BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TR ỜNG ĐẠI HỌC s PHẠM HÀ NỘI 2 NGUYỄN THỊ HIÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH Dược HỌC • • • CỦA DỊCH CHIÉT TỪ LÁ CÂY DÂU TẰM (Morus aỉba L.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC • • • Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Trưong Văn Châu HÀ NỘI, 2013 Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu, tôi đã luôn nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo, đóng góp ý kiến hết sức quý báu của PGS.TS. Trương Văn Châu. Tôi vô cùng kính trọng và chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các, thầy cô trong Ban giám hiệu, phòng Sau đại học, khoa Sinh - Kĩ thuật nông nghiệp trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn của mình. Xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên, cổ vũ, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Hà Nội, ngày 4 thảng 7 năm 2013 Tác giả Nguyễn Thị Hiền Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Neu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tác giả Nguyễn Thị Hiền Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục hình, biểu đồ 3.1. Tách chiết các phân đoạn dịch chiết lá cây Dâu tằm (Morus alba L.) 35 3.1.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn dịch chiết lá cây Dâu BP Béo phì ĐTĐ Đái tháo đường EtOAc Ethylaxetat EtOH Ethanol HDL-C High density lipoprotein (Lipoprotein liên kêt cholesterol tỷ trọng cao) LDL-C Low density lipoprotein (Lipoprotein liên kêt cholesterol tỷ trọng thấp) N-hex N-hexan PĐ Phân đoạn STZ Streptozotocin TC Total cholesterol (cholesterol toàn phân) TG Triglyceride VLDL-C Very low density lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thâp liên kết cholesterol) STT rể« bảng Tran g 1 Bảng 1.1. Phân loại BMI của người trưởng thành châu Au và châu Á. 10 2 Bảng 2.1. Bảng các phản ửng định tính đặc trưng. 25 3 Bảng 2.2 Kêt quả đường chuân gallic. 27 4 Bảng 2.3. Thành phân thức ăn giàu lipid. 28 5 Bảng 2.4. Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm. 30 6 Bảng 3.1. Khôi lượng cao thu được khi chiêt qua các phân đoạn và hiệu suất. 36 7 Bảng 3.2 .Bảng kêt quả định tính một sô hợp chât tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm. 37 8 Bảng 3.3. Kêt quả hàm lượng polyphenol tông sô trong các PĐ dịch chiết. 39 9 Bảng 3.4. Kêt quả thử độc tính câp theo đường uông. 40 10 Bảng 3.5. Trọng lượng trung bình của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dưỡng khác nhau. 41 11 Bảng 3.6. So sánh một sô chỉ sô hóa sinh máu giữa chuột nuôi thường và nuôi béo phì thực nghiệm. 42 12 Bảng 3.7. Nông độ glucose huyêt của các lô chuột trước và sau khi tiêm STZ. 45 13 Bảng 3.8. Kêt quả nông độ glucose huyêt lúc đói của các lô chuột sau 21 ngày điều trị. 47 14 Bảng 3.9. So sánh một sô chỉ sô lipid máu ở chuột ĐTĐ trước và sau điều trị bằng cao phân đoạn ethanol, cao phân đoạn n - hexan và cao phân đoạn ethylacetate. 50 STT Tên hình Tran g 1 Hình 2.1. Cây Dâu tăm (Morus alba L.) 23 2 Hình 2.2. Chuột nhăt trăng chủng Swiss 23 3 Hình 2.3. Đô thị chuân acid gallic 27 4 Hình 3.1. Quy trình chiêt xuât các chât tự nhiên từ lá cây Dâu tằm 35 5 Hình 3.2. Săc ký đô các phân đoạn 38 6 Hình 3.3. Chuột béo phì (A) và chuột ăn thường (B) 40 7 Hình 3.4. Biêu đô biêu diên sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 8 tuần. 41 8 Hình 3.5. Biêu đô so sánh một sô chỉ sô hóa sinh giữa các lô chuột TNo. 43 9 Hình.3.6. Nông độ glucose huyêt lúc đói của các lô chuột thí nghiệm trước và sau khi tiêm 72 giò’ 46 10 Hình 3.7. Nông độ glucose huyêt lúc đói của các lô chuột trước và sau 21 ngày điều trị. 48 11 Hình 3.8. So sánh một sô chỉ sô lipid máu ở chuột ĐTĐ trước và sau điều trị bằng cao phân đoạn ethanol, cao phân đoạn n - hexan và cao phân đoạn ethylacetate. 50 MỞ ĐÀU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam nằm trong khu vực có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có một thảm thực vật hết sức đa dạng và phong phú. Đó chính là nguồn tài nguyên thiên nhiên vô giá mà cho đến nay chúng vẫn chứa đựng nhiều điều bí ẩn. Ngày nay, các sản phẩm thiên nhiên ngày càng được con người quan tâm và ứng dụng rộng rãi trong các ngành kinh tế quốc dân bởi tính năng độc đáo, ít độc hại, dễ hấp thu và đặc biệt không làm tổn hại đến môi sinh. Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, tới 3 Á diện tích của cả nước là núi rừng trùng điệp, cùng với điều kiện khí hậu rất đa dạng với nhiều tiểu vùng khí hậu khá đặc trung đã tạo cho Việt Nam có thảm thực vật thiên nhiên vô cùng phong phú, đặc biệt là kho tàng các cây dược liệu. Theo thống kê, hiện nay số loài thực vật bậc cao có mạch ở nước ta vào khoảng 12.000 - 13.000 loài, thì số loài được dùng làm thuốc chiếm tới 4.000 loài. Việc tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn dược liệu đã và đang là vấn đề thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý và kinh doanh ở nhiều nước, nhất là các nước công nghiệp phát triển. Nghiên cứu để khai thác, để kế thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật làm thuốc là vấn đề có ý nghĩa khoa học, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta. Có thể nói tác dụng chữa bệnh của cây cở được quyết định chủ yếu bởi các hợp chất tự nhiên chứa trong chúng. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các cây thuốc không những góp phần làm sáng tỏ tác dụng chữa bệnh của thảo dược mà còn tạo ra nhiều loại thuốc mới để phòng chống, trợ giúp, ngăn ngừa và chữa trị bệnh. Hiện nay, con người đã phát hiện được rất nhiều hợp chất từ cây cỏ với các đặc tính sinh học quý giá. Cây Dâu tằm hay còn gọi là cây Dâu ta, có tên khoa học là Morus alba L, là một loài thực vật thuộc họ Dâu tằm (Moracaae). Nó được biết đến là một loài cây phổ biến, có mặt trong nhiều bài thuốc chữa bệnh. Ở Việt Nam, loài cây này được biết đến trong các bài thuốc dân gian chữa cảm mạo, hạ sốt, hạ huyết áp, chữa chứng mồ hôi trộm, 7 chứng thổ huyết Đặc biệt, lá dâu tằm theo dân gian có khả năng ổn định huyết áp, đường huyết. Việc nghiên cứu đặc tính sinh dược học của lá cây Dâu tằm nhằm đạt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách họp lý, hiệu quả có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng trong sự phát triển của nền y học Việt Nam hiện đại dựa trên các bài thuốc cổ truyền. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ lá cây Dâu tằm (Morus alba L.)” 2. Mục đích nghiên cún Tách chiết và nghiên cứu một số đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ lá cây Dâu tằm (Morus alba LJ 3. Nhiệm vụ nghiên cún - Tách, chiết các phân đoạn từ lá cây Dâu tằm. - Khảo sát thành phần hóa học của lá cây Dâu tằm. - Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm, chuột đái tháo đường type 2. - Đánh giá tác dụng của các phân đoạn dịch chiết đến trọng lượng, một số chỉ số lipit máu của chuột béo phì thực nghiệm, nồng độ glucose huyết trên mô hình chuột đái tháo đường mô phỏng type 2. 4. Đóng góp mói của đề tài Cung cấp một số dẫn liệu khoa học về thành phần hóa học, hàm lượng các nhóm hợp chất hữu cơ, khả năng chống BP của phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm (Morus aỉba LJ Chương 1 TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Họp chất thứ sinh thực vật 1.1.1. Các họp chất thử sinh thực vật Ớ thực vật, ngoài protein, saccarid, lipid, vitamin, còn có những chất khác có vai trò quan trọng trong đổi chất của cây được gọi là các chất thực vật thứ sinh. Căn cứ vào tính chất hóa học, các họp chất thực vật thứ sinh được chia thành một số nhóm chính 8 như: nhóm phenolic, nhóm terpen và nhóm alkaloid. 1.1.1.1. Họp chất phenolic Dựa vào thành phần và cấu trúc người ta chia họp chat phenolic thành 3 nhóm nhỏ [2]. Nhóm hợp chat phenolic đơn giản: Trong phân tử chỉ có một vòng benzene và một vài nhóm hydroxyl. Tùy thuộc vào số lượng nhóm OH mà chúng được gọi là các monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquynone), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquynol. Nhóm hợp chat phenolic phức tạp: Trong thành phần cấu trúc phân tử của chúng ngoài vòng thơm benzene (C 6 ) chúng còn có dị vòng, mạch nhánh. Đại diện nhóm này có axid cyamic, axid ceramic. Nhóm hợp chất phenolic đa vòng: Là nhóm đa dạng nhất trong các họp chat phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng họp của các đơn phân. Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng. Nhóm này có các phân nhóm: flavonoid, tannin và coumarin. • Phân nhóm Flavonoid thực vật Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, phần lớn có màu vàng. 9 Flavonoid là một chuỗi polyphenolic gồm có 15 nguyên tử cacbon và hai vòng benzen liên kết bởi một đường thẳng có 3 cacbon. Flavonoid gồm 2 vòng thơm và một vòng pyran 2' 3' 3 6 ’ 5 ' 5 *Hoạt tính sinh học của flavonoid Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant): flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi gốc tự do hoạt động. Những flavonoid có các nhóm hydroxyl sắp xếp ở vị trí octo dễ dàng bị oxy hóa dưới tác dụng của các enzyme polyphenoloxydase và peroxydase tạo thành dạng semiquinon hoặc quinon. 0 2 + Flavonoid (dạng khử) (dạng Hydroquinon) H 2 0 2 + Flavonoid (dạng khử) (dạng Hydroquinon) (Semiquinon hoặc Quinon) +H 2 0 - Flavonoid có khả năng điều hòa hoạt động enzyme do khả năng liên kết với nhóm amin trong phân tử protein, làm thay đổi cấu hình không gian của enzyme do đó tạo hiệu ứng điều hòa dị lập thế. 3' polyphenoloxydase ► Flavonoid (dạng oxy hóa) (Semiquinon hoặc Quinon) ► Flavonoid (dạng oxy hóa) Peroxydaxe 1 0 [...]... và xuất hiện nhiều LDL-C với kích thước nhỏ và nặng hơn khi việc kiểm soát glucose kém Đây chính l yếu tố l m tăng nguy cơ bệnh xơ vỡ động mạch [10] 1.5 Vài nét chung về cây Dâu tằm (Morus alba L. ) 1.5.1 Đặc điễm sinh học Dâu tằm (Morus alba LJ hay còn gọi l dâu ta, dâu trắng, dâu cang thuộc họ Dâu tằm (Moracaae) l một loài cây gỗ từ nhỏ đến nhỡ, l n nhanh, có thể cao tới 15-20 m Cây gỗ nhỏ, cao khoảng... phiến l Mặt trên của l màu l c sẫm hay l c xám, mặt dưới màu l c nhạt hơn, nổi rõ các gân l n chạy từ cuống l và nhiều gân nhỏ hình mạng l ới, có l ng tơ mịn rải rác trên gân l Cuống dài 2-4 cm, mảnh, có l ng thưa L hàng năm rụng vào mùa đông L kèm còn non hình tam giác nhọn, khi già xoắn l i thành hình dải đầu nhọn [13] Cây Dâu tằm {Morus alba L. ) tại Việt Nam gọi đơn giản l cây dâu, hay cây dâu. .. (quercetin-3- glucosid) Các dẫn chat coumarin: umbeliferon, scopoletin, scopolin Các vitamin B, c, D, caroten Các sterol: Ị3-sitosterol, campesterol, P-sitosterol glycosid, P- ecdyson và inokosterol Các acid hữu cơ: oxalic, malic, tartric, citric, fumaric, palmitic và ester ethyl palmitat [1] 1.5.3 Một số tác dụng Sinh - dược và công dụng của l cây Dâu tằm L cây Dâu tằm (Đông y gọi l Tang diệp) có... Định l ợng HDL-C Nguyên tắc: Xét nghiệm gồm hai bước đặc hiệu Bước thứ nhất cholesterol trong chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phá hủy bằng các phản ứng enzyme đặc hiệu Bước thứ hai cholesterol trong HDL được định l ợng bằng phản ứng enzyme với sự có mặt của chat surfactant đặc hiệu cho HDL Bước 1: Chylomicron, LDL, VLDL — j ^Ịrr' 7^777 * Cholestenon + H2O Điêu kiện đặc hiệt 2H2O2 Catalaseầ 2 H2O... hóa chât Dung dịch acid gallic; 0.5 g acid gallic + lOml C 2H5OH + 90ml H20 bảo quản l nh Như vậy dịch chuẩn gốc aid gallic có nồng độ 5mg/ml Dung dịch Na2C03; 200g Na2C03+800ml H20 đun sôi Thêm một vài giọt tinh thể Na2C03, sau 24 giờ đem l c và dẫn nước cất tới lOOOml Dung dịch mẫu cần định l ợng * 3 1 Tiến hành xây dựng đường chuẩn acỉd gallỉc Chuẩn bị cốc định l ợng theo số l ợng dung dịch gốc như... giờ l m thí nghiệm, được phân l ngẫu nhiên N =10 và cho uống theo liều tăng dần cho đến 8g/kg (liều tối đa cho phép) Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết 2.2.4 Nghiên cún tác dụng hạ đưòng huyết của dịch chiết l cây dâu tằm l n chuột nhắt gây ĐTĐ bằng STZ Đe tìm hiểu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết l cây Dâu tằm trước tiên chúng tôi tiến hành... trọng l ợng, chúng tôi tiến hành l a chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, l y máu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu Các số liệu được thu thập và tiến hành xử l thống kê 2.23.2 Thử độc tính cấp, xác định LD50 Xác định độc tính cấp với liều l ợng hóa chất gây chết cho 50% động vật thử nghiệm (LD50) của dịch chiết l cây Dâu tằm theo phương pháp Lorke [16] Chuột nhịn đói trước 16 giờ l m... thể l c 1 8 và dùng thuốc hạ lipid máu 1.2.6.2 Phân loại Trên thực hành l m sàng, phân loại rối loạn lipid máu dựa trên những rối loạn tiên phát hoặc thứ phát và tính chất tăng lipid máu, ví dụ tăng cholesterol đơn thuần, tăng TGs đơn độc hay tăng cả cholesterol và TGs (tăng lipid máu hỗn hợp) Phân loại này có bất cập l không tính đến các bất thường của lipoprotein (ví dụ giảm HDL hoặc tăng LDL) mà... nhân có dấu hiệu l m sàng của rối loạn lipid máu, bệnh xơ vỡ động mạch xuất hiện sớm (trước 60tuổi), tiền sử gia đình có người mắc bệnh động mạch hoặc cholesterol máu > 240 mg/dL (> 6.2mmol /L) Chẩn đoán xác 1 9 định bằng xét nghiệm các thành phần lipid máu: cholesterol toàn phần (TC), HDLcholesterol (HDL-c) và LDL-cholesterol (LDL-c) 1.3 Bệnh đái tháo đường 1.3.1 Khái niệm và phân loại 1.3.1.1 Khái... trình rối loạn chuyển hóa lipit ở mỗi loại ĐTĐ mang những đặc trưng riêng Đặc trung chung của rối loạn chuyển hóa lipit trong ĐTĐ l sự tăng triglyceride, giảm HDL-C và LDL-C vẫn nằm trong giới hạn bình thường Tuy nhiên ở ĐTĐ typel rối loạn tăng triglyceride sẽ mất đi khiểm soát được glucose máu khác với type 2, rối loạn này có thể vẫn kéo dài mặc dù có sự điều trị giảm glucose máu thích hợp LDL-C của type2 . tài: Nghiên cứu đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ l cây Dâu tằm (Morus alba L. )” 2. Mục đích nghiên cún Tách chiết và nghiên cứu một số đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ l cây Dâu. hợp chất từ cây cỏ với các đặc tính sinh học quý giá. Cây Dâu tằm hay còn gọi l cây Dâu ta, có tên khoa học l Morus alba L, l một loài thực vật thuộc họ Dâu tằm (Moracaae). Nó được biết đến l một. ỜNG ĐẠI HỌC s PHẠM HÀ NỘI 2 NGUYỄN THỊ HIÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH Dược HỌC • • • CỦA DỊCH CHIÉT TỪ L CÂY DÂU TẰM (Morus aỉba L. ) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN