v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ix BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT x LỜI MỞ ĐẦU 1 Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về pho mát 3 1.1.1. Pho mát 3 1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ pho mát trên thế giới và Việt Nam 4 1.1.3. Công nghệ sản xuất pho mát 6 1.1.4. Các quá trình chuyển hóa của vi khuẩn lactic trong sản xuất pho mát 8 1.1.4.1. Quá trình chuyển hóa lactose 9 1.1.4.2. Quá trình chuyển hóa axit lactic 10 1.1.4.3. Quá trình chuyển hóa citrate 11 1.1.4.4. Quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo 14 1.1.4.5. Quá trình phân giải protein 16 1.2. Giống khởi động cho sản xuất pho mát 19 1.2.1. Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động trong công nghiệp sản xuất pho mát 19 1.2.1.1. Các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm 20 1.2.1.2. Các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt 21 1.2.1.3. Các chủng khởi động “thủ công” 22 1.2.2. Chức năng cần thiết của giống khởi động công nghiệp 23 1.2.2.1. Sản xuất axit 23 1.2.2.2. Tổng hợp enzym phân giải protein 23 1.2.2.3. Tổng hợp exopolysaccharide 24 vi 1.2.2.4. Khả năng tạo hương 25 1.2.3. Tình hình nghiên cứu tạo giống khởi động cho sản xuất pho mát ở Việt Nam 26 Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 2.1. Hóa chất và thiết bị 27 2.1.1. Hóa chất 27 2.1.2. Thiết bị 27 2.2. Nguồn sữa và chủng vi sinh vật 28 2.3. Môi trường 28 2.2.1. Môi trường MRS 28 2.2.2. Môi trường thử citrate 28 2.2.4. Môi trường thử khả năng đông tụ sữa 29 2.4. Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1. Phương pháp kiểm tra khả năng đông tụ sữa 29 2.4.2. Phương pháp xác định kiểu len men 30 2.4.3. Phương pháp kiểm tra phổ nhiệt độ sinh trưởng 30 2.4.4. Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng citrate 30 2.4.5. Phương pháp định lượng exopolysaccharide 30 2.4.6. Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng số phenol - axit sunfuric 31 2.4.7. Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzym protease ngoại bào 32 2.4.8. Xác định hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH 32 2.4.9. Phương pháp xác định hoạt tính X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase 33 2.4.10. Định lượng protein bằng phương pháp Lowry 35 2.4.11. Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng nguồn cacbon 36 2.4.12. Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzym 37 2.4.13. Phương pháp xác định tên loài bằng trình tự 16S rDNA 39 2.4.14. Phương pháp sản xuất pho mát tươi 40 2.4.15. Tách hợp chất dễ bay hơi bằng phương pháp chưng cất 41 vii Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 42 3.1. Nghiên cứu đặc điểm của giống khởi động cho sản xuất pho mát 42 3.1.1. Khả năng đông tụ sữa 43 3.1.2. Phổ nhiệt độ sinh trưởng 45 3.1.3. Kiểu lên men lactic 46 3.1.4. Khả năng chuyển hóa citrate 47 3.1.5. Khả năng tổng hợp exopolysaccharide 49 3.1.6. Hoạt tính protease ngoại bào 50 3.1.7. Khả năng tổng hợp enzym X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase 51 3.1.8. Khả năng tạo hương thơm của các chủng vi khuẩn lactic trên mẫu pho mát tươi 52 3.1.9. Hoạt tính chống oxy hóa 52 3.2. Hồ sơ bộ chủng giống tuyển chọn 54 3.2.1. Định tên chủng 54 3.2.2. Khả năng sử dụng các nguồn đường 55 3.2.3. Phổ hoạt tính enzym 58 3.3. Phối trộn 2 chủng M11 và T21 60 3.3.1. Thời gian đông tụ và đặc tính của sữa lên men bởi hỗn hợp chủng M11 và T21 60 3.3.2. Khả năng tạo các hợp chất dễ bay hơi của hỗn hợp chủng M11 và T21 trong lên men sữa 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 73 viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Phân loại pho mát theo độ ẩm 3 Bảng 1.2: Mô tả vị và ngưỡng giá trị của vị của một số axit amin của pho mát Cheddar (ủ chín 6 tháng) 16 Bảng 1.3: Các hợp chất hương hình thành từ quá trình chuyển hóa axit amin qua axit α – keto theo con đường chuyển hóa transaminase 19 Bảng 1.4: Các giống khởi động của một số loại pho mát 19 Bảng 2.1: Các nguồn cacbon của bộ kit API 50 CHL 36 Bảng 2.2: Enzym và cơ chất của bộ kit API ZYM 37 Bảng 3.1. Thống kê các chủng vi khuẩn lactic được khảo sát 42 Bảng 3.2: Khả năng đông tụ sữa của vi khuẩn lactic 44 Bảng 3.3: Dải nhiệt độ sinh trưởng của các vi khuẩn lactic 46 Bảng 3.4: Kiểu lên men lactic của các vi khuẩn lactic 47 Bảng 3.5: Khả năng chuyển hóa citrate của các vi khuẩn lactic 48 Bảng 3.6: Hàm lượng exopolysaccharide được tổng hợp bởi các vi khuẩn lactic 49 Bảng 3.7: Hoạt tính protease ngoại bào của các vi khuẩn lactic 50 Bảng 3.8: Hoạt lực X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase của các vi khuẩn lactic 51 Bảng 3.9: Cảm quan hương thơm của mẫu pho mát 52 Bảng 3.10: Khả năng giảm gốc DPPH của sữa lên men bởi các vi khuẩn lactic 53 Bảng 3.11: Khả năng sử dụng đường 55 Bảng 3.12: Phổ hoạt tính enzym của chủng M11 và T21 58 Bảng 3.13: Thời gian đông tụ của sữa lên men bởi chủng M11, T21 61 Bảng 3.14: Đặc tính của sữa lên men bởi hỗn hợp chủng 61 Bảng 3.15: Các cấu tử trong thành phần các hợp chất dễ bay hơi của pho mát tươi .62 ix DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Sản lượng pho mát trên thế giới giai đoạn 2000 – 2010 5 Hình 1.2: Tỉ trọng kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa 6 của Việt Nam, năm 2009 6 Hình 1.3: Sơ đồ sản xuất pho mát Cheddar (a) và Emmental (b) 8 Hình 1.4: Các con đường lên men hexose (glucose) chính ở vi khuẩn lactic 9 Hình 1.5: Các con đường chuyển hóa lactate trong giai đoạn ủ chín pho mát 10 Hình 1.6: Các con đường chuyển hóa citrate của các chủng Cit + thuộc Lactococcus và Leuconostoc sp. 12 Hình 1.7: Con đường tiềm năng tổng hợp succinate của các chủng Lactobacillus 13 Hình 1.8: Các con đường chuyển hóa axit béo tự do 15 Hình 1.9: Khái quát các con đường chuyển hóa protein tạo hương ở các sản phẩm sữa lên men 18 Hình 1.10: Vị trí của polysaccharide được tổng hợp bởi các vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) trên tế bào 25 Hình 3.1: Khả năng đông tụ sữa của VNC1 và T21 sau 24 giờ 45 Hình 3.2: Khả năng sử dụng citrate 48 Hình 3.3: Hoạt tính phân giải casein của các vi khuẩn lactic 51 Hình 3.4 : Hình thái tế bào hai chủng T21 và M11 54 Hình 3.5: Khả năng sử dụng các nguồn đường của chủng M11 và T21 sau 48h 57 Hình 3.6: Hoạt tính enzym dịch nội bào của chủng M11 và T21 60 x BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSA Bovine serum albumin CoA Coenzyme A CO 2 Carbon dioxide CPS Capsular polysaccharides DNA Deoxyribonucleic Acid DPPH 2,2 – diphenyl – 1 – picrylhydrazyl EPS Exopolysaccharide FAA Free amino acid FAO Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc GC - MS Gas chromatography – Mass spectrometry H 2 Hydrogenium LAB Lactic acid bacteria MRS de Man, Rogosa and Sharpe (Medium for LAB) OD Optical Density pNA p – nitroaniline PCR Polymerase Chain Reaction rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic acid TCA cycle Tricarboxylic acid cycle WHO Tổ chức Y tế Thế giới 1 LỜI MỞ ĐẦU Pho mát là một thực phẩm giàu dinh dưỡng, có hàm lượng protein cao với đầy đủ các axit amin không thay thế, chứa nhiều vitamin như: Vitamin A, riboflavin, vitamin B, vitamin D và các chất khoáng: kẽm, photpho, canxi. Pho mát cũng mang lại nhiều lợi ích về sức khỏe như: Bảo vệ răng, chống loãng xương, ngăn ngừa ung thư. Theo thống kê của FAO, sản lượng pho mát trên toàn thế giới liên tục tăng qua các năm. Năm 2013, sản lượng pho mát đạt khoảng 20 triệu tấn/năm. Trong đó, sản xuất và tiêu thụ sản phẩm này chỉ tập trung ở các nước phát triển. Ở Việt Nam, hầu hết pho mát được nhập khẩu và mức tiêu thụ còn khiêm tốn: kim ngạch nhập khẩu pho mát chỉ đạt 24,04 triệu USD (năm 2008), chiếm khoảng 7% tổng kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa. Một trong những nguyên nhân là do sản phẩm chưa hợp với thị hiếu của người Việt Nam và giá thành cao. Tuy nhiên, cùng với đà tăng trưởng kinh tế thì nhu cầu về các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng, tốt cho sức khỏe như pho mát sẽ tăng cao. Năm 2009, mức tiêu thụ sữa và các sản phẩm từ sữa bình quân đầu người đang ở mức rất thấp 11,2 kg/người/năm so với mức bình quân 62 kg/người/năm của Châu Á, 96 kg/người/năm của thế giới và 248 kg/người/năm ở các nước phát triển. Như vậy có thể thấy nhu cầu về sữa và các sản phẩm từ sữa trong đó có pho mát ở Việt Nam còn rất lớn. Vi khuẩn lactic được coi là vi sinh vật an toàn và đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất và bảo quản thực phẩm. Trong ngành công nghiệp sản xuất pho mát, các vi khuẩn lactic với vai trò là giống khởi động được sử dụng nhằm tạo lập các đặc điểm đặc trưng về cảm quan, cấu trúc và dinh dưỡng cho sản phẩm. Hơn nữa, hệ enzym của vi khuẩn lactic cũng góp phần tích cực chuyển hóa các sản phẩm thủy phân protein từ sữa thành các hợp chất có hoạt tính sinh học. Các giống khởi động đã được thương mại hóa thường là sự kết hợp của một, hai hoặc một vài chủng thuộc thuộc các chi Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc. 2 Hiện nay, ở Việt Nam đã có nghiên cứu về công nghệ sản xuất chế phẩm giống khởi động cho lên men thực phẩm như nem chua, tôm chua, sữa chua. Tuy nhiên, nghiên cứu về giống khởi động ứng dụng cho sản xuất pho mát vẫn chưa được tiến hành nhiều. Xuất phát từ những vấn đề trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn chủng giống khởi động cho lên men pho mát”. Mục tiêu của đề tài: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic làm giống khởi động phục vụ cho sản xuất pho mát. Nội dụng nghiên cứu  Khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn lactic làm giống khởi động trong sản xuất pho mát: khả năng đông tụ sữa, kiểu hình lên men lactic, sinh tổng hợp exopolysaccharide, chuyển hóa citrate, hoạt tính X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase, hoạt tính chống oxy hóa.  Tuyển chọn chủng giống, định tên và lập hồ sơ bộ chủng giống.  Kiểm tra đặc tính của sữa lên men và khả năng tạo hương của pho mát tươi làm từ sữa lên men bởi hỗn hợp chủng giống. 3 Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về pho mát 1.1.1. Pho mát Pho mát (hay phô mai) là tên gọi chung của một nhóm các sản phẩm từ sữa, được sản xuất trên toàn thế giới với đủ các hương vị, màu sắc, độ mềm cứng khác nhau. Hiện nay, có hơn 1000 loại pho mát, được làm từ nhiều nguồn khác nhau như sữa bò, cừu, dê , nhưng chủ yếu là từ sữa bò. Pho mát là một thực phẩm có nguồn gốc lâu đời, được cho là bắt nguồn từ khu vực nằm giữa hai con sông Tigris và Euphrates, nay là Iraq, cách đây khoảng 8000 năm [26, 59]. Pho mát là một thực phẩm giàu dinh dưỡng, có hàm lượng protein, chất béo tương đối cao, ở dạng dễ hấp thu, có đầy đủ các axit amin không thay thế, các vitamin và chất khoáng [9, 58]. Theo định nghĩa của FAO/WHO, pho mát là sản phẩm rắn hoặc bán rắn, ở dạng tươi hoặc đã qua ủ chín, thu được bằng cách làm đông tụ sữa hoặc các nguyên liệu từ sữa: sữa gầy, sữa tách béo, cream, whey cream, nhờ hoạt động của enzym rennet hoặc các tác nhân đông tụ thích hợp khác và làm tách một phần nước khỏi quện sữa đông [62]. Pho mát có thể được phân loại theo nhiều cách khác nhau: tác nhân đông tụ casein, độ ẩm, loại vi sinh vật tham gia vào quá trình ủ chín hay dựa vào cấu trúc của pho mát. Phân loại theo độ ẩm, pho mát được chia các loại như sau: Bảng 1.1: Phân loại pho mát theo độ ẩm [66] Loại pho mát Độ ẩm, % Sản phẩm Pho mát mềm 55- 80 Pho mát tươi, không ủ chín: Cottage, Ricotta, Quarg, Mozzarella Pho mát ủ chín bề mặt bằng nấm mốc: Brie, Camembert Pho mát bán rắn 41 - 55 Pho mát có quá trình ủ chín: Limburger, Gorgonzola, Roquefort Pho mát rắn 20 - 40 Pho mát ủ chín có cấu trúc mắt: Emmental Pho mát ủ chín không có cấu trúc mắt: Cheddar, Cheshire 4 Phân loại pho mát dựa vào cấu trúc và công nghệ sản xuất: - Pho mát tươi đông tụ bởi axit, không bổ sung enzym rennet hoặc nếu có thì với tỷ lệ rất thấp. Axit được tạo ra thường bằng vi khuẩn lactic. Tuy nhiên có một số loại pho mát tươi được axit hóa trực tiếp bởi gluconodelta – lactone. Sản phẩm điển hình là Cottage, Quark, Cream và pho mát tươi Bắc Mỹ. - Pho mát tươi đông tụ bởi rennet, không bổ sung vi khuẩn lactic hoặc nếu có thì rất ít như: Quesco, Balnco, Quesco Fresco, Halloumi, pho mát tươi từ Ý. - Pho mát đông tụ bởi axit ở nhiệt độ cao. Sản phẩm có độ ẩm cao nhưng chắc. Sản phẩm điển hình như Ricotta (Ý), Channa và Paneer (Ấn Độ), pho mát trắng Mỹ - Latin. - Pho mát mềm ủ chín: vi khuẩn lactic được cấy vào để lên men lactic trước khâu được đông tụ bởi enzym rennet. Một số pho mát điển hình như: Fetta, Camembert, Brie, Blue. - Pho mát bán cứng có qua giai đoạn rửa hạt pho mát sau đông tụ như: Gouda, Edam, Colby. - Pho mát cứng nhiệt độ thấp, không qua giai đoạn rửa hạt pho mát sau đông tụ như: Cheddar, Pasta Filata. - Pho mát cứng nhiệt độ cao, quá trình tách nước hỗ trợ bằng nhiệt độ cao như: Romano, Swiss, Parmersan. 1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ pho mát trên thế giới và Việt Nam Theo thống kê của FAO, sản lượng pho mát trên thế giới năm 2010 đạt khoảng 20,2 triệu tấn, trong đó tập trung chủ yếu ở khu vực châu Âu, bắc – trung Mỹ với sản lượng tương ứng là 10,3 và 6,8 triệu tấn. Trong giai đoạn từ 2000 – 2010, sản lượng pho mát trên toàn thế giới tăng 3,6 triệu tấn, trung bình mỗi năm sản lượng pho mát tăng khoảng 2% [80]. Tình hình tiêu thụ pho mát cũng khác nhau rõ rệt giữa các nước và theo khu vực. Pho mát chủ yếu được tiêu thụ ở các nước phát triển, tập trung nhiều ở khu vực châu Âu và bắc Mỹ. Tuy nhiên, các số liệu thống kê cũng cho thấy lượng pho mát tiêu thụ được cho đã tăng ở hầu hết các nước. [...]... Giống khởi động cho sản xuất pho mát 1.2.1 Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động trong công nghiệp sản xuất pho mát Giống khởi động cho sản xuất sản phẩm từ sữa là vi sinh vật được chủ động bổ sung vào nguyên liệu để tạo ra sản phẩm cuối cùng với các đặc điểm mong muốn, thông qua sự phát triển và quá trình lên men của chúng [64] Bảng 1.4: Các giống khởi động của một số loại pho mát [17] STT Loại pho mát. .. nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm lactic dùng cho tôm chua Nghiên cứu về giống khởi động cho lên men sữa chưa có nhiều công bố: Trần Thị Ngọc Mai (2010) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cộng sinh giữa chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus spp và nấm men Saccharomyces cerevisiae nhằm tạo ra hạt Kefir ổn định về chất lượng ứng dụng cho cho sản xuất sữa chua Hiện nay, hướng nghiên cứu. .. các chủng thuộc chi Leuconostoc Trong sản xuất pho mát, có thể sử dụng chủng đơn lẻ hoặc kết hợp các chủng với nhau tạo giống khởi động Trong hỗn hợp giống khởi động thì các chủng sinh axit chiếm ưu thế 90 – 99%, còn các chủng tổng hợp chất hương chỉ chiếm 1 – 10% [15] Các chủng lactic ưa ấm đã được sử dụng trong sản xuất nhiều loại pho mát khác nhau Người ta ước tính rằng hai phần ba quá trình lên men. .. trong 15 – 20 giây Một số loại pho mát như Parmigiano – Reggiano làm từ sữa tươi chưa qua thanh trùng - Đông tụ sữa: Quá trình đông tụ casin có thể thực hiện bằng tác nhân đông tụ là enzym hoặc giống khởi động Một số loại pho mát, quá trình này diễn ra nhờ sự kết hợp cả hai tác nhân trên Giống khởi động cho mỗi loại pho mát thường khác nhau: Giống khởi động trong sản xuất pho mát Cheddar là các vi khuẩn... dimethyltrisulphide [77] 1.2.3 Tình hình nghiên cứu tạo giống khởi động cho sản xuất pho mát ở Việt Nam Hiện nay, nhiều nghiên cứu liên quan đến phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic cho lên men thực phẩm, axit lactic, probiotics đã được công bố: Lê Thanh Bình và Phạm Thị Ngọc Lan (1997); Lê Thanh Bình và cs (2008), Lê Ngọc Trân và cs (2008); Nguyễn La Anh và cộng sự (2013) Các nghiên cứu về công nghệ sản xuất chế... cathepsin D); các chủng khởi động và các chủng tự nhiên có trong sữa; các chủng khởi động thứ cấp gặp ở một số loại pho mát rắn: Propionibacterium freudenreichii ở pho mát Thụy Sĩ, P camemberti ở pho mát Camembert và Brie, P roqueforti ở pho mát Blue [61] Ngoài ra, các peptidase hoặc proteinase cũng có thể được bổ sung vào quện sữa để đẩy nhanh quá trình chín [29] 16 Ở hầu hết các loại pho mát, quá trình... thuần túy của pho mát Những nghiên cứu ở pho mát Cheddar cho thấy pho mát được sản xuất từ sữa đã thay chất béo bằng nguồn lipit khác đã không tạo ra hương thơm chính xác Trên thực tế, việc phát triển hương vị hài hòa là khó khăn chính khi sản xuất loại pho mát ít hoặc tách chất béo [29, 60] Quá trình phân giải lipit diễn ra chủ yếu trong giai đoạn ủ chín pho mát Lipase tồn tại trong pho mát do nhiều... riêng, điều quan trọng là tạo ra sản phẩm có chất lượng cao và ổn định Điều này phụ thuộc chủ yếu vào giống khởi động sử dụng Nhiều nghiên cứu về vai trò và những thuộc tính cần thiết của giống khởi động cho sản xuất pho mát đã được thực hiện [19, 22, 39] Về cơ bản, giống khởi động trong sản xuất pho mát cần có những đặc điểm: sinh axit, ảnh hưởng tích cực đến sự hình hương thơm, tổng hợp exopolysaccharide,... whey khởi động Thành phần hệ vi sinh vật của giống khởi động tự nhiên này là rất phức tạp, tương đối biến đổi và thường không xác định Mặc dù hiệu suất không ổn định, trái ngược với xu hướng hiện nay trong công nghệ tạo chủng khởi động (hiệu suất phải ổn định), việc thay thế bằng những chủng khởi động xác định đôi khi tạo ra sản phẩm ít hương thơm hơn [17] Trong nhóm này, bên cạnh các chủng khởi động. .. thermophilus được sử dụng làm giống khởi động trong sản xuất thực phẩm và các sản phầm từ sữa 1.2.1.3 Các chủng khởi động “thủ công” Giống khởi động “thủ công” (hay tự nhiên), bắt nguồn từ việc sử dụng một phần sản phẩm của mẻ lên men trước để cấy sang mẻ mới Một số loại pho mát Ý và Thụy Sĩ, nước sữa (whey) tách ra từ sữa đông của lô sản xuất trước được ủ trong điều kiện chọn lọc như nhiệt độ cao và . Nghiên cứu tuyển chọn chủng giống khởi động cho lên men pho mát . Mục tiêu của đề tài: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic làm giống khởi động phục vụ cho sản xuất pho mát. Nội dụng nghiên. đã có nghiên cứu về công nghệ sản xuất chế phẩm giống khởi động cho lên men thực phẩm như nem chua, tôm chua, sữa chua. Tuy nhiên, nghiên cứu về giống khởi động ứng dụng cho sản xuất pho mát. hóa.  Tuyển chọn chủng giống, định tên và lập hồ sơ bộ chủng giống.  Kiểm tra đặc tính của sữa lên men và khả năng tạo hương của pho mát tươi làm từ sữa lên men bởi hỗn hợp chủng giống.