TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI BÁO CÁO VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: ENZYME PECTINASE Giáo Viên: cô Lại Mai Hương Nhóm : Phạm Ngọc Anh Thy Nguyễn Việt Hoài Hoàng Thò Thoa Phạm Trương Thò Thanh Thủy Nguyễn Diệu Linh Lê Thò Ngọc Đào Tháng 4-2007 1 LỜI NÓI ĐẦU Môn học vi sinh thực phẩm giúp ích rất nhiều cho chúng em trong việc mở rộng kiến thức của mình về thế giới nhỏ bé xung quanh ta, đồng thời còn tạo một nền tảng tri thức vững chắc cho chúng em về lónh vực chuyên môn của mình sau này. Để hoàn thành được bài báo cáo này “ENZYME PECTINASE”, trứơc tiên chúng em xin chân thành cám ơn cô Hương đã giúp chúng em rất nhiều trong việc tìm tài liệu. Cám ơn cô đã gợi mở cho chúng em hướng đi cơ bản, những yêu cầu thiết yếu cần có cũng như những điểm cần chú trọng trong một bài báo cáo. Qua bài báo cáo “ENZYME PECTINASE”, chúng em đã thu được những kinh nghiệm quý báu qua những lần làm việc tập thể, cùng thảo luận và cùng đóng góp ý kiến. Hơn nữa, chúng em đã tổng hợp được một đề tài rất thú vò, bổ sung thêm kiến thức cho mình và đồng thời, dùng để làm nguồn tư liệu về sau. 2 MỤC LỤC I. Enzyme pectinase và cơ chất 1. Cơ chất pectin 2. Enzyme pectase II. Vi sinh vật tổng hợp pectase III. Nuôi cấy thu nhận pectinase 1. Nguyên liệu 2. Chuẩn bò môi trường 3. Phương pháp nuôi cấy 4. Thu nhận enzyme pectinase 5. Tinh sạch enzyme pectinase 6. Sản phẩm của enzyme pectinase IV. Ứng dụng của enzyme pectinase 1. Trong sản xuất rượu vang 2. Trong sản xuất nứơc quả 3. Trong sản xuất các mặt hàng từ quả 4. Trong sản xuất cà phê 5. Trong chăn nuôi 6. Trong trích ly dược liệu đông y 3 I. ENZYME PECTINASE VÀ CƠ CHẤT: 1. Cơ chất pectin: 1.1. Cấu tạo pectin: - Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid galacturonic qua các liên kết α -1,4-glucoside. Tuỳ thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80.000 - 200.000. - Pectin là cơ chất của enzyme pectinase. Pectin rất phổ biến trong thực vật, là hợp chất polimer tự nhiên tồn tại có 3 dạng: protopectin, pectin và acid pectinic. Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khác nhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu. - Pectin có nhiều trong các loại quả (1 – 1,5%). Các vỏ, cùi cam, chanh, dứa có nhiều pectin. Trong rau cũng có pectin như cà rốt, bắp cải, bí. - Các pectin tự nhiên đònh vò trong thành tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không tan. Trong quả xanh, pectin ở dạng không hoà tan gọi là protopectin làm cho quả rất cứng. Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoá học phức tạp. Protopectin tồn tại chủ yếu ở thành tế bào, thường ở dạng liên kết với polysaccharide khác như arabin, tinh bột, cellulose… Khi quả chín, dưới tác dụng của enzyme protopectinase cũng như acid hữu cơ có trong quả làm cho protopectin chuyển thành pectin hoà tan, làm mềm quả. 4 Pectin hoà tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hoá bằng methanol. Tính chất quan trọng nhất của pectin là dễ tạo gel. Pectin được ester hoá cao sẽ tạo gel đặc trong môi trường acid 1% và trong dung dòch đường có nồng độ 65%. - Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hoá bằng methanol. Pectinate là muối của pectinic acid. Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxy, tức là trong đó có chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vò polygalacturonic acid. Pectate là muối của pectic acid. 1.2. Tính chất của pectin: - Pectin là chất bột trắng xám nhạt hay có màu nâu. - Pectin không tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác, không khử oxy. Pectin hoà tan trong nước, amoniac, dung dòch kiềm, cacbonate natri và trong glycerine nóng. + Độ hoà tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hoá trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm. Khi đó, độ nhớt của dung dòch pectin sẽ tăng lên không tỷ lệ với nồng độ. + Pectin dễ bò kết tủa bởi ethanol, isopropanol, acetone, sulfat amon, chlorua nhôm, các muối đồng, muối canxi và acid. - Độ bền vững của pectin trước các enzym pectinase sẽ được tăng lên khi có mặt của các cation, nhất là Al 3+ và Fe 3+ + Pectin hoà tan dưới tác dụng của kiềm loãng hay enzyme pectase sẽ giải phóng nhóm methoxy tạo thành rượu methylic và acid pectic tự do. Pectin chuyển sang dạng keo khi có đường và acid hay kim loại hóa trò cao. - Khi có đường và acid, pectin có tính chất làm đông. Pectin của quả có khả năng đông tốt hơn pectin của rau vì cấu tạo có nhiều nhóm methoxy hơn + Độ kết đông càng cao khi nhóm methoxy càng nhiều. • Khi nhóm methoxy chiếm 11%, pectin đông tốt ở pH = 3,5 • Khi nhóm methoxy chiếm 5%, pectin đông tốt ở pH = 2,9 • Khi hàm lượng pectin khoảng 1%, độ acid từ 1 – 1,3%, pH = 2,8 – 3,2 ; độ đường 65 – 70% thì sản phẩm có thể đông tốt - Pectin thường được sản xuất từ táo, cà rốt, vỏ bưởi, lúa mạch nha… 5 2. Enzyme pectinase: 2.1. Khái niệm: - Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân huỷ của các polymer pectin, làm giảm độ nhớt và giảm khối lượng phân tử của các sản phẩm tạo thành. - Enzyme pectinase được ứng dụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả. - Sản phẩm của quá trình thuỷ phân bởi enzyme pectinase là acid galacturonic, galactose, methanol… 2.2. Các loại pectinaza Theo quan điểm hiện đại, enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng, trong phức hệ enzime có những enzime sau: - Pectinesterase - Polygalacturonase - Transeliminase a. Pectinesterase (PE) (pectase, pectin pectylhydrolase, EC 3.1.1.11) phân cắt liên kết ester giữa methanol và nhóm carboxyl của acid galaturonic theo sơ đồ: Pectin + nH 2 O → methanol + acid pectinic Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vò galacturonate nằm kề đơn vò không bò ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (-OCH 3 ) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Vò trí tấn công nhóm methoxy ở vò trí 5 dễ hơn ở vò trí 3 và 7 (2 gốc – COOH). Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trò pH tối ưu khác nhau: pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzime polygalacturonase sẽ có PH tối ưu từ 2,0 đến 6,5. trái lại PH tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6 đến 7,5 – 8 COOHCOOCH 3 COOCH 3 COOCH 3 COOCH 3 COOH COOCH 3 COOCH 3 COOCH 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 6 Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 45 0 C. Từ 55 đến 62 0 C thì enzime bò vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzime pectinesterase từ thực vật thượng đẳng cao hơn: từ 55 – 60 0 C Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có nhiệt độ tối ưu là 30 – 45 o C, pH opt = 4,5-5,5 và bò vô hoạt ở 55- 62 o C và từ thực vật (pH opt =7,5-8, t o opt = 55-60 o C). Khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin. Ion natri và đặc biệt là ion canxi, cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ nấm mốc Conithyrium diplodiella và từ A.niger. Trái lại các cation hóa trò 3 và 4 (thủy ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase Ngoài ra, người ta đã thu được enzime pectinesterase ở trạng thái đông thể. Và người ta cũng đã xác lập được rằng N-axit cuối trong phân tử enzime là phenylalanin Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do. Và enzime sẽ thủy phân lần lượt cắt liên kết ester dọc theo phân tử pectin. Hoạt động của pectinesterase phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hóa của pectin và tỷ lệ thuận vào mức độ ester hóa. Chẳng hạn, đối với tác động của pectinesterase từ nấm mốc A.niger, cần thiết phải có pectin ester hóa ở mức độ cao không ít hơn 70%. Cấu trúc của pectinesterase từ carrot b.Polygalacturonase(PG)(poly α -1,4-galacturoniglucanohydrolase) (pectinase 3.2.1.12) thuỷ phân liên kết gắn với nhóm –COOH tự do ở đầu hay mỗi mạch, tức là thủy phân liên kết α - 1,4 – D – galactoside giữa các phần tử axit galacturonic trong pectin và trong các axit polygalacturonic khác. 7 Enzyme này ít gặp trong thực vật, chủ yếu có trong vi khuẩn và nấm mốc. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Dựa vào đó người ta chia ra 4 kiêûu sau: - Polymethyl galacturonase (PMG-poly- α -1,4-galacturonid- methyl ester glucanhydrolase.3.2.1.41.EC). PMG lại đựơc phân thành 2 nhóm nhỏ phụ thuộc vào vò trí phân cắt liên kết α -1,4 ở trong hay ở cuối và đầu đoạn mạch • Endo glucosidase polymethyl galacturonase kiểu I (endo-PMG-I). Đây là enzyme có tính chất dòch hoá, pectin ở mức độ methyl hoá càng cao (nhiều gốc methoxy-OCH 3 ) thì bò thuỷ phân càng nhanh và triệt để. Trong môi trường khi có mặt pectinesterase (PE) thì enzyme này thường bò giảm hoạt lực Endo-PMG-I rất phổ biến trong các nòi nấm mốc: Asp.niger, Asp.awamori, Botrytis cinezea, Neurispora crassa) Cơ chế tác dụng như hình vẽ: • Exo-glucozidase polymethyl galacturonase kiểu III (exo – PMG- III). Đây là enzyme có tính chất đường hoá, có khả năng cắt từng gốc monome acid galacturonic ra khỏi mạch bắt đầu từ đầu không khử có nhóm methoxy (-OCH 3 ) Cơ chế tác dụng như hình vẽ: - Enzyme tác dụng lên acid pectinic hay acid pectic – gọi là polygalacturonase (PG) cũng được phân thành 2 nhóm nhỏ: • Endo glucosidase polygalacturonase kiểu II (endo – PG – II). Đây là enzyme có tính chất dòch hoá, chỉ thuỷ phân cơ chất khi có mặt nhóm – 7654321 COOHCOOCH 3 COOCH 3 COOCH 3 COOCH 3 COOCH 3 7654321 COOHCOOCH 3 COOCH 3 COOCH 3 COOH COOCH 3 COOCH 3 8 COOCH 3 COOH tự do. Hoạt độ của endo – PG – II tăng lên nhiều khi cơ chất được xử lý trước bằng pectinesterase (để tạo nhiều gốc –COOH tự do). Nấm mốc và vi khuẩn tổng hợp đựơc enzyme này. Cơ chế tác dụng như hình vẽ: • Exo – glucosidase polygalacturonase kiểu IV (exo-PG-IV) Endopolygalacturonase cũng có tên nữa là polygalacturonase dòch hóa. Còn exopolygalacturonase thì có tên là polygalacturonase đường hóa Các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân pectin bởi polygalacturonase có thể là các axit penta -, tetra -, tri- và digalacturonic pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào nguồn thu và cơ chất. Chẳng hạn polygalacturonase dòch hóa (Endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì PH tối ưu nằm trong khoảng từ 4,0 – 5,5. Cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì lại có PH tối ưu trong khoảng 5,5 – 6. Còn polygalacturonase đường hóa khi tác dụng trên pectin thì pH tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6 Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng PH từ 4 – 6 Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa bằng thủy ngân thì có thể bền vững khi pH 2,5 Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40 -45 0 C. Trong khoảng nhòệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bò vô hoạt hóa khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 65 0 C Các polygalacturonase cũng như pectinesterase đều được hoạt hóa bởi các caiton của kim loại kiềm cũng như cation amon 7654321 COOCH 3 COOCH 3 COOH COOH COOCH 3 COOCH 3 COOH 9 Polygalacturonase từ ERWINIA CAROTOVORA SSP. CAROTOVORA c. Transeliminase (TE) Cấu trúc của Transeliminase Đây là nhóm enzyme được tìm ra cách đây chưa lâu lắm (khoảng năm 1960-1961) bao gồm protopectinase xúc tác sự phân cắt araban, galactan ra khỏi protopectin để tạo thành pectin hoà tan và enzyme transeliminase phân cắt phi thuỷ phân (không có sự tham gia của phân tử H 2 O) pectin để tạo ra các gốc galacturonic có nối kép giữa nguyên tử C 4 và C 5 . Phản ứng xảy ra dễ dàng ở môi trường trung tính hay kiềm yếu 10 [...]... tiếp đến hoạt động sống cũng như khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật Môi trường cần chứa đầy đủ các chất C, N, H, O, các chấtvô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác • Nguồn carbon: Quá trình tổng hợp enzyme pectinase có liên quan đến chất cảm ứng pectin Pectin trong môi trường dinh dưỡng các giống vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme pectinase ngoài tác dụng làm chất cảm ứng... quản Vi c thu nhận chế phẩm enzyme, ta phải chú ý đến thời điểm mà thu được enzyme có hoạt tính cao nhất Tùy vào enzyme cần thu nhận mà ta chọn canh trường và thời gian thu nhận thích hợp sao cho enzyme thu được có hoạt tính cao nhất 4.2 Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề sâu • Phương pháp hiếu khí 34 Canh trường lỏng Tách Cô đặc chân không Sấy khô Sợi nấm Chế phẩm enzyme khô Để thu chế phẩm. .. aerogenes… Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác của thực vật Khi quả bò hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ cùng các loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực vật • Polygalacturonase Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn vi sinh vật PG thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây... Pectate lyase (PEL) là các enzyme vi sinh vật ngoại bào Các enzyme của giống Erwina và Bacillus được biết đến là tác nhân gây ra triệu chứng 12 soft-rod ở thực vật Tuy nhiên, chúng cũng được tìm thấy ở Aeromonas, Pseudomonas, Xanthomonas, Asperigillus và Fusarium Tính chất vật lý của một số enzyme pectinase được sinh tổng hợp từ giống Aspergillus Species and enzyme type Enzyme Mol mass pHopt Topt (°C)... đem đi sấy khô ở 37 oC trong khoảng 10h đến độ ẩm 10%, ta thu được chế phẩm enzyme dạng bột • Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 30oC trong thời gian 40h, sau đó giảm xuống 240C và nuôi trong 48-52h sản phẩm sau lên men được sấy khô thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi... các loại vi sinh vật khác nhau • Nguồn Nitơ: Nguồn Nito dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+ Nếu dùng kết hợp Nitơ hữu cơ với vô cơ sẽ có tác dụng tốt đến quá tình sinh tổng hợp pectinase Muối nitrate là nguồn thức ăn Nito thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp với nhiều nấm men và vi khuẩn Và muối nitrate kim loại kiềm lại kìm hãm tổng hợp enzyme này... Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sự sinh trưởng Ngoài Carbon, Nitơ, các nguyên tố vô cơ cũng có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp các enzyme pectinase mà trước tiên là ảnh hưởng đến trạng thái sinh lý của vi sinh vật, trong đó phospho là cấu tử vô cơ cần thiết cho môi trường 24 Các nguyên tố khoáng dùng trong tổng hợp pectinase: K, Ca, Mg, Fe, Na • Các yếu tố khác như pH của môi... môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí) Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dòch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hoà tan vào dung dòch môi trường Nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme trên môi trường lỏng the phương pháp nuôi cấy bề mặt thường được tiến hành trong... nuôi cấy thường đạt từ 6-7,2 là thích hợp Đối với nấm mốc, pH kiềm kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzyme pectinase pH=4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzyme pectinase Khi pH dòch về phía acid, ngya cả khi pH nằm trong khoảng 4,5-5, tuy sự tạo thành sinh khối không bò ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bò kìm hãm Tuy nhiên, pH của môi trường nuôi cấy A.niger và A.awamori 16 có... nhất định Endopectinliase (Endo-PTE) II VI SINH VẬT SINH TỔNG HP PECTINASE: Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn Nấm mốc: penicillium glaucum, P.ehrlichii, P.chrysogenum, P.expanam, P.cilrimim, Aspergillus awamori, A.foetidus, A.niger, A.terrus, A.saitoi, A.aureus, A.oryzae, A.wentii, Fusarium moniliforme,… Nấm men: Saccharomyces fragilis Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium . CÔNG NGHỆ HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI BÁO CÁO VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: ENZYME PECTINASE Giáo Vi n: cô Lại Mai Hương Nhóm : Phạm Ngọc Anh Thy Nguyễn Vi t Hoài Hoàng Thò Thoa Phạm. cũng như những điểm cần chú trọng trong một bài báo cáo. Qua bài báo cáo ENZYME PECTINASE , chúng em đã thu được những kinh nghiệm quý báu qua những lần làm vi c tập thể, cùng thảo luận và cùng đóng. trường 3. Phương pháp nuôi cấy 4. Thu nhận enzyme pectinase 5. Tinh sạch enzyme pectinase 6. Sản phẩm của enzyme pectinase IV. Ứng dụng của enzyme pectinase 1. Trong sản xuất rượu vang 2. Trong