DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hình thái tế bào đặc trƣng của Phaeococcus catenatus CBS 650. 76. Hình 2. Hình ảnh tế bào Exophiala salmonis CBS 157.67. Hình 3. Hình ảnh tế bào Aureobasidium pullulans. Hình 4. Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella acetoabuten CBS 169.66 (phải). Hình 5. Cây phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella. Hình 6. Hình ảnh tế bào của Geotrichum candidum (trái) và Trichosporon beigelii (phải). Hình 7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu phát hiện. Candida albicans và Candida dubliniensis. Hình 8. Một số mẫu hoa phân lập đƣợc Moniliella. Hình 9. Vị trí các địa điểm thu thập mẫu phân lập Moniliella tại Việt Nam. Hình 10. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào một số chủng nấm men Moniliella phân lập đƣợc. Hình 11. Phổ fingerprinting của 126 chủng Moniliella phân lập đƣợc. Hình 12. Vị trí các chủng đại diện phân lập đƣợc thuộc chi Moniliella. Hình 13. Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC) 5 của các chủng Moniliella carnis và Moniliella dehoogii. Hình 14. Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC) 5 của các chủng Moniliella byzovii. Hình 15. Tế bào sinh dƣỡng của Moniliella carnis (KFP 246 T ) sinh trƣởng trên môi trƣờng YM ở 25C sau 5 ngày (trái) và trên môi trƣờng tinh bột ngô Dalmau agar sau 7 ngày (phải). Hình 16. Tế bào sinh dƣỡng của Moniliella dehoogii KFP 211 T sinh trƣởng trong YM ở 25C sau 5 ngày (trái) trên môi trƣờng Dalmau tinh bột ngô sau 7 ngày (phải). Hình 17. Tế bào sinh dƣỡng của chủng TBY 2041.7 T sinh trƣởng trên môi trƣờng Dalmau tinh bột ngô sau 5 ngày. Hình 18. Sự hình thành Chlamydospore ở chủng TBY 2041.7 T sinh trƣởng trên môi trƣờng Yeast Cacbon Base agar không có nguồn nito. Hình 19. Hình thái khuẩn lạc của Moniliella byzovii TBY 2041.7 T (trái) và TBY 2041.8 (phải) trên môi trƣờng Malt-Glucoseagar sau 45 ngày nuôi cấy ở 28C. Hình 20. Hình thái khuẩn lạc của M. dehoogii KFP 211 T và TBY 2041.5 trên môi trƣờng Malt glucose 2°Bx sau 10 ngày nuôi cấy ở 28°C DANH MỤC BẢNG Bảng 1. So sánh đặc điểm của chi Moniliella và một số chi khác. Bảng 2. Phƣơng pháp trộn lẫn tế bào các chủng trong cùng 1 loài để phát hiện pha sinh sản hữu tính. Bảng 3. Các chủng nấm men đen Moniliella phân lập đƣợc. Bảng 4. Ký hiệu các chủng trong PCR fingerprinting. Bảng 5. Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting. Bảng 6. Danh sách chủng Moniliella trong mô tả loài mới. Bảng 7. Danh sách các chủng thuộc 2 nhóm M. byzovii. Bảng 8. Sự khác nhau những đặc tính quan trọng giữa M. carnis, M. dehoogii, M. byzovii và những loài đã biết thuộc chi Moniliella. Bảng 9. Phân lập Moniliella tại Việt Nam và trên thế giới DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CBS – Centraalbureau voor Schimmelcultures (Bảo tàng giống Vi sinh vật Hà Lan) h – hour (giờ) NRRL-Northern Regional Research Laboratory (hiện là National Center For Agricultural Utilization Research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ) DGGE-Denaturing gradient gel electrophoresis rDNA-Ribosomal DNA rRNA-Ribosomal RNA PCR – Polymerase Chain Reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi) RFLP-Restriction Fragment Length Polymorphism (đánh giá đa hình DNA theo phƣơng pháp cắt hạn chế) T – Type strain (chủng chuẩn) MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN 2 1.1. NHÓM NấM MEN ĐEN 2 Một số chi nấm men đen 2 1.1.1. Chi Phaeococcomyces 2 1.1.2. Chi Exophiala 3 1.1.3. Chi Aureobasidium 3 1.1.4. Chi Moniliella 4 1.2. MộT Số PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOạI NấM MEN 10 1.2.1. Các phương pháp phân loại truyền thống 10 1.2.2. Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử 12 1.3. MộT Số PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIệN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DạNG VI SINH VậT 14 CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. ĐốI TƢợNG 18 2.2. HÓA CHấT, DụNG Cụ, TRANG THIếT Bị MÁY MÓC 18 2.2.1. Hóa chất 18 2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc 19 2.3. THÀNH PHầN MÔI TRƢờNG Sử DụNG TRONG NGHIÊN CứU 19 2.3.1. Môi trường làm giàu có nồng độ đường cao 19 2.3.2. Môi trường Malt-Glucose 2  Bx có axit lactic 1‰ 19 2.3.3. Môi trường Malt-Glucose 2  Bx không có axit lactic 20 2.3.4. Môi trường thử khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhau 20 2.3.5. Môi trường thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau 20 2.3.6. Thử khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và muối cao 21 2.3.7. Môi trường xác định khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau. 2.3.8. Môi trường thử khả năng hình thành tinh bột 22 2.3.9. Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải urea 22 2.3.10. Môi trường đánh giá khả năng sinh trưởng khi có mặt Cycloheximide 23 2.3.11. Môi trường đánh giá khả năng chống chịu acid acetic 1 % 23 2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CứU 24 2.4.1. Phương pháp phân lập 24 2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào 25 2.4.4. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm men 25 2.4.5. Phương pháp tinh chế DNA 25 2.4.6. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting 26 2.4.7. Phương pháp điện di 26 2.4.8. Nhuộn gel và đọc kết quả 27 2.4.9. Phương pháp phân loại nấm men dựa vào đọc trình tự rDNA 27 2.4.10. Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau 28 2.4.11. Đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn nito khác nhau. 28 2.4.12. Đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và nồng độ muối cao. 29 2.4.13. Đánh giá khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 29 2.4.14. Thử khả năng hình thành tinh bột 29 2.4.15. Thử khả năng phân giải urea 29 2.4.16. Thử khả năng chống chịu với cycloheximit 30 CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1. KếT QUả PHÂN LậP 32 3.2. QUAN SÁT HÌNH THÁI KHUẩN LạC, Tế BÀO 36 3.3. PHÂN NHÓM BằNG Kỹ THUậT FINGERPRINTING 37 3.5. MÔ Tả CÁC NHÓM LOÀI MớI THUộC CHI MONILIELLA 44 3.5.1. Phân tích đặc tính di truyền của 3 loài mới 46 3.5.2. Đặc tính kiểu hình, sinh lý, sinh hóa của 3 loài mới 48 3.6. Sự ĐA DạNG MONILIELLA PHÂN LậP TạI VIệT NAM 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC Luận văn thạc sĩ K20 – Vi sinh vật học 1 Đinh Đức Hiền MỞ ĐẦU Chi Moniliella đƣợc thiết lập bởi bởi Stolk và Dakin năm 1966 để xác lập vị trí phân loại cho 2 loài mới tìm đƣợc khi đó là Moniliella acetoabutens và Moniliella tomentosa. Năm 2009, căn cứ vào sự tƣơng đồng nhất định về di truyền cũng nhƣ một số đặc tính sinh lý, sinh hóa quan trọng, Rosa và cộng sự đã xếp một chi khác là Trichosporonoides vào Moniliella. Nhƣ vậy, trƣớc khi nghiên cứu của chúng tôi đƣợc thực hiện, chi Moniliella bao gồm 9 loài, đó là Moniliella acetoabutens, M. fonsecae, M. megachiliensis, M. mellis, M. nigrescens, M. oedocephalis, M. pollinis, M. spathulata và M. suaveolens. Phân loại của Moniliella thực sự vẫn chƣa rõ ràng. Trình tự gần nhất của Moniliella fonsecae trong Genbank là Phylloporia pectinata, một thành viên của Agaricomycotina. Với những trình tự khác, Moniliella thuộc Ustilagionomycotina. Hơn nữa, sự khác biệt về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi Moniliella lại rất lớn, có thể tới 15-16% trong đoạn D1/D2. Do vậy việc tìm kiếm những loài trung gian giữa các loài đã biết sẽ góp phần làm sáng tỏ phân loại của Moniliella. Moniliella đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất erythriltol, một loại đƣờng chức năng có giá trị thƣơng mại cao. Gần đây, Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện một số đặc tính công nghệ ít hoặc chƣa đƣợc biết tới của Moniliella nhƣ khả năng chuyển hóa thầu dầu thành γ-declactone (tinh dầu đào) với độ tinh khiết cao, khả năng sinh lipase, khả năng sinh một loại kháng sinh (zymocin) mới. Các nội dung nghiên cứu trong bản luận văn này đƣợc thực hiện nhằm đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam, góp phần củng cố hệ thống phân loại của chi và tạo cơ sở cho nghiên cứu công nghệ có sử dụng Moniliella, cụ thể những nội dung nghiên cứu bao gồm: - Phân lập nấm men Moniliella từ các nguồn mẫu khác nhau tại các địa điểm khác nhau ở Việt Nam. - Phân nhóm, phân loại Moniliella phân lập đƣợc bằng hình thái; PCR fingerprinting; giải trình tự DNA; phân tích cây phả hệ. - Phân tích sự đa dạng nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam về số loài, phân bố. Luận văn thạc sĩ K20 – Vi sinh vật học 2 Đinh Đức Hiền Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.1. Nhóm nấm men đen Nấm men đen đƣợc phát hiện từ khoảng đầu thế kỷ 20 nhƣng khi đó ngƣời ta mới chỉ biết đến một vài chi trong số chúng. Nấm men đen sinh sản vô tính là chủ yếu, bằng nảy chổi, tạo sợi hay mô phân sinh. Điều tạo nên sự khác biệt giữa chúng và các nhóm nấm men khác là chúng có melanin trong thành tế bào làm cho khuẩn lạc có thể có màu vàng lục, màu ô liu đến nâu sẫm, đen. Ngoài ra, nấm men đen còn chứa carotenoid và mycosporines. Một trong các lý do khiến những hiểu biết về nấm men đen kém xa so với các vi sinh vật khác có lẽ là do sự sinh trƣởng chậm, khả năng cạnh tranh thấp với loài khác nên dễ bị bỏ qua trong các nghiên cứu, thêm nữa cấu trúc bào tử đính của chúng lại ít đặc điểm phân biệt, trong khi hiện tƣợng đa hình thái của cùng một chủng lại khá phổ biến và gây khó khăn trong quá trình phân loại [9]. Một số chi nấm men đen 1.1.1. Chi Phaeococcomyces Gồm 3 loài đã đƣợc công nhận là: P. exophialae, P. Catenatus, P.nigricans Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc sinh trƣởng chậm, nhầy, bề mặt có nhiều nếp nhăn, màu đen. Tế bào dạng hình cầu đến elip. Bào tử đính chuyển từ không màu sang nâu đậm hoặc đen [5, 7]. Hình 1. Hình thái tế bào đặc trƣng của Phaeococcus catenatus CBS 650. 76. (nguồn www.mycobank.org) Luận văn thạc sĩ K20 – Vi sinh vật học 3 Đinh Đức Hiền 1.1.2. Chi Exophiala Đƣợc mô tả đầu tiên vào năm 1966 bởi Carmichael với loài mới Exophiala salmonis [5]. Đến nay chi này gồm 28 loài: E. castellanii, E. jeanselmei, E. moniliae, E. pisciphila, E. salmonis, E. spinifera. E. jeanselmei Exophiala phân bố nhiều trong đất, nƣớc, thực vật, gỗ mục, và là nguyên nhân gây nhiều bệnh ở ngƣời. Exophiala có đặc điểm hình thái và sinh lý rất đa dạng, hình thái cơ bản có thể tóm tắt nhƣ sau: Chiếm ƣu thế trong môi trƣờng nuôi cấy là tế bào là dạng phân đốt, thon dần về phía ngọn, một vài đốt hợp với nhau ở bên trong, mỗi đốt là một tế bào, đôi khi gồm hai tế bào. Khi còn trẻ, các tế bào có dạng hình cầu, sinh sản bằng nảy chồi giống nhƣ nấm men thông thƣờng, xếp thành chuỗi dài. Sau một thời gian nuôi cấy, bắt đầu hình thành các vách ngăn bên trong sợi nấm, tạo thành đốt. Các đốt này có hình trụ, mọc kiểu tia và đặc trƣng bởi các eo thắt hẹp. Sau đó, từ các đốt sinh ra các bào tử hình elip kích thƣớc 1-3  3-6 μm. Các bào tử này thƣờng gồm một tế bào, tập trung ở đỉnh của đốt hay trên cuống bào tử đính [5, 7]. Hình 2. Hình ảnh tế bào của Exophiala salmonis CBS 157.67 (Nguồn www.cbs.knaw.nl) 1.1.3. Chi Aureobasidium Các loài thuộc Aureobasidium có phổ phân bố tƣơng đối rộng và đƣợc tìm thấy trong đất, xác thực vật, lá cây. Aureobasidium gồm 14 loài trong đó A. pullulans đƣợc biết đến nhiều nhất. Về mặt hình thái, Aureobasidium tạo khuẩn lạc lúc đầu màu trắng, sau chuyển sang màu sẫm hoặc đen. Đƣờng kính sợi nấm từ 2-10 μm. [...]... pháp phân loại nấm men Hệ thống phân loại của nấm men hiện nay gồm có 14 lớp, 5 phân lớp, 15 họ, 95 chi và khoảng 1500 loài [18] Hệ thống phân loại nấm men đƣợc xây dựng dựa trên các sự tƣơng đồng và khác biệt giữa các taxa theo các đánh giá phân loại truyền thống với cơ sở là đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại hiện đại với cơ sở là thông tin di truyền 1.2.1 Các phương pháp phân loại. .. trong tế bào, phân tích hệ coenzyme Q, tỷ lệ G+C, đặc tính huyết thanh miễn dịch 1.2.2 Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử Ngoài phƣơng pháp phân loại truyền thống các nhà phân loại còn có thêm một công cụ nữa là phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử Nhờ sự phát triển của kỹ thuật di truyền và máy móc hiện đại giúp các nhà phân loại học có thêm cơ sở vững chắc để phân loại, thậm chí... Phƣơng pháp phân loại truyền thống dựa vào các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa để phân loại nấm men [1, 18] Dựa vào đặc điểm hình thái tế bào nấm men: nấm men là cơ thể đơn bào nhƣng rất đa dạng về hình thái tế bào Thông thƣờng tế bào nấm men có hình elip, hình cầu, một số có hình kéo dài dạng que, đôi khi có hình quả chanh Vì vậy, dựa vào sự khác nhau về hình thái ta có thể sơ bộ phân loại các... khảo sát Từ 1653 mẫu này, có 126 chủng nấm men Moniliella đƣợc phân lập và sử dụng làm đối tƣợng nghiên cứu Ngoài ra còn có 78 chủng Moniliella phân lập đƣợc trƣớc đây trong nội dung khóa luận tốt nghiệp đại học của học viên cũng đƣợc sử dụng phục vụ nghiên cứu 2.2 Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc 2.2.1 Hóa chất Hóa chất dùng trong nuôi cấy: Agar (Việt Nam) , Malt (Đan Mạch), Glucose (Trung... phát hiện pha sinh sản hữu tính của Moniliella 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp phân lập Các loại mẫu đƣợc thu thập từ các địa điểm khác nhau Nấm men đen có trong các mẫu đƣợc làm giàu trong các môi trƣờng có nồng độ đƣờng cao Sau đó đƣợc phân lập trên môi trƣờng Malt-Glucose 2Bx có thành phần nhƣ đã nêu ở mục 2.3 Quy trình tiến hành phân lập như sau:  Nấm men đen có trong mẫu đƣợc làm giàu... này một cách rộng rãi trong phân loại Đoạn gen mã hóa rDNA 26S: Một trong những thành tựu quan trọng đã đạt đƣợc trong nghiên cứu đa dạng nấm men gần đây là thiết lập đƣợc cơ sở dữ liệu về trình tự D1/D2 của rDNA 26S cho tất cả các nấm men đã biết Điều đó cho phép so sánh loài mới phân lập với các loài đã biết, nhờ đó xác định đƣợc tên và vị rí của nó trong hệ thống phân loại một cách nhanh chóng và... loài một cách chính xác mà không cần nghiên cứu đến nhiều khía cạnh cùng một lúc Phân tích thành phần thành tế bào: Dựa trên cơ sở thành phần trong chuỗi polysaccarit cấu tạo nên thành tế bào giữa các loài nấm men khác nhau thì khác nhau Việc phân tích thành phần thành tế bào cung cấp một đặc điểm quan trọng để phân loại nấm men Các thành phần của thành đƣợc sử dụng để phân tích bao gồm glucan, mannan,... phẩm đang tiến hành thực hiện đề tài cấp Nhà nƣớc Nghiên cứu công nghệ sản xuất đƣờng chức năng erythritol từ tinh bột” thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020, sử dụng nấm men Moniliella Một trong những mục tiêu đƣợc đặt ra trong luận văn là đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam và cung cấp một số lƣợng lớn chủng giống phong... quá trình lên men So với các nấm men khác cũng nhƣ vi khuẩn, tế bào nấm men Moniliella có kích thƣớc khá lớn thuận lợi cho công nghệ thu hồi sản phẩm (lọc, ly tâm) Ngoài ra, trên môi trƣờng cơ chất rắn, Moniliella có thể phát triển ở dạng sợi và thích hợp với công nghệ sản xuất lên men bề mặt [8] Moniliella đƣợc quan tâm nhiều tới khả năng chuyển hóa glucose thành erythritol Erythritol là loại đƣờng chứa... Rao & de Hoog (1975) Moniliella nigrescens (Hocking & Pitt) Rosa & Lachance (2008) Moniliella oedocephalis (Haskins & Spencer) Rosa & Lachance (2008) Moniliella pollinis (Hennebert & Verachtert) de Hoog & Guého (1984) Moniliella spathulata (de Hoog) Rosa & Lachance (2008) Moniliella suaveolens (Lindner) von Arx (1972) Phần lớn các loài thuộc chi Moniliella phân lập đƣợc thƣờng phân bố ở những nơi có . Moniliella, cụ thể những nội dung nghiên cứu bao gồm: - Phân lập nấm men Moniliella từ các nguồn mẫu khác nhau tại các địa điểm khác nhau ở Việt Nam. - Phân nhóm, phân loại Moniliella phân. mẫu hoa phân lập đƣợc Moniliella. Hình 9. Vị trí các địa điểm thu thập mẫu phân lập Moniliella tại Việt Nam. Hình 10. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào một số chủng nấm men Moniliella phân lập đƣợc 1.2. Một số phƣơng pháp phân loại nấm men Hệ thống phân loại của nấm men hiện nay gồm có 14 lớp, 5 phân lớp, 15 họ, 95 chi và khoảng 1500 loài [18]. Hệ thống phân loại nấm men đƣợc xây dựng dựa