng 15 -40 kg điều trị với Chlotetracycline trộn vào thức ăn có thể giảm sự phát triển của hội chứng, do có liên quan tới sự suy yếu của các vi khuẩn kế phát gây bệnh 22 PHẦN III ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - Đối tượng nghiên cứu: Lợn mắc Circovirus - Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm. .. mối quan hệ giữa nhiễm trùng hai nhóm PCV2 trong tiến triển bệnh PMWS Thụy Điển: Năm 2008, Per Wallgren và cs đã tiến hành nghiên cứu 40 lợn trung bình 37,5 ngày tuổi, theo dõi trong 55 ngày; trong huyết thanh lợn bệnh không có kháng thể đủ để chống lại mần bệnh Số lượng PCV2 lớn hơn trong lợn mắc bệnh nặng và trong giai đoạn đầu so với lợn khỏe mạnh Ở 18/34 lợn không có dấu hiệu lâm sàng PMWS, có 107... sữa mắc PCV2 Một số thông tin các các nhóm lợn được chọn trong nghiên cứu này được trình bày ở bảng 4.1 Bảng 4.1 Nguồn gốc các lợn con sau cai sữa trong nghiên cứu STT 1 Lợn sau Số lượng cai sữa (con) Nhóm 1 7 2 Nhóm 2 7 3 Nhóm 3 7 4 Nhóm 4 7 5 Nhóm 5 7 6 Nhóm 6 7 Tiêm vacxin phòng 4 bệnh đỏ của Địa phương lấy mẫu Gia Lâm Triệu chứng lâm sàng Còi cọc, tiêu chảy, lợn, giả dại hạch bẹn nông 4 bệnh đỏ của. .. Ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang chẩn đoán bệnh do circovirus gây ra trên lợn 2 Nguyên liệu: a Vật liệu - Lợn bệnh và các mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu: Lách, gan, phổi, hạch phổi, tim, thận,… chưa được tiêm phòng vacxin phòng bệnh PCV2 trên địa bàn Hà Nội b Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: - Bình, chai, lọ đựng mẫu bệnh phẩm lợn mắc PCV2, panh, dao, kéo, cưa, găng tay, khẩu... huỳnh quang FITC (Sigma, Aldrich, St Louis, MO, USA), kính hiểm vi huỳnh quang 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng - Phương pháp quan sát triệu chứng lâm sàng của lợn sau cai sữa mắc PCV2 ngay từ khi lợn xuất hiện những dấu hiệu đầu tiên Đồng thời kết hợp giữa đặc điểm dịch tễ địa phương với việc thu thập thông tin từ chủ gia súc và cán bộ thú y để tăng độ tin cậy chẩn đoán. .. triệu chứng vàng da 2 Có các tổn thương mô học bao gồm: Sự suy giảm các tế bào bạch cầu, viêm u hạt các cơ quan gồm mô lympho, phổi, gan và thận 3 Tìm thấy kháng nguyên PCV2 trong các mô tổn thương Chẩn đoán PCV2 chỉ dấu hiệu lâm sàng và tổn thương bệnh là không đủ và không có dấu hiệu lâm sàng và tổn thương bệnh lý cũng có thể nghi ngờ mắc PCV2 15 Chẩn đoán lâm sàng Dựa vào triệu chứng lâm sàng đặc trưng:... (đỏ -> vàng da cam) Phản ứng miễn dịch huỳnh quang có 2 phương pháp: Trực tiếp và gián tiếp - Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Trong phản ứng này thường dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên chưa biết Cách làm: + Lấy bệnh phẩm cần chẩn đoán, làm thành tiêu bản (phết bệnh phẩm lên phiến kính, cố định) để kháng nguyên gắn chặt lên phiến kính + Nhỏ một giọt . LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp tại trường tôi luôn nhận được sự quan tâm giúp đỡ của các thấy cô, gia đình. Trần Anh Đào người đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để giúp tôi hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp của mình. Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị Phòng Thí Nghiệm