 Đồ án Tốt nghiệp TÓM TẮT Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát 3 vấn đề sau: Tối ưu hai yếu tố là pH nuôi cấy và độ pha loãng của nước thải Surimi để nuôi cấy Bacillus thuringensis var. israelensis. Quan sát, so sánh hình thái tế bào vi khuẩn khi nuôi trên môi trường này với nuôi trên môi trường chọn lọc GYS (Glucose-Men-Muối). Cuối cùng là khảo sát hoạt lực diệt ấu trùng muỗi của bào tử vi khuẩn Bacillus thuringensis var. israelensis sau khi nuôi cấy trên môi trường nước thải. Kết quả cho thấy: Hình thái tế bào vi khuẩn khi nuôi trên hai môi trường không có sự khác biệt. Ở pH = 6,7, độ pha loãng của nước thải = 1/2 và thời gian nuôi 30 giờ lượng sinh khối vi khuẩn nuôi cấy đạt giá trị lớn nhất. Bào tử vi khuẩn Bacillus thuringensis var. israelensis khi nuôi cấy trên môi trường nước thải có khả năng diệt ấu trùng muỗi cao tại nồng độ 10 4 (bào tử/ml). ABSTRACT In this project, we investigated three problems: optimal two elements cultured pH and the dilution of wastewater fishery Surimi cultured Bacillus var. israelensis. Comparing the bacterial cell morphology when cultured on medium wastewater Surimi with cultured on selective medium GYS (Glucose-Yeast-Salt). We investigated degree of activity kill mosquito larvae of spores Bacillus thuringensis var. israelensis. The results show that: Morphology of bacterial cells when cultured on two culture medium no the differences. At pH = 6,7, the dilution of waste water = 1/2 and 30 hour of cultivation to reach maximum biomass. Spores of Bacillus thuringensis var. israelensis has the ability to kill mosquito larvae in high concentrations 10 4 (spores/ml). SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 1  Đồ án Tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Muỗi là côn trùng truyền nhiều bệnh rất nguy hiểm. Các bệnh sốt rét, sốt xuất huyết, sốt vàng da, viêm não Nhật Bản, giun chỉ, sùi chân voi, … do muỗi truyền đã và đang đe dọa sinh mạng của hàng triệu người. [21, 22, 30] Việt Nam có khí hậu thích hợp cho nhiều loài muỗi truyền bệnh sinh trưởng và phát triển. Để diệt muỗi, một biên pháp phổ biến là dùng thuốc diệt muỗi hóa học. Tuy nhiên, việc sử dụng này đã có hiện tượng kháng thuốc, ô nhiễm môi trường và gây hại đối với côn trùng có ích [7, 12, 17, 22]. Do vậy biện pháp an toàn và hiệu quả nhất là sử dụng chế phẩm sinh học diệt ấu trùng muỗi từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) [8]. Bti đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới hơn 20 năm nay nhưng vẫn chưa có một báo cáo nào về sự xuất hiện tính kháng [21, 30]. Hiện nay Bti được sử dụng rộng rãi trên thế giới với các dạng chế phẩm thương mại Vecto Bac, Teknac, … Tuy nhiên giá của các loại chế phẩm này còn tương đối cao so với nền kinh tế của nước ta. Những nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng, vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis có thể sinh trưởng và phát triển tốt trên một số môi trường như nước thải của nhà máy tinh bột sắn, nước thải từ lò giết mổ, … [4, 5]. Những nghiên cứu này có ý nghĩa to lớn vừa có thể tận dụng được nguồn nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm, giảm chi phí xử lí đồng thời nuôi cấy vi sinh vật tạo ra chế phẩm sinh học diệt trừ được ấu trùng muỗi. Ngành công nghiệp chế biến thủy sản phát triển, đem lại nhiều lợi ích to lớn trong việc phát triển kinh tế của vùng. Tuy nhiên chất thải ngành thủy sản sẽ tác động nghiêm trọng đến môi trường đặc biệt là môi trường đất, nước. [3] Với mong muốn tìm ra một nguồn nguyên liệu sẵn có đồng thời tận dụng được phần nào nguồn nước bị ô nhiễm vào mục đích nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis từ đó sản xuất ra chế phẩm diệt trừ ấu trùng muỗi. Em thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng nước thải thủy sản để nuôi chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis tạo chế phẩm sinh học diệt ấu trùng muỗi ”. SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 2  Đồ án Tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.1. Tóm tắt về lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis Lịch sử về Bacillus thuringiensis bắt đầu từ khi Loius Pasteur phát hiện thấy một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm, ông đặt tên là Bacillus bombyces. Năm 1901, Ishiwata phân lập ra một loại vi khuẩn từ ấu trùng tằm bị bệnh và đặt tên là Bacillus sotto. Năm 1911 Berliner đã phân lập được một loại vi khuẩn tương tự từ xác ấu trùng bướm Địa Trung Hải. Đến năm 1915 vi khuẩn này chính thức mang tên Bacillus thuringiensis. [14] Năm 1928, Huszddax phân lập chủng Bacillus thuringiensis (Bt) từ Ephestia, thử nghiệm nó trên sâu đục thân ngô ở Châu Âu, đây được coi là ứng dụng đầu tiên của Bacillus thuringiensis. Chế phẩm thương mại đầu tiên, Sporeine, được sản xuất ở Pháp năm 1938. Năm 1951 - 1956 Steinhaus nghiên cứu khả năng diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis và đã được sản xuất ở Mỹ. Trong suốt những năm 1960, lần lượt các chế phẩm thương mại của Bt đã được sản xuất ở nhiều nơi như Mỹ, Pháp, Đức, … với quy mô khác nhau. Sau đó Howard Dulmage và Clayton Beesle của viện nghiên cứu Nông Nghiệp USDA đã thu thập được bộ sưu tầm đầu tiên về các chủng Bt. Năm 1970, Dulmage đã phân lập được chủng HD - 1 và đến nay vẫn được sử dụng cho nhiều nghiên cứu và sản xuất chế phẩm Bt. Thập niên 80, nhiều công ty sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh đã đăng ký sản xuất và kinh doanh các chế phẩm Bt. Đầu những năm 90 tại một số quốc gia như Cuba, Trung Quốc, Mỹ đã sản xuất chế phẩm Bt ở quy mô công nghiệp. Ngày nay một số lượng lớn thương phẩm trừ sâu sinh học Bt được sử dụng trong việc kiểm soát ấu trùng bộ cánh vẩy, hai cánh và cánh cứng. [15] 1.1.2. Đặc điểm sinh thái và sinh hóa của Bacillus thuringiensis  Đặc điểm sinh thái Bacillus thuringiensis là thành viên của nhóm I, chi Bacillus. Đây là loại vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử, hô hấp hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc. Tế bào có kích thước 3 x 6 µm, có phủ tiêm mao không dày, có khả năng di động, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 3  Đồ án Tốt nghiệp Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao, khô hạn… Bt có khả năng sinh nội bào tử giúp cho chúng chống chịu với điều kiện khắc nghiệt đó. Bào tử của vi khuẩn có dạng hình trứng với kích thước 1, 5 x 2 µm và có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng khi có điều kiện thuận lợi. Sự hình thành bào tử diễn ra đồng thời với sự tạo thành protein tinh thể có khả năng diệt côn trùng. Tinh thể có nhiều hình dạng khác nhau (hình vuông, chữ nhật, hình tháp, hình ôvan hoặc vô định hình). Khi tế bào phân giải tinh thể và bào tử được giải phóng ra ngoài. Tinh thể có kích thước khoảng 0,6 x 0,2 µm, và có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào. Tinh thể này được gọi là thể vùi. Tinh thể và bào tử có thể quan sát dưới kính hiển vi đối pha ở vật kính dầu. Tinh thể bắt màu sẫm còn bào tử không bắt màu nhưng có mép sáng. Hình dạng của tinh thể được quyết định bởi gen mã hoá cho tổng hợp protein của tinh thể nằm trên plasmid. [3] Hình 1.1: Tinh thể độc của Bt dưới kình hiển vi điện tử [25]  Đặc điểm sinh hoá Đa số Bacillus thuringiensis không lên men sinh axít đối với arabinoza, xiloza, và manitol, khử nitơrat thanh nitơrit, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà, phát triển được trong môi trường thạch kị khí có chứa 1% lizozym. Sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 28 - 30 0 C, pH = 6,8 - 7,2. [26] SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 4  Đồ án Tốt nghiệp 1.1.3. Phân loại Bacillus thuringiensis Bt được chia làm nhiều loại phụ dựa trên các đặc điểm sau: + Khả năng hình thành enzyme leucitinase + Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng. + Đặc tính huyết thanh học. + Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các huyết thanh tương ứng. Cho đến nay phương pháp phân loại Bt được sử dụng khá phổ biến là dựa trên các đặc tính huyết thanh học. Đặc tính huyết thanh học của chủng Bt được xác định chủ yếu dựa trên kháng nguyên tiêm mao H và tiến hành bằng phản ứng ngưng kết các tế bào sinh dưỡng với các kháng huyết thanh tương ứng. Tuy nhiên việc phân loại chỉ dựa trên typ huyết thanh tương ứng. Tuy nhiên việc phân loại chỉ dựa trên typ huyết thanh vẫn chưa phản ánh được mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn. Chính vì vậy, gần đây một số nhà khoa học đã đề nghị đưa ra phương pháp phân loại mới dựa trên kết quả xác định typ huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể, hình dạng tinh thể và hoạt lực diệt côn trùng. [6, 14] 1.1.4. Sự phân bố của Bacillus thuringensis Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá, ở đất rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trường có điều kiện thuận lợi cho sâu bọ phát triển như bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo quản ngũ cốc…Sự phân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích. Tuy nhiên, Bt thường có xu hướng tồn tại nhiều trong môi trường có nhiều sâu bọ phát triển và giàu dinh dưỡng. Có thể phân lập Bt từ nhiều loại môi trường khác nhau. Bt dễ dàng phát triển trong môi trường thí nghiệm chỉ với một lượng tối thiểu chất dinh dưỡng. Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhưng chúng không nảy mầm và nhân lên như các tế bào sinh dưỡng trong đất tự nhiên. Điều này chứng tỏ rằng Bt không thích nghi với môi trường đất. [14] 1.2. Tìm hiểu về loài Bacillus thuringensis var. israelensis (Bti) 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 5  Đồ án Tốt nghiệp Bacillus thuringensis được chia làm nhiều loài phụ. Theo bộ sưu tập của trung tâm Bacillus diệt côn trùng Quốc tế, Viện Pastuer Paris năm 1996, đã có tới hơn 69 loài phụ khác nhau như: cánh vẩy, cánh cứng, hai cánh, ở một số loài phụ Bacillus thuringensis var. berliner, Bacillus thuringensis var. thompsoni… Khác với loài Bacillus thuringensis, loài phụ Bacillus thuringensis var. israelensis mới được phát hiện gần đây. Loài phụ này có tác dụng diệt ấu trùng muỗi. Các nhà khoa học Goldberg, Margarit là nhưng người đầu tiên phân lập, nghiên cứu loài vi khuẩn này và De Bajac đặt tên cho là Bacillus thuringensis var. israelensis. Họ đã phân lập và nuôi cấy, thử hoạt lực diệt ấu trùng muỗi với hàng trăm chủng khác nhau. Tuy nhiên chỉ có một số chủng có hoạt lực diệt các loài muỗi Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti và Anopheles sergentti… Chủng đầu tiên đó được kí hiệu là ORN - 60A và thuộc typ huyết thanh H 14 … Ngày nay đã có rất nhiều chủng Bacillus thuringensis var. israelensis được tìm thấy và được phân loại làm phong phú thêm bộ sưu tập về Bacillus diệt côn trùng. Các chủng thường được sử dụng trong việc sản xuất chế phâm sinh học diệt muỗi với các tên gọi khác nhau: Bactimos, Skeetam, Vectobac…chế phẩm dạng lỏng dạng bột thấm nước, dạng viên, bánh nổi có tác dụng diệt ấu trùng của nhiều loài ruồi muỗi trong đó có loài Aedes Aegypti. Chế phẩm Bacillus thuringensis var. israelensis có tác dụng tốt trong môi trường nước sạch, nước có nồng độ muối loãng và được Tổ chức Y tế thế giới lựa chọn để diệt trừ các vectơ truyền bệnh sốt rét, sốt xuất huyết ở các nước nhiệt đới. [21, 28] 1.2.2. Đặc điểm sinh học của Bacillus thuringiensis var. israelensis - Trực khuẩn, kích thước 1-1,2 x 3-5 µm. - Phủ tiêm mao, di chuyển được, Gram +. - Sinh bào tử hình trứng dài, kích thước 1,6 – 2 µm. - Hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc. - Nhiệt độ sinh trưởng 15º - 45ºC. - Phổ biến trong tự nhiên, cư trú trong đất, trên bề mặt cây và trên xác sâu. - Tạo ra tinh thể protein trong giai đoạn tạo bào tử, kích thước 0,6 – 2 µm. Bản chất là protein [14]. SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 6  Đồ án Tốt nghiệp Hình 1.2: Hình dạng dưới kính hiển vi và khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus thuringensis var. israelensis [27] 1.2.3. Đặc điểm phân loại Bacillus thuringensis var. israelensis là loài phụ của loài Bacillus thuringensis. De Bajac là người đầu tên phân loại loài phụ Bacillus thuringensis var. israelensis thuộc typ huyết thanh H 14 . Tuy nhiên vào năm 1988, Ohba và Aiawa (Nhật Bản) đã phân lập được hai chủng Bacillus thuringensis thuộc typ huyết thanh H 14 nhưng lại không có hoạt lực diệt muỗi, ruồi đen. Trước đó (năm 1982) Pachun và cộng sự đã phân lập được chủng PG - 14 thuộc typ huyết thanh H8A, B có hoạt lực cao đối với ấu trùng muỗi Aedes Aegypti, Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti và Anopheles sergentti… Do đó nếu chỉ dựa trên đặc điểm typ huyết thanh thì không thể đảm bảo được phân loại một cách chính xác mà phải dựa trên những đặc điểm khác nhau như lớp Cry, thành phần và hình dạng protein tinh thể. Hofte và Whiteley là những người đầu tiên đưa ra ý tưởng phân loại Bacillus thuringensis var. israelensis dựa trên sự kết hợp của tất cả các đặc điểm: gen Cry, thành phần và hình dạng protein tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng và typ huyết thanh. Ý tưởng này đa được rất nhiều nhà khoa học hưởng ứng và được sử dụng chủ yếu cho đến nay để phân loại Bacillus thuringensis var. israelensis. [14, 15, 22] SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 7  Đồ án Tốt nghiệp Bảng 1.1: Đặc điểm phân loại loài phụ Bacillus thuringensis var. israelensis (theo Hofte và Whiteley, 1989) [14] Lớp gen Cry Thành phần protein (Kda) Hình dạng tinh thể Typ huyết thanh Hoạt lực diệt côn trùng Cry4A 135 Hình cầu H 14 Muỗi, ruồi đen Cry4B 138 Hình cầu H 14 Muỗi, ruồi đen Cry4C 78 Hình cầu H 14 Muỗi, ruồi đen Cry4D 67 Hình cầu H 14 Muỗi, ruồi đen Cyt 28 Hình cầu H 14 Muỗi, ruồi đen 1.2.4. Protein diệt muỗi của loài phụ Bacillus thuringensis var. israelensis Sự hình thành protein tinh thể Bacillus thuringensis thường xảy ra trong quá trình hình thành bào tử và nhiều nghiên cứu gần đây đã cho thấy nó có liên quan mật thiết tới sự có mặt của DNA plasmit. Gen mã hóa protein độc thường nằm trên các plasmit cỡ lớn trên 3kb gồm một phần là gen mã hóa protein độc và phần còn lại mã hóa protein liên quan đến tính gắn. Khi nghiên cứu các cách chủng Bacillus thuringensis var. israelensis có hoạt lực đối với côn trùng thuộc bộ hai cánh, người ta thấy protein độc của chúng bao gồm các tiểu phần protein có trọng lượng phân tử: 130KDa, 128KDa, 78KDa, 67KDa, 28KDa do các lớp gen Cry4A, Cry4B, Cry4C, Cry4D và Cyt mã hóa tổng hợp nên. Đây cũng chính là đặc điểm quan trọng nhất để phân biệt loài phụ Bacillus thuringensis var. israelensis với các loài khác. Nhóm Cry4 mã hóa tổng hợp các protein tinh thể có trọng lượng 130, 128, 78 và 67 KDa, có kích thước thông thường khoảng từ 0,7- 1,2 µm. Nhóm gen Cry4 mã hóa tổng hợp các protein tinh thể có trọng lượng 130, 128, 78 và 67KDa có kích thước thông thường đạt từ 0,7 – 1,2 µm. Nhóm gen Cyt bao gồm hai lớp CytA và SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 8  Đồ án Tốt nghiệp CytB thường tồn tại ở các chủng Bacillus thuringensis var. israelensis mang nhóm gen Cry4 và tổng hợp các protein có trọng lượng phân tử khoảng 28KDa. Các chủng Bacillus thuringensis var. israelensis thường tổng hợp các tinh thể protein hình cầu chỉ gây độc đối với côn trùng hai cánh. Tinh thể độc của Bti gồm hai loại thể vùi protein khác nhau gắn với nhau bằng các lớp vỏ bọc. Mỗi thể vùi được bảo quản bởi một hay nhiều lớp nguyên liệu giống thành phần vỏ bọc mà đây cũng là một đặc điểm chỉ có vỏ Bacillus thuringensis var. israelensis giúp cho tinh thể độc vẫn giữ được độc tính với côn trùng dưới tác dụng của proteaza cùng một số hóa chất khác mà cụ thể như sau: Protein 28KDa có trong thể vùi lớn nhất (chiếm khoảng 40 - 50% tinh thể). Nó thể hiện rõ trên gen polyarcylamide (SDS - PAGE) bởi tính hòa tan của nó cao hơn hắn các protein khác. Đối với protein này dưới tác dụng của enzyme proteaza, nó bị thủy phân thành protein có trọng lượng chỉ còn là 25KDa và hoạt lực diệt ấu trùng muỗi rất thấp. Protein 67KDa có trong thể vùi lớp thứ hai chiếm khoảng 15 - 20% tinh thể. Cũng giống như tiểu phần 28KDa thì protein này cũng bị thủy phân thành các tiểu phần nhỏ hơn 31KDa, 35KDa bởi enzyme proteaza và hoạt tính đối với ấu trùng muỗi cũng kém. Cuối cùng các protein 128KDa và 135KDa có trong thể vùi nhỏ nhất, bị phân hủy thành các nhân độc 58 - 73KDa dưới tác dụng của proteaza nhưng có hoạt lực diệt ấu trùng muỗi cao nhất. Hiện nay protein này đang được tập trung nghiên cứu nhiều nhất và người ta cho rằng hai protein này là thành phần quan trọng đối với hoạt lực diệt ấu trùng của tinh thể. [15, 20, 28] Các thử nghiệm thực tế bằng cách tách riêng rẽ từng loại protein tinh thể của Bacillus thuringensis var. israelensis cho thấy rằng các protein 28, 67, 128, 135 KDa đều có hoạt tính độc đối với ấu trùng muỗi [13, 20]. Tuy nhiên, Chichott và Ellar đã chứng minh rằng việc sử dụng cả 4 loại protein tinh thể sẽ cho hiệu quả cao hơn do có sự tác động qua lại giữa 2 hay nhiều protein. [15] Bảng 1.2: So sánh hoạt lực diệt ấu trùng muỗi Aedes aegypti của protein riêng rẽ và hỗn hợp protein (theo Chichott và Ellar, 1988) [14] SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 9  Đồ án Tốt nghiệp Chế phẩm LC50 (µg/ml) Hỗn hợp tinh thể 0.32 Tinh thể hòa tan 1 Protein 130 KDa 32 Protein 67 KDa 4 Protein 28 KDa 115 1.2.5. Cơ chế gây độc của protein tinh thể do Bacillus thuringensis var. israelensis tổng hợp. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chủng Bacillus thuringensis var. israelensis lên tế bào côn trùng thì có thể thấy rằng cơ chế hoạt động của tinh thể độc chủ yếu diễn ra trong ruột của côn trùng. Bởi khi nuốt phải tinh thể (hay còn gọi là tiền độc tố) dưới tác dụng của pH cao và enzyme proteaza của đường ruột mà tinh thể độc được hòa tan, thủy phân và hoạt hóa thành các nhân độc có hoạt tính. Sau đó các nhân tố độc này bám dính lên tế bào thượng bì ruột, làm phá hủy cấu trúc tế bào ruột và tạo nên các lỗ rò rỉ. Vì vậy, trong ruột côn trùng có sự chênh lệch áp suất thẩm thấu giữa ruột côn trùng với môi trường ngoài tạo điều kiện cho các ion cũng như nước khuếch tán từ ngoài vào gây nên sự phình của tế bào ruột. Cuối cùng, côn trùng ngừng ăn trở nên chậm chạp và sau đó chết hắn. [8, 11, 16, 20] 1.2.6. Cơ chế tác dụng của bào tử vi khuẩn Bacillus thuringensis var. israelensis - Bước 1: Xâm nhập vào các ấu trùng của côn trùng qua đường tiêu hóa. - Bước 2: Protein tinh thể do Bacillus thuringensis var. israelensis tổng hợp được hoạt hóa dưới tác động của môi trường kiềm trong ruột ấu trùng muỗi. - Bước 3: Chọc thủng ruột giữa gây ra sự tổn thương làm chúng ngừng ăn. Sau đó một vài ngày thì ấu trùng muỗi chết. Bti sẽ diệt ở giai đoạn ấu trùng (lăng quăng). Sau khi trứng muỗi được đẻ vào nơi ngập nước hay ẩm ướt (lá khô đọng nước, nước mưa ), trứng sẽ nở thành lăng quăng. Lăng quăng ăn các hạt thức ăn và cả vi sinh vật để phát triển. Đây là thời điểm thích hợp để người ta diệt chúng bằng Bti. Giai đoạn tuổi ấu trùng kéo dài khoảng 10 - 12 ngày. Khi ấu trùng hoá nhộng (khoảng 24 giờ), chúng không ăn nữa, rồi lột vỏ nhộng chui ra thành muỗi. SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 10 [...]... chất, dụng cụ Do vậy, vi c sử dụng chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis đang là lựa chọn hàng đầu của nhiều nước trên thế giới bởi những ưu điểm vượt trội của nó Tại Vi t Nam chế phẩm này đã được sản xuất và thử nghiệm thành công Tuy nhiên, giá thành còn khá cao Vi c nghiên cứu thành công môi trường là nước thải thủy sản có thể thay thế môi trường ban đầu để nuôi chủng vi. .. các hình thoi xếp khít nhau 3.2 Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis nuôi cấy trên môi trường nước thải thủy sản Surimi Hình 3.5: Vi khuẩn tăng sinh trên môi trường nước thải thủy sản Surimi Hình 3.6: Khuẩn lạc của vi khuẩn sau khi được nuôi trên môi trường nước thải SVTH: Hoàng Thị Thủy_ Lớp: 09SH Trang: 34  Đồ án Tốt nghiệp Khuẩn lạc dạng tròn, bờ riềm không đều, có màu... chất nước thải thủy sản Surimi [3] Đơn STT Thông số 1 pH - 6.2 - 7.3 2 CODcr mg/l 1800 - 4000 3 BOD5 mg/l 1400 - 3550 4 NH4+ mg/l 165 - 238 5 PO43- mg/l 47 - 95 6 SS mg/l 980 - 1300 vị Giá trị Xử lý nước thải thủy sản nói chung và nước thải Surimi nói riêng bằng phương pháp sinh học đã được ứng dụng nhiều và mang lại hiệu quả cao Tuy nhiên, vi c sử dụng nước thải để nuôi cấy vi sinh vật trong vi c sản. .. tả toán học cho hàm mục tiêu là mật độ tế bào y Biểu diễn sự phụ thuộc trên đồ thị Matlab và tìm ra giá trị pH và độ pha loãng tối ưu 2.2.8 Khảo sát hoạt tính sinh học diệt trừ ấu trùng muỗi của bào tử chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis sau khi nuôi cấy trên nước thải SVTH: Hoàng Thị Thủy_ Lớp: 09SH Trang: 30  Đồ án Tốt nghiệp Nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis. .. 1.3: Muỗi đẻ trứng [24] 1.3.1.2 Giai đoạn ấu trùng Ấu trùng muỗi thường sống trong nước từ 4 – 14 ngày tùy vào nhiệt độ của môi trường Trong quá trình sống phải chạm vào mặt nước để thở Phần lớn ấu trùng muỗi treo ngược mình gần mặt nước và có một ống thở thò lên trên mặt nước Riêng ấu trùng của loài muỗi Anopheles không có ống thở do đó nó phải nằm song song với mặt nước Ở giai đoạn ấu trùng này muỗi. .. các chế phẩm sinh học, kết hợp xử lý được nguồn nước thải góp phần giảm chi phí xử lý đang được các nhà sinh học quan tâm và đầu tư nghiên cứu CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP SVTH: Hoàng Thị Thủy_ Lớp: 09SH Trang: 17  Đồ án Tốt nghiệp 2.1 Vật liệu - Chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis do phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng cung cấp - Nước. .. bình mẫu để kiểm tra thời gian tồn tại của độc tố vi khuẩn Tiến hành khảo sát thời gian (giờ), số ấu trùng bị tiêu diệt ở các nồng độ pha loãng khác nhau, số ấu trùng còn lại SVTH: Hoàng Thị Thủy_ Lớp: 09SH Trang: 31  Đồ án Tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hoạt hóa, cấy chuyền, nhân giống chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis Chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis. .. loãng để thu được khuẩn lạc đơn nhằm phục vụ cho các mục đích nghiên cứu khác SVTH: Hoàng Thị Thủy_ Lớp: 09SH Trang: 32  Đồ án Tốt nghiệp Hình 3.2: Khuẩn lạc của vi khuẩn nuôi trên môi trường GYS Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis khi được cấy chuyền sang môi trường thạch GYS khuẩn lạc xuất hiện sớm nhất sau 18 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc màu trằng đục, xù xì, khô, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn Khuẩn. .. loãng trong nuôi cấy vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis trên môi trường nước thải Surimi 2.2.7.1 Lập phương án thực nghiệm Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis: nhiệt độ, tốc độ lắc, pH, Các nhà nghiên cứu đã công bố các tài liệu liên quan về điều kiện lên men vi khuẩn Bacillus thuringensis var israelensis. .. thạch nghiêng cũng có màu trắng đục, đồng đều theo đường cấy Sau 24 giờ có thể đem vào bảo quản và giữ giống Hình 3.3: Ống giống thạch nghiêng Làm tiêu bản giọt ép dịch vi khuẩn có sử dụng thuốc nhuộm xanh methylen vì bào tử vi khuẩn Bacillus thuringensis israelensis bình thường không thể quan sát trên kính hiển vi quang học nên cần sử dụng thuốc nhuộm xanh methylen Hình 3.4: Bào tử vi khuẩn nuôi trên . trường nước thải có khả năng diệt ấu trùng muỗi cao tại nồng độ 10 4 (bào tử/ml). ABSTRACT In this project, we investigated three problems: optimal two elements cultured pH and the dilution. SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 2  Đồ án Tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thi u chung về các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.1. Tóm tắt về lịch sử nghiên cứu và. Trang: 3  Đồ án Tốt nghiệp Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi như thi u dinh dưỡng, nhiệt độ cao, khô hạn… Bt có khả năng sinh nội bào tử giúp cho chúng chống chịu