Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phƣơng Thị Hà XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VIRUS VIÊM GAN C TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN VIÊM GAN C BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ RT - PCR Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Ts.Bs Nguyễn Văn Tiến HÀ NỘI - 2012 Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 2 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm gan do virut C là có ảnh hưởng lớn đến tình trạng sức khỏe của con người trên toàn thế giới , bởi vì sau khi bị nhiễm virus viêm gan C cấp tính thì có khoảng 70-90% bệnh nhân chuyển từ giai đoạn cấp tính sang giai đoạn mạn tính và có tới 20-25% trong số bệnh nhân này sẽ chuyển qua giai đoạn xơ gan và ung thư gan [17,33,36]. Theo tổ chức y tế thế giới có khoảng 170 triệu người nhiễm virut viêm gan C (HCV), tương ứng với khoảng 2-3% tổng dân số toàn thế giới [14,26].Theo ghi nhận về tình hình nhiễm virut viêm gan C ở Việt Nam thì tỉ lệ người bình thường bị nhiễm căn bệnh này là khoảng 6% [42], xem như là thuộc nhóm các quốc gia có tỉ lệ nhiễm viêm gan C cao trên thế giới [13,42]. HCV là một virut có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virut phải sử dụng men ARN polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp ARN, từ đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50] và con đường lây nhiễm chủ yếu của HCV là qua đường máu. Sau khi xác định được người dương tính với anti-HCV, Bác sĩ trước khi cho chỉ đinh điều trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công cũng như thời gian điều trị cần thiết là định lượng số lượng siêu vi trong máu (HCV-ARN) và định kiểu gen của siêu vi gây viêm gan C (HCV Genotypes) [1,37]. Kiểu gen HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địa lý, mỗi châu lục hay mỗi nước có những kiểu gen nổi trội riêng [41,43]. Hiện nay trên thế giới đã biết được 6 loại genotypes và khoảng hơn 50 subtype (dưới type)[3,7], ở Việt Nam phổ biến genotypes 1,2, và 6, kiểu genotype 3 hiếm gặp [1,50]. Để xác định được genotypes HCV thì ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là chuyên ngành công nghệ sinh học phân tử đã phát minh nhiều kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV. Trên thế giới có nhiều công ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời các bộ kit xác định genotypes HCV với độ chính xác cao. Tuy nhiên, giá thành của những bộ kit này còn cao nên chưa được áp dụng rộng rãi. Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 3 HCV: Real-time PCR (RT-PCR) và kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing). Kỹ thuật Sequencing trong chuẩn đoán có nhiều tính ưu việt trong việc xác định kiểu gen là sự chính xác cao, tránh được những nhầm lẫn trên cùng một type hoặc subtype nhưng phương pháp này cần có các máy móc trang thiết bị hiện đại và điều kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu được thực hiện tại các trung tâm nghiên cứu. Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành ở tất cả các phòng thí nghiệm PCR do dễ thực hiện không đòi hỏi máy móc trang thiết bị và kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù hợp với điều kiện kinh tế của đa số người dân ở Việt Nam,tuy nhiên không xác định được đến subtype và có sự nhầm lẫn giữa type1 và type6. Với mục đích khuyến cáo bệnh nhân lựa chọn đúng phương pháp xác định genotype, vì vậy tôi chọn đề tài: “Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”, với những mục tiêu như sau : 1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR sử dụng Taqman probe. 2) Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) trên đoạn gen NS5B. Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 4 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV) 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và phân loại Vào năm 1970, Harvey J.Alter Trưởng khoa nhiễm trùng của bộ phận truyền máu Viện Quốc gia Sức khỏe Hoa Kỳ chứng minh là nhiễm virut sau truyền máu phần lớn là do virut viêm gan không phải là A và cũng không phải là B và được đặt tên là virut không A-không B.Mười bảy năm sau (năm 1987) Michael Houghton, Qui-lim Choo và tập đoàn, Gorge K dung sinh học phân tử định clon để định tính virus không A không B , năm 1989 đã xác định virut không A không B có tên chính thức là virut viêm gan C và được công bố bằng 2 bài trên báo Science[7]. Virus viêm gan C ( Hepatitis C virus - HCV) thuộc nhóm IV (+ssARN) virus ARN. Họ Flaviridae, cùng họ với virus Dengue, Flavivirus West Nile, virus tiêu chảy ở bò ( Bovine viral diarrhea - BVDV). Thuộc loài Hepacivirus[4,8,9]. Virut Viêm gan C hiện nay được xem là nguyên nhân phổ biến nhất gây bệnh viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan nguyên phát [6,12]. 1.1.2. Hình thái cấu trúc virut viêm gan C Virut viêm gan C là loại virut hướng gan dưới kính hiển vi điện tử người phát hiện HCV có hình cầu, hình đa diện hoặc hình que kích thước nhỏ (Hình 1.1). Hình 1.1 Hình thái của HCV dƣới kính hiển vi điện tử Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 5 Về cấu trúc của virut viêm gan C bao gồm lõi ARN, nhân core, gai glycoprotein và màng vỏ (Hình 1.2). Kích thước khoảng 60nm Hình 1.2. Cấu trúc của virut viêm gan C 1.1.3. Genome HCV Genome của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN có tính phân cực dương, bao quanh bởi một màng protein có chức năng bảo vệ tạo hình đa diện đều và gói lại bởi màng lipid từ nguồn của tế bào gan, kích thước của một chuỗi đơn ARN (+) là 9,6 kb. Giống như các chuỗi ARN dương của các loại virut khác, tổ chức genome của virut viêm gan C cũng mang vai trò như một ARN thông tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho protein của virut [17,40,47]. Tổ chức Genome của HCV được chia làm hai vùng Vùng cấu trúc mã hóa cho các protein cấu trúc gồm: - Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để tạo nuclecapsit. - Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ ngoài p33. - Gen E2 mã hóa cho protein vỏ ngoài gp 70. Vùng không cấu trúc mã hóa cho các protein không cấu trúc bao gồm: Màng vỏ ARN virus Màng vỏ glycoprotein Core Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 6 - Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23). - Gen NS3 mã hóa cho proteaza và helicaza (p72). - Gen NS4 được chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 và NS4B mã hóa cho protein p27. - Gen NS5 được chia thành NS5a mã hóa cho replicaza và NS5b mã hóa cho ARN-Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho quá trình sao chép. Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa một đơn khung mở (ORF- open reading frame), mã hóa cho một tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino axit (Hình 1.3). Trong quá trình virrut sao chép chuỗi protein này sẽ được kích hoạt bởi enzyme virut giống như tế bào chủ trong ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core, E1,E2) và bảy protein không cấu trúc (bao gồm: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)[31]. Một protein khác (kí hiệu F-Temed) hoặc ARF (khung đọc thay thế) được dự đoán là kết quả của khung đọc thay thế riboxome trong quá trình sao chép cùng với vùng nhân của hệ gen ARN[39,43,46]. Cấu trúc Không cấu trúc Tổng hợp chuỗi polyprotein Protein Core Glycoprotein vỏ Protease Proteaza và helicaza Replica và ARN-polymerase Hình 1.3: Tổ chức genome HCV Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 7 Các gen cấu trúc mã hóa cho lõi protein của virut và protein vỏ của virut là E1,E2 được đặt ở phần đuôi 5’ của khung đọc mở theo chiều ngược bởi vùng mã hóa cho các protein phi cấu trúc p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Hình 1.3). Các protein cấu trúc là hợp phần quan trọng của virut viêm gan C, do đó các protein phi cấu trúc sẽ không có sự gắn kết với virut xong lại cùng nằm trong quá trình sao chép ARN và morphogenesis virut [50]. ORF (Open reading frame) được cố định ở các vùng không bị mã hóa là vùng 5’ và vùng 3’ (NCRs- Noncoding regions) bao gồm các chuỗi nucleotit có liên quan đến sự điều chỉnh quá trình sao chép của virut. Tất cả các NCR đều có chứa các vùng miền bảo tồn cao so với các vùng protein mã hóa của genome HCV. Mức độ chuyển hóa cao của các NCRs làm cho chúng thành mục tiêu nghiên cứu: + Nâng cao chất lượng việc chẩn đoán phân tử. + Nghiên cứu cho việc điều trị kháng virut. + Nghiên cứu kháng sinh chống HCV. Phần 5’ NCR có khoảng 341 nucleotit và nó có một cấu trúc phức thứ hai với bốn vùng khác nhau (I-IV) [30], 125 nucleotit đầu tiên của 5’ NCR được phân ba đều ra các vùng I và II là phần cơ bản của quá trình sao chép ARN trong virut [ 21,52]. Các vùng (II-IV) thiết lập một tâm đầu vào của ribosome bên trong (IRES) bao gồm ribosome liên kết và độc lập khởi động cho quá trình sao chép tương ứng[7,52]. Chuỗi 3’ NCR có chứa ba vùng chức năng khác nhau: một vùng có thể thay đổi, một chuỗi U/UC có chiều dài thay đổi và đuôi X đã chuyển đổi ở mức độ cao tại đuôi 3’ của hệ gen HCV, vùng thay đổi có chứa khoảng 40 nucleotit và không quan trọng đối với quá trình sao chép ARN. Tuy nhiên nếu bỏ đi chuỗi này có thể dẫn đến việc giảm sút đáng kể hiệu quả của quá trình sao chép[21]. Chiều dài của chuỗi vùng U/UC thay đổi theo các chuỗi HCV khác nhau và nằm trong khoảng từ Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 8 30- 80 nucleotit [35]. Chiều dài nhỏ nhất trong vùng này đối với quá trình sao chép ARN được cho là có chứa 26 nucleotit homouridine trong môi trường tế bào [22,49]. Đuôi X với mức chuyển hóa cao có khoảng 98 nucleotit có chứa ba stem-loops (SL1-SL3) [23] và quá trình tiêu hủy hoặc thay thế nucleotit trong các vùng này thường không gây tử vong [23]. Một cách gọi tên khác của quá trình tương tác giữa đuôi 3’ X và SL2 là “ kissing-loop” và một phần phức hợp của vùng mã hóa NS5B đã được mô tả [23,35]. Sự tương tác này bao gồm một cấu trúc ARN tertiary của genome HCV, đây chính là phần quan trọng của quá trình sao chép HCV trong hệ thống môi trường tế bào [23,49]. Cuối cùng cả NCRs đều xuất hiện để làm việc cùng với sự tương tác ARN-ARN theo chiều dài có thể sẽ hình thành một vòng tuần hoàn gen tạm thời [46]. 1.1.4. Gen và Protein Như đã mô tả ở phần trên, quá trình chuyển hóa của chuỗi protein HCV là được khởi động thông qua sự tương tác của một số phần trong NCRs của hệ genome HCV ARN. Chuỗi protein là sản phẩm có chứa 10 protein sẽ đồng thời chuyển hóa hoặc chuyển hóa bước đầu được kích hoạt từ chuỗi protein. Các protein đuôi N như C, E1, E2 và p7 đều được kích hoạt bởi một tín hiệu peptit trong tế bào (SP)[15,20]. Lõi tiền protein được tạo ra vẫn có chứa tần số tín hiệu E1 tại đuôi C của nó. Tiếp theo sẽ kích hoạt tần số tín hiệu này bằng một tín hiệu peptit là peptidase (SPP) dẫn đến việc hình thành lõi protein hoàn chỉnh [15,20]. Các protein phi cấu trúc NS2 đến NS5B của chuỗi protein HCV là đều kích hoạt bởi hai protease có virut mã hóa ( NS2-NS3 và NS3) với protease NS2-NS3 cysteine được kích hoạt tại chỗ ghép nối NS2-NS3 và protease NS3 serine được kích hoạt bởi các protein duy trì chức năng [17,51]. Các vị trí tiếp theo của nucleotit virut và gốc amino axit theo HCV chuỗi H77 kiểu gen 1a, được tiếp nhận theo số NC_004102. Một số thông số đặc trưng cho các protein HCV được tập hợp trong bảng dưới đây. Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 9 Bảng 1.1: Tổng quan về kích thước của protein HCV Protein Số aa Vị trí aa trong chuỗi Trọng lượng protein Core: protein core HCV có độ pH kiềm cao là một protein gắn ARN tạo ra nucleocapsid của HCV. Protein core đã được báo cáo tương tác với nhiều loại protein của tế bào tác động đến chức năng của nhiều protein của tế bào và chức năng của tế bào túc chủ như gen dịch mã, chuyển hóa lipid, chết theo chương trình và khá nhiều tín hiệu dẫn đường. Ngoài ra protein core mồi dẫn gan hóa mỡ và ung thư gan ( UTG)[51,52]. E1 và E2: là protein type I xuyên màng và có đoạn cuối C ái nước làm neo. Được chuyển vị đến ruột của ergoplasme và được glycosyl hóa tại đấy. Do kết nối rất mạnh với N liên kết glycosyl hóa. E1,E2 tạo thành non-covalent heterodimer đã cho là tạo thành vỏ của HCV. Quá trình đóng gói các phần tử của HCV và trồi ra chưa được hiểu thấu đáo nên cần nghiên cứu có hệ thống vấn đề này[15,20,48]. F-Protein, ARFP: Tổng hợp protein này là do một khung đọc mở thay thế trong nội tại gen core. Được đặt tên là khung protein đọc mở thay thế ( ARFP ) hay là khung F ( F frame shift ) có 160 amino acid. ARFP hay F là cần thiết cho ARN-HCV tăng sinh. Được thể hiện trong diễn biến tự nhiên như thế nào khi nhiễm HCV cần làm sáng tỏ [7,46]. Protein P7: P7 là một polypeptide có 60 amino acid, nằm tại vị trí giao nhau của gen cấu trúc và gen không cấu trúc. Chưa biết chắc chắn là P7 có được đóng gói Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 10 không với các phần tử khác của HCV, P7 gồm 2 vùng để tạo thành hexamer là kênh cho các ion hoạt động, có thể cho rằng P7 có vai trò quan trọng trong đóng gói vì một protein như vậy của virus gây tiêu chảy ở Bò ( BVDV- bonine diarrhea virus) đã chứng minh là rất cần thiết để sản sinh virus-progeny nhưng không thể để cho tăng sinh ARN virus [28]. Protein tự tiêu NS2-3 ( autoprotease): kết nối NS2/3 bị tách bởi autoprotease để có NS2 và đoạn cuối N thứ ba của NS3. Mặc dù hoạt tính protease của NS2-3 cho genome HCV tăng sinh trong chu kỳ sinh trưởng nội bào cũng như trong in vitro cho subgenomic replicon nhưng cũng cần để biết NS2 còn có chức năng nào khác sau khi tách rời NS3[7,48,51]. Protein NS3-4A-NS3: là protein đa chức năng có chứa một serin protease tại phần ba đoạn N-cuối chịu trách nhiệm dòng xuôi tách biệt ở vùng không cấu trúc là một NTPase/ARN vùng helicase hai phần ba của C tận cùng. NS4A :là 154 polyamino acid tác động đến NS3 tại tế bào nội màng và cần như một đồng yếu tố cho NS3 serin protease. Cấu trúc tinh thể của phức hợp đã cho thấy NS3-4A là thành phần tích hợp của enzyme nhân. Đáng ngạc nhiên NS3 seri protease có ảnh hưởng tới sự đề kháng miễn dịch tế bào tự nhiên của túc chủ bởi đã ức chế tín hiệu RIG-1 và TLR. Nhận xét này sẽ rất hấp dẫn NS3 có thể là hướng cho thuốc chống HCV. Chất ức chế serin protease đã nổi lên là thành phần cực kỳ có hiệu quả và trở thành nguyên lý hàng đầu để nghiên cứu điều trị bệnh nhân HCV mạn tính. Tác dụng men hoạt tính của NS3NTP-ase /helicase là rất cần thiết cho ARN-HCV tăng sinh. Đích của chức năng trong quá trình sinh trưởng có thể là không xoắn 2 vòng tăng sinh, ARN trung gian làm loại trừ ARN cấu trúc thứ phát hay là tách rời genome với protein gắn kết. Những tiến bộ về hiểu biết cơ chế phân tử của enzyme này có thể là một chiến lược mơi về thuốc ức chế HCV. NS4B : Do tính chất rất ái nước nên NS4B là thành phần HCV rất khó nghiên cứu và hiểu biết chưa nhiều, cho đến nay được biết NS4B với 27-kDa là thành phần [...]... Đây là một thiết bị quang h c có hai ch c năng: + C c c nguồn sáng phát ra đư c c c tia sáng kích thích c bư c sóng x c định lên c c tube phản ứng RT- PCR + C đư c camera hay c m biến quang ghi nhận đư c ánh sáng huỳnh quang phát ra từ c c tube phản ứng RT- PCR khi c c tube phản ứng này đư c chiếu c c tia sáng kích thích 1.4.2 Kỹ thuật Sequencing Nguyên lý: Kỹ thuật Sequencing dựa trên phương pháp... hiếm c biến chứng 1.3.3.5 Xét nghiệm phân định loại HCV (Genotype HCV) Cu c xét nghiệm phân định loại HCV đư c dùng để x c định bạn bị nhiễm loại HCV nào Ðiều này rất hữu ích cho vi c quyết định c ch chữa trị, như là chọn lựa loại thu c, và c n điều trị bao lâu 1.4 C c kỹ thuật xét nghiệm x c định kiểu gen HCV Hiện nay kỹ thuật đư c ứng dụng trong x c định kiểu HCV ở Việt Nam là kỹ thuật Real-time PCR. .. ngư c Probe1 Mẫu dò 5’-FAM-TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTG- 22 BHQ1-3’ Probe2 Mẫu dò 5’-Cy5-AAGGACCCAGTCTTCCCGGCAATTCBHQ2-3 Probe 3 Mẫu dò 25 ’ 5’-ROX-ACCCGGTCACCCCAGCGATTCC- 23 BHQ2-3’ Mẫu dò 5’-HEX-TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCCATProbe 6 BHQ1-3 26 ’ Hóa chất để th c hiện giải trình tự gen do C ng ty Nam Khoa th c hiện: Bygdye Terminal V1.3, mồi HCV thiết kế trên NS5B 2.3 C c kĩ thuật sử dụng trong nghiên c u... vùng x c định như là glycoprotein E1 và E2 mà tại đó chuỗi c a gen nhân và một số gen không c c u tr c như NS3 thì c sự bảo toàn cao hơn Khả năng kh c nhau c a c c chuỗi ở m c thấp nhất giữa c c genotype đư c phát hiện thấy trong 5’ NCR, tại đó chuỗi riêng lẻ và c u tr c ARN thứ c p là c n thiết cho quá trình sao chép và ch c năng chuyển hóa[44,47] M c dù c sự đa dạng về c c chuỗi HCV, tất c trình... toàn; l c nhẹ để trộn sau đó li tâm nhẹ để lắng Cho vào c c tube PCR, mỗi tube 20𝜇l NK HCV-TQPCRHEX mix Giữ c c tube này trong đá bào hay c c giá lạnh Đối với mỗi mẫu cDNA từ bệnh phẩm và mẫu chứng âm: cho 5𝜇𝑙 mẫu cDNA vào một tube PCR chứa 20𝜇𝑙 NKHCV-TQPCRHEX mix Đối với c c NK HCVDNA chuẩn : cho vào 3 tube PCR kh c chứa 20𝜇𝑙 NK HCV- TQPCRHEX mix, mỗi tube 5𝜇𝑙 một độ pha loãng NKHCVDNA chuẩn Chạy real-time... Mẫu c đủ c c điều kiện như trên sẽ đư c tách chiết và tinh sạch ARN sau đó tổng hợp thành cDNA nhờ men phiên mã ngư c Reverse Transciptase, sản phẩm cDNA c a c c mẫu bệnh nhân sẽ đư c định lượng bằng phương pháp Real-time 29 Phương Thị Hà Luận văn Th c sĩ khoa h c PCR dựa trên c c cặp mồi đ c hiệu Những mẫu c nồng độ > 102copies/ml máu sẽ đư c lựa chọn để định type 2.3.1 Kĩ thuật tách chiết ARN Kỹ thuật. .. phiên mã ngư c RNA trong c c dịch trích biệt RNA ở trên (mẫu bệnh phẩm và mẫu chứng âm) thành cDNA Cho vào PCR mix để chuẩn bị chạy PCR Phải th c hiện giai đoạn này với c c PCR mix giữ trong khay lạnh hay đá bào Cho PCR mix vào low-profile white PCR tube: Tính toán số phản ứng c n phải th c hiện để lấy đủ số tube chứa master mix vào tube PCR Để c c tube Master mix ở 4 0C- 10 0C trong tối cho đến khi rã... dò đư c thiết kế dựa vào trình tự c c gen trên vùng 5’NC trên bộ gen HCV đư c công bố trên ngân hàng gen đư c tổng hợp và cung c p bởi c ng ty Nam Khoa và c trình tự như sau: 28 Phương Thị Hà Luận văn Th c sĩ khoa h c Bảng 2.1 Mồi và mẫu dò trên vùng 5’ NC c a HCV Chiều Ch c Tên Primer F Trình tự năng Mồi dài (bp) 5’-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3’ 22 5’-ACGCCCAAATBTCCRGGCATTGA-3’ Kích thư c sản phẩm PCR (bp)... x c định Anti HCV dương tính đến xét nghiệm tại Khoa Truyền nhiễm Bệnh viện Bạch Mai Tổng số mẫu xét nghiệm antiHCV (+) là 239 mẫu trong đó c 228 mẫu c số lượng virut >102copies/ml máu mới x c định kiểu gen bằng kỹ thuật RT- PCR Bệnh nhân c c c tiêu chuẩn sau: + Đã x c định Anti HCV (+) + Không đồng nhiễm với c c virut gây viêm gan kh c như HBV, HGV + Không đồng nhiễm với HIV + Số lượng virut >102copies/ml... c a ARN c sự biến đổi codon thứ ba c a gen lõi[42,44] 15 Phương Thị Hà Luận văn Th c sĩ khoa h c Kiểu gen 1a đư c phân bố rộng rãi ở b c Âu và Mỹ, c c nư c có nền c ng nghiệp hóa Kiểu gen 2 [2a,2b, 2c] tìm thấy chủ yếu ở c c nư c vùng Địa Trung Hải và viễn Đông Kiểu gen 1b thường thường phân bố toàn thế giới Kiểu gen 3a đư c phân bố ở c c khu v c công nghiệp hóa ở Châu Âu Type 4a phân bố rộng rãi ở Trung . virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh h c phân tử RT-PCR , với những m c tiêu như sau : 1) X c định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR. Th c sĩ khoa h c 1 ĐẠI H C QU C GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI H C KHOA H C TỰ NHIÊN Phƣơng Thị Hà X C ĐỊNH KIỂU GEN VIRUS VIÊM GAN C TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN VIÊM GAN C BẰNG KỸ. minh nhiều kỹ thuật để x c định kiểu gen HCV. Trên thế giới c nhiều c ng ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời c c bộ kit x c định genotypes HCV với độ chính x c cao. Tuy