Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Khoa Chăn Nuôi – Thú Y Môn: Dược Phân Tích Xác định hàm lượng của astragalin và isoquercitrin trong lá trinh nữ hoàng cung bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao và điện năng di mao quản Sv thực hiện: Ngô Thị Uyên Phương Trần Thị Thu Thảo Nguyễn Thị Cẩm Tiên Triệu Thu Nghiêm Huỳnh Phú Quý Huỳnh Thị Kim Thu GVHD: PHÙNG VÕ CẨM HỒNG I. ĐẶT VẤN ĐỀ.  Trinh nữ hoàng cung hay Náng lá rộng, Tỏi lơi lá rộng, Tây nam văn châu lan, Tỏi Thái Lan, tên hán văn là Vạn châu lan hay Thập bát học sỹ  Danh pháp khoa học:Crinum latifolium- là một loài thực vật có hoa trong họ Amaryllidaceae.  Được miêu tả khoa học đầu tiên năm 1753.  Cây Trinh nữ hoàng cung có nguồn gốc từ Ấn Độ  Các nước vùng Đông Nam Á như Thái Lan, Lào, Malaysia, Việt Nam và phía Nam Trung Quốc… Phân loại khoa học Giới (regnum) Plantae (không phân hạng) Angiospermae (không phân hạng) Monocot Bộ (ordo) Asparagales Họ (familia) Amaryllidaceae Chi (genus) Crinum Loài (species) C. latifolium Điều trị u phì đại lành tính tuyến tiền liệt Hỗ trợ điều trị u xơ tử cung  Nhóm hợp chất flavonoid cũng được phân lập và chứng minh có công dụng chống oxy hóa: Chất đối chiếu:  Astragalin (98,25%) và isoquercitrin(98,14%) được phân lập và xác định cấu trúc. Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC.  Chuẩn nội sử dụng phương pháp CE là quercetrin (91,34%) do viện kiểm nghiệm thuốc tp.Hồ Chí Minh cung cấp. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu: Astragalin, isoquercitrin trong cao flavonoid chiết từ lá TNHC. Lá TNHC được thu hái tại huyện Tây Sơn tỉnh Bình Định vào tháng 4 năm 2012 và định danh bởi PGS. Võ Thị Bạch Huệ - khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh. Trang thiết bị  Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Alliance 2695-2996  Máy điện di mao quản Agilent G7100A Dung môi, hóa chất  Acenitril, methanol dùng cho HPLC  Acid hydrocloric, ethyl acetat  Natri hydroxyd, acid phosphoric,acid boric, dinatri tetraborat Phương pháp nghiên cứu  Cân chính xác 10g bột lá TNHC ( độ ẩm 12%) cho vào cốc có mỏ 250 ml.  Ở 50 0C siêu âm 3 lần, mỗi lần 30 phút với 50ml cồn 70%.  Chiết xuất cao Flavonoid từ lá TNHC:  Dịch chiết cồn được loại tạp và thu hồi dung môi đến 1/3 thể tích. Acid hóa dịch chiết bằng HCl 1% đến pH 3-4.  Chiết với 10 ml ethyl acetat (x3 lần), gạn lấy lớp ethyl acetat để bay hơi đến rắn thu được cao Flavonoid. Chuẩn bị mẫu phân tích HPLC  Pha dung dịch đối chiếu Pha dung dịch chất đối chiếu trong pha động với nồng độ : Astragalin 250 (µg/ml) Isoquercitrin 100 (µg/ml)  Dung dịch thử Hòa tan toàn bộ cao Flavonoid và thêm vừa đủ bằng pha động tói khi bình được 10 ml. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dịch được tiêm vào hệ thống HPLC.  Điều kiện sắc ký Cột Phenomenex C8, 250 x 4,6,mm. Pha động: acetonitril-acid phosphoric 0,1% (20:80). Nhiệt độ cột: 40 0C. Tốc độ dòng: 1ml/phút. Chuẩn bị mẫu phân tích CE  Dung dịch điện di nền dinatri tetraborat  Hòa tan 0,8581 g dinatri tetraborat vào 40 ml nước, thêm 5 ml methanol, điều chỉnh pH đến 9,0 bằng acid boric, thêm nước để được 50 ml. Dung dịch đối chiếu Pha dung dịch đối chiếu trong methanol Nồng độ của : astragalin 250 (µg/ml) isoquercitrin 100 (µg/ml) Thêm vào dung dịch đối chiếu một lượng chuẩn nội quercetin đạt nồng độ 100 (µg/ml) Dung dịch thử  Toàn bộ cao Flavonoid được hòa tan và điền đầy bằng methanol trong bình định mức 10 ml.  Lọc qua màng lọc 0,22 µm, siêu âm 10 phút trước khi tiêm vào hệ thống CE. Điều kiện điện di  Cột mao quản silica nung chảy : Chiều dài tổng cộng: 64,5 cm Chiều dài hiệu quả: 56 cm Đường kính trong: 50 µm Thể tích tiêm mẫu: 50 mbar’ x5 giây Điện thế: 25 kV Nhiệt độ cột: 25 0C  Dung dịch đệm dinatri tetraborat 45 mM có 10% methanol, pH 9,0.  Bước sóng phát hiện cả hai phương pháp: 264 nm. Khảo sát tính phù hợp của hệ thống.  Đảm bảo tính lặp lại của thiết bị.  Thực hiện trên mẫu đối chiếu và mẫu thử.  Tiêm 6 phần liên tiếp. Mẫu Mẫu đối chiếu Mẫu thử Thông số Isoquercitrin Astragalin Isoquercitrin Astragalin TR TB 11,9 18,24 11,81 18,25 RSD (%) 0,94 0,84 1,22 1,41 S TB 3381504 8045980 3725993 7636722 RSD (%) 1,52 1,02 1,48 1,29 RS TB - 13,5 - 13,38 RSD (%) - 0,57 - 1,00 H TB 244518 360133 275736 423088 RSD (%) 1,32 0,95 1,68 1,57 α TB - 1,61 - 1,61 AF TB 1,12 1,10 1,09 1,07 Bảng 1: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu đối chiếu xác định hàm lượng astragalin và isoquercitrin trong cao flavonoid chiết từ lá TNHC bằng HPLC. III. Kết quả và thảo luận [...]... astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC và CE(n=6) 279,99 Hàm lượng( ppm) -định lượng bằng CE 282,85 276,06 125,8 Hàm lượng( ppm) -định lượng bằng CE 130,95 274,65 124,7 132,06 278,75 292,75 130,0 129,45 274,86 288,00 124,7 131,86 268,40 271,01 125,9 124,30 286,91 273,11 130,1 127,48 TB: 277,49 TB: 280,40 TB: 126,87 TB: 129,35 RSD: 2,21% Astragalin Hàm lượng( ppm) -định lượng bằng. .. Thẩm định quy trình 1 Tính đặc hiệu Sắc ký mẫu trắng, mẫu hỗn hợp các chất đối chiếu, mẫu thử thêm hỗn hợp đối chiếu theo điều kiện sắc ký đã chọn Kết quả: sắc ký đồ HPLC và điện di đồ CE mẫu trắng không có pic có thời gian lưu trùng với các pic của mẫu đối chiếu Sắc ký đồ HPLC và điện di đồ CE của mẫu thử của các pic có thời gian lưu tương đương với các pic của mẫu đối chiếu Khi thêm vào mẫu thử một lượng. .. đúng: Dùng phương pháp trên chuẩn Tiến hành sắc ký và điện di theo điều kiện đã chọn Bảng 3: Kết quả thẩm định quy trình định lượng isoquercitrin, astragalin bằng HPLC Isoquercitrin Astragalin Phương trình hồi qui ŷ = 34148588x ; R2 = 0,9995 ŷ= 31446121x; R2 =0,9991 Khoảng xác định 100-250 (µg/ml) 250-600(µg/ml) Độ lặp lại (n =6) RSD%= 1,72 RSD% =1,60 Độ chính xác trung gian RSD%= 1,99 RSD% = 2,21 Độ... và Isoquercitrin có sự tuyến tính giữa nồng độ Astragalin, isoquercitrin và di n tích pic ( hoặc tỉ số di n tích pic) trong khoảng nồng độ từ 50 đến 1000(µg/ml) Các giá trị RSD của kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian đều nhỏ hơn mức cho phép là 5,3%[1,2] Như vậy, quy trình đạt độ chính xác Tỷ lệ phục hồi các chất đều nằm trong khoảng cho phép từ 90-107%[1,2] Bảng 5: Kết quả định lượng. .. thì có sự tăng lên về di n tích (hoặc tỷ số di n tích) trong mẫu thử Phổ UV tại thời gian lưu của các pic trong mẫu thử giống mẫu đối chiếu 2 Tính tuyến tính Pha 6 dung dịch đối chiếu có nồng độ từ 50 đến 1000 (µg/ml) Độ chính xác: Thực hiện 6 lần định lượng trên 6 mẫu thử cùng nồng độ và điều kiện Độ chính xác trung gian: Thực hiện 6 lần định lượng trên 6 mẫu thử cùng nồng độ trong 6 ngày liên tiếp... thẩm định qui trình định lượng isoquercitrin, astragalin bằng CE Isoquercitrin Astragalin Phương trình hồi qui ŷ = 15,849x ; R2 = 0,9985 ŷ= 14,274x; R2 =0,9982 Khoảng xác định 100-300 (µg/ml) 250-600(µg/ml) Độ lặp lại (n =6) RSD%= 1,79 RSD% =2,16 Độ chính xác trung gian RSD%= 2,32 RSD% = 3,15 Độ đúng (n =9) 102,54% (RSD = 1,23%) 99,89 % ( RSD = 2,21%) Các hệ số R2 đều lớn hơn 0,99; vì vậy Astragalin và. .. 126,87 TB: 129,35 RSD: 2,21% Astragalin Hàm lượng( ppm) -định lượng bằng HPLC RSD: 3,15% RSD: 1,99% RSD: 2,32% Isoquercitrin Hàm lượng( ppm) -định lượng bằng HPLC Kết quả phân tích Anova không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa kết quả định lượng Astragalin và isoquercitrin bằng phương pháp HPLC và CE IV BÀN LUẬN • Phương pháp HPLC:  Pha động: • Phương pháp CE:  Các thông số ảnh hưởng: + Cột...Bảng 2: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu định lượng astragalin và isoquecitrin trong cao flavonoid chiết từ TNHC bằng CE Mẫu đối chiếu Thông số Mẫu thử AF Isoquercitrin TB 11,12 12,65 11,05 12,60 0,32 0,45 1,06 1,30 TB 4,34857 1,73237 3,60148 1,8006 0,016 0,013 1,11 1,65 TB - 12,8 5,01 11,84 RSD (%) RS Astragalin RSD (%) F Isoquercitrin RSD (%) TR Astragalin - 0,6 1,00 0,84 TB 1,31... astragalin và 256; 353 nm của isoquercitrin) HPLC: isoquercitrin được rửa giải trước với hệ sắc ký pha đảo CE: astragalin được rửa giải trước (theo đúng cơ chế hoạt động của phương pháp CE) KẾT LUẬN Xây dựng được quy trình định lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong cao flavonoid của lá Trinh nữ hoàng cung bằng HPLC và CE  Các điều kiện phân tích... vào  Điện di đồ: đệm Borat (45mM), pH 9, 10% methanol, 25oC, 25 kV BÀN LUẬN Đầy đủ yêu cầu về: ─ Tính tuyến tính ─ Khoảng xác định ─ Độ chính xác ─ Độ đúng BÀN LUẬN Lựa chọn astragalin và isoquercitrin làm chất đối chiếu là phù hợp vì chiếm hàm lượng cao trên sắc ký đồ và điện di đồ của mẫu thử ( 264; 346 nm của astragalin và 256; 353 nm của isoquercitrin) . Nuôi – Thú Y Môn: Dược Phân Tích Xác định hàm lượng của astragalin và isoquercitrin trong lá trinh nữ hoàng cung bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao và điện năng di mao quản Sv thực hiện: Ngô Thị Uyên. quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu đối chiếu xác định hàm lượng astragalin và isoquercitrin trong cao flavonoid chiết từ lá TNHC bằng HPLC. III. Kết quả và thảo luận Bảng 2: Kết. tính phù hợp của hệ thống trên mẫu định lượng astragalin và isoquecitrin trong cao flavonoid chiết từ TNHC bằng CE. Mẫu đối chiếu Mẫu thử Thông số Astragalin Isoquercitrin Astragalin Isoquercitrin TR