1 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin cảm ơn Nhà trường Đại hoc Tôn Đức Thắng tạo điều kiện thuận cho chúng tơi có đợt thực tập để nắm bắt thực tế sản xuất Chúng xin cảm ơn thầy cô giảng viên giúp chúng tơi có kiến thức để hiểu lí thuyết ứng dụng vào sản xuất thực tế Chúng xin cảm ơn Ban giám đốc, trưởng phòng Ươm tạo Doanh nghiệp, Th.S Nguyễn Cửu Thành Nhân, Th.S Lê Thị Hiền anh chị nhóm Cơng nghệ tế bào thực vật tạo điều kiện thuận lợi để chúng tơi tìm hiểu mơ hình sản suất thực tế, có điều kiện thực hành luyện tập thao tác môn nuôi cấy mơ thực vật, giúp chúng tơi tích lũy nhiều kinh nghiệm cho công việc sau Cuối xin kính chúc Nhà trường, thầy anh chị trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp khu Nông nghiệp Công nghệ cao lời chúc sức khỏe đạt nhiều thành công công việc sống Chúng xin chân thành cảm ơn! MỤC LỤC Danh mục hình ảnh, sơ đồ Sơ đồ 1.1 Cơ cấu tổ chức Khu nông nghiệp công nghệ cao Sơ đồ 4.1 Quy trình pha mơi trường nhân chồi.29 Sơ đồ 4.2 Quy trình thao tác cấy chuyền lan Danh mục bảng biểu Danh mục viết tắt R&D NNCNC TP HCM NAA 2,4 D IAA IBA GA BA AIA RNA DNA MS Research & Development Nông nghiệp Công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh Naphthaleneacetic acid 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Indole-3-acetic acid Indole-3-butyric acid Gibberellic acid 6-Benzylaminopurine Acetic indole acid Ribonucleic acid Deoxyribonucleic acid Murashige – Skoog LỜI MỞ ĐẦU Ngày với phát triển xã hội gia tăng dân số cách nhanh chóng nhu cầu người ngày gia tăng Cùng với xu việc trồng loại không ngừng gia tăng theo đà phát triển Các phương pháp nhân giống truyền thống đáp ứng nhu cầu thị trường thời gian nhân giống kéo dài chất lượng giống trồng không đồng Do vậy, với phát triển Công nghệ sinh học đại, người dần chuyển từ phương pháp nhân giống truyền thống sang phương pháp nhân giống in vitro Ưu điểm phương pháp nhân nhanh số lượng lớn có chất lượng đồng thời gian ngắn mà phương pháp nhân giống truyền thông đạt Ở trường, việc học thực hành lĩnh vực nuôi cấy mô chọn giống mức độ lý thuyết chưa sâu vào thực tế sản xuất Cho nên việc tạo điều kiện cho sinh viên thực tập để có hội tích lũy kiến thức, kinh nghiệm thực tế vô cần thiết quan trọng Vì vậy, chấp thuận Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp khu Nông nghiệp Công nghệ cao Tp Hồ Chí Minh, chúng tơi chọn đề tài thực tập “Nhân giống loại Lan phương pháp nuôi cấy mơ tế bào thực vật” để tìm hiểu thực tế tích lũy kinh nghiệm cho thân CHƯƠNG GIỚI THIỆU Tổng quan Khu Nơng nghiệp Cơng nghệ cao thành phố Hồ Chí Minh: Khu Nơng nghiệp Cơng nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh xây dựng theo Quyết định số 3534/QĐ-UB ngày 14 tháng 07 năm 2004 Ủy Ban Nhân Dân TP Hồ Chí Minh Địa điểm xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, nằm tuyến đường địa đạo Củ Chi cách trung tâm Thành phố Hồ Chí Minh 44 km phía Tây Bắc, thuận tiện giao thơng tỉnh Hình 1.1 Sơ đồ mặt tổng thể Khu Nông nghiệp Công nghệ cao TP Hồ Chí Minh Khu Nơng nghiệp Cơng nghệ cao TP Hồ Chí Minh có diện tích 88,17 với tổng kinh phí đầu tư 152 tỷ đồng từ ngân sách nhà nước, xây dựng sở hạ tầng thiết yếu, cơng trình phục vụ quản lý hoạt động, bao gồm cơng trình giao thơng, nước, cấp điện, cấp nước, xử lý nước thải,văn phòng làm việc, nhà thí nghiệm, hệ thống nhà kính, nhà lưới, nhà kho, nhà học tập chuyển giao cộng nghệ, hệ thống viễn thơng,… Trải qua năm hình thành phát triển, Khu Nông nghiệp Công nghệ cao TP Hồ Chí Minh phát triển thành Khu kinh tế kỹ thuật, thu hút đầu tư nước, huy động nguồn lực khoa học công nghệ cao sản xuất nông nghiệp Khu Nông nghiệp Cơng nghệ cao TP Hồ Chí Minh xây dựng với mục tiêu tạo môi trường thuận lợi nhằm nuôi dưỡng Doanh nghiệp thành lập phát triển thành Doanh nghiệp đủ lực cạnh tranh thương trường Đây nôi tập trung lực lượng sản xuất đại, kết hợp sản xuất kinh doanh với nghiên cứu, tiếp thu, chuyển giao, phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao , gây dựng tiềm lực công nghệ cao lĩnh vực nông nghiệp cho vùng Đông Nam Nam Bộ, nước, thúc đẩy cơng nghiệp hóa - đại hóa nông nghiệp - nông thôn, nơi đào tạo nguồn nhân lực cho sản xuất nông nghiệp ứng dụng công nghệ cao Khu Nông nghiệp Công nghệ cao TP Hồ Chí Minh nơi thu hút quy tụ nguồn lực, lực công nghệ cao nông nghiệp, theo hướng nông nghiệp đô thị, khu du lịch tri thức nông nghiệp, nơi ươm tạo công nghệ mới, ươm tạo Doanh nghiệp cơng nghệ, thương mại hố công nghệ, hỗ trợ kinh tế hộ, kinh tế trang trại Khu Nơng nghiệp Cơng nghệ cao TP Hồ Chí Minh mơ hình mẫu phát triển Khu Nơng nghiệp Cơng nghệ khác với tiêu chí cụ thể định lượng (hàm lượng chất xám, hiệu ích kinh tế hiệu ích xã hội - sinh thái) Khu Nơng nghiệp Cơng nghệ cao TP Hồ Chí Minh nơi tiếp thu bước làm chủ tri thức, công nghệ ngành chủ lực sản xuất nông nghiệp, nơi nghiên cứu, ứng dụng tri thức công nghệ làm chủ vào thực tế Khu Nông nghiệp Công nghệ cao, đồng thời khuyếch tán công nghệ cao tới nông hộ, trang trại,… tỉnh Nam Bộ Khu Nông nghiệp Công nghệ cao TP Hồ Chí Minh nơi ươm tạo công nghệ, hỗ trợ cho đời vào hoạt động Doanh nghiệp nơng nghiệp có ý tưởng sáng tạo dựa công nghệ cao, nơi cung cấp dịch vụ cho đối tượng tham gia nghiên cứu, sản xuất Nông nghiệp Công nghệ tham gia đào tạo ngắn hạn nguồn nhân lực, tổ chức hoạt động du lịch tri thức nông nghiệp 1.1 Các hoạt động Khu Nông nghiệp Công nghệ cao: 1.2 Hoạt động khoa học công nghệ, nghiên cứu triển khai, ươm tạo 1.2.1 Hoạt động nghiên cứu, triển khai (R&D) Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao hoạt động nhằm mục đích nghiên cứu, xây dựng, triển khai hồn thiện cơng nghệ (nghiên cứu thích nghi, cải tiến cơng nghệ, quy trình sản xuất, nghiên cứu sử dụng, sản xuất chế phẩm sinh học có sử dụng kỹ thuật cao,… lai tạo thử nghiệm giống mới, trình diễn mơ hình sản xuất nơng nghiệp lĩnh vực: rau, hoa lan, cảnh, dược liệu giống sinh vật cảnh (chủ yếu cá kiểng) giống nấm… sở ứng dụng công nghệ cao Công nghệ áp dụng Việt Nam cải tiến, đổi mới, sáng tạo công nghệ phù hợp với điều kiện Việt Nam Ứng dụng vật liệu mới, sản phẩm công nghệ thân thiện với môi trường Hình 1.2 Vườn dưa lê Hình 1.3 Nấm bào ngư Hình 1.4 Cà chua 10 1.2.2 Hoạt động ươm tạo (Do Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao thực hiện) Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao hoạt động với mục tiêu cung cấp dịch vụ ươm tạo công nghệ sản xuất nông nghiệp ươm tạo thành công Doanh nghiệp nông nghiệp ứng dụng công nghệ cao Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao tuyển chọn hỗ trợ cho tổ chức, cá nhân có kết nghiên cứu khoa học cơng nghệ, có ý tưởng khoa học cơng nghệ nơng nghiệp có dự án kinh Doanh khả thi nhằm phát triển thành Doanh nghiệp công nghệ, tạo sản phẩm có chất lượng cao phù hợp với nhu cầu thị trường, có khả kinh Doanh hiệu đáp ứng yêu cầu thị trường khỏi Trung tâm ươm tạo Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao liên kết, phối hợp tổ chức tài chính, tổ chức khoa học - cơng nghệ, cán khoa học kỹ thuật, nhà quản lý có khả kinh nghiệm xây dựng kế hoạch kinh Doanh, luật pháp, kế tốn, cơng nghệ, đào tạo… nhằm giúp Doanh nghiệp cơng nghệ hồn chỉnh sản phẩm cơng nghệ, phát triển kinh Doanh, góp phần vào phát triển kinh tế xã hội thị trường cơng nghệ thành phố Hồ Chí Minh 31 3.3.2 Hấp khử trùng: Các điều kiện khử trùng nuôi cấy mô sau: Nhiệt độ tiệt trùng 121 oC, áp suất atm, thời gian khử trùng 20-25 phút, khử trùng nước Bảng 3.1 Thể tích mơi trường thời gian khử trùng tương ứng Thể tích mơi trường (ml) < 50 75 250 - 500 1000 3.3.3 Môi trường: Thời gian hấp khử trùng (phút) 15 20 25 30 Môi trường: Trong nuôi cấy mơ tế bào thực vật có nhiều loại mơi trường khác Tuy nhiên chia thành nhóm: - Mơi trường nghèo dinh dưỡng: mơi trường Knop, mơi trường Knudson C,… Mơi trường trung bình: điển hình mơi trường White; mơi trường B5 - Gamborg… Môi trường giàu dinh dưỡng: môi trường Murashige – Skoog (môi trường MS) 3.3.4 Các bước pha môi trường MS: Chuẩn bị thành phần Bảng 3.2 Các thành phần khối lượng muối khống mơi trường MS Thành phần Đa lượng NH4NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O Vi lượng CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O H3BO3 KI MnSO4.H2O Nồng độ mg/l 1650 1900 170 370 440 mg/l 0,025 0,025 6,200 0,830 16,900 32 Na2MoO4.2H2O ZnSO4.7H2O FeNaEDTA Vitamin Pirydoxine(B6) Glycine Myo - Inositol Nicotinic acid Thiamin HCl - 0,250 8,600 36,700 mg/l 0,500 2,000 100 0,500 Pha khoáng đa lượng: Các chất cân pha nước cất Pha khoáng vi lượng: Khoáng FeNaEDTA phải để riêng cần phải gia nhiệt để khỏi kết tủa Khi pha stock, thông thường pha 100L dung dịch, vi lượng CoCl2.6H2O, CuSO4.5H2O, Na2MoO4.2H2O… có khối lượng nhỏ cân được, ta pha để sử dụng cho thể tích lớn ví dụ 10000L… Cách pha CoCl2.6H2O sau: Cân khối lượng CoCl2.6H2O pha cho 10000 lít mơi trường, tương đương 0,25 g Hòa tan 0,25 g CoCl2.6H2O 100 ml nước cất Lấy ml dung dịch CoCl 2.6H2O vừa pha, ta có lượng CoCl2.6H2O đủ để pha 100 lít mơi trường ni cấy - Pha chất điều hịa sinh trưởng (ví dụ BA) Cân 100 mg Benzylaminopurine (BA) hoà tan 5ml NaOH 3N Cho thêm nước cất cho đủ 100 ml Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg BA 3.4 Phòng cấy: 3.4.1 Khử trùng nơi thao tác cấy dụng cụ cấy: - Phòng cấy vệ sinh định kỳ, trước đưa vào sử dụng, phịng cấy cần xử lý formol Đóng kín cửa phòng cấy 24 giờ, trung hòa - formaldehyde thừa dịch NH3 25% 24 Khử trùng trước tủ cấy cách lau cồn 70o Bật đèn UV khử trùng tủ cấy 30 phút trước sử dụng 33 - Các dụng cụ mang vào phịng cấy vơ trùng trước: từ áo choàng, mủ vải, trang người cấy đến dao, kéo, kẹp (forceps), giấy lọc, bình đựng nước - cất Trên bàn cấy thường xuyên có đèn cồn để sử dụng cấy - ống nghiệm đựng cồn 96o để nhúng đốt khử trùng dụng cụ cấy Các dụng cụ kim loại kẹp cấy, dao mổ, kim mũi nhọn khử trùng cách đốt lửa đèn cồn Những dụng cụ trước hết phải nhúng vào cồn 96o đốt 3.4.2 Tiến hành cấy: Khử trùng bình thủy tinh chứa mơi trường bình mẫu cấy trước đưa vào tủ cấy Đưa đĩa vào tủ: đĩa sấy bọc lớp giấy báo dùng bình cồn 70 o xịt quanh đĩa, sau cho vào tủ bóc bỏ lớp báo, ý không để tay chạm vào đưa qua đĩa Đốt dụng cụ (kẹp, dao, đĩa) cấy lửa đèn cồn để khử trùng, tránh nhiễm nhiễm khuẩn nấm cho mẫu cấy Đốt miệng bình mẫu cấy sau dùng kẹp lấy nút ra, dùng kẹp gắp bỏ đĩa Sau dùng dao kẹp tách cây, bỏ vàng, cắt bớt rễ Khi làm cần lưu ý tránh đưa tay qua đĩa tránh làm tổn thương Đốt miệng bình mơi trường dùng kẹp mở nút, sau dùng kẹp gắp vào bình mơi trường cho đứng, không cắm sâu Cuối hơ lại miệng bình dùng kẹp đậy nút lại * Lưu ý: Khi mở nắp chai nắp ống nghiệm môi trường nuôi cấy, không chạm tay vào bề mặt bên nắp gịn khơng thả nắp gòn xuống bề mặt gắn trở lại chai mơi trường Sau hồn thành thao tác cấy phải lau chùi dọn dẹp phòng cấy 34 3.5 Phòng sáng ni cây: Hình 3.4 Bên phịng sáng ni Chức năng: cung cấp ánh sáng nhiệt độ thích hợp để sinh trưởng phát triển 3.6 Khu vực huấn luyện cây: Chức năng: giúp thích nghi dần với điều kiện ex vitro Hình 3.5 Khu vực huấn luyện 35 36 CHƯƠNG QUÁ TRÌNH THỰC TẬP TẠI TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CƠNG NGHỆ CAO 37 Cơng việc 1: Pha môi trường nhân chồi lan Dendrobium 38 1.1 39 Quy trình pha mơi trường nhân chồi 1.2 Thuyết minh quy trình (pha 10 lít mơi trường MS nhân chồi) - Lấy dung dịch stock đa lượng, vi lượng, vitamin, Fe-EDTA tương ứng với thể tích cần pha - Chuối khoai tây bóc vỏ, xay nhuyễn máy xay sinh tố - Thêm 500 ml nước dừa - Cân hòa tan 300g đường - Bổ sung stock chất điều hòa sinh trưởng thực vật: BA 10 ml (nồng độ 1mg/l) - Cho tất dung dịch vào bình, thêm nước cất cho đủ 10 lít - Khuấy hỗn hợp chỉnh pH đến 5,8 Độ pH ảnh hưởng đến di chuyển ion, khả hịa tan chất khống Độ pH cao làm cho môi trường rắn pH thấp lại giảm khả đông đặc agar - Cân 10g than hoạt tính cho vào hỗn hợp khuấy - Cho agar vào hỗn hợp vừa pha - Rót vào chai ni cấy loại 500 ml với thể tích từ 50-70 ml/chai tùy giai đoạn nuôi cấy - Hấp tiệt trùng (121°C, 1atm, 20 phút) - Tồn trữ, bảo quản Công việc 2: Cấy chuyền lan Dendrobium Sơ đồ 4.2 Quy trình pha mơi trường nhân chồi 2.1 Quy trình thao tác cấy chuyền lan 40 41 2.2 Sơ đồ 4.3 Quy trình thao tác cấy chuyền lan Thuyết minh quy trình - Chuẩn bị tủ cấy Việc chuẩn bị tủ cấy đóng vai trị quan trọng việc đảm bảo đầy đủ dụng cụ cần thiết cấy mẫu 42 - Mở đèn UV tủ cấy 15 - 30 phút để tiệt trùng tủ, thao tác chung cho tất thao tác (cấy chuyền, vô mẫu, …) - Dụng cụ (dao, kẹp), ống nghiệm, đĩa cấy, chai môi trường chai mẫu cấy xử lý sơ cồn 70° đưa vào tủ Phân phối cồn 96° vào ống nghiệm đèn cồn Tiếp theo lấy dụng cụ ra, cho vào ống nghiệm có cồn 96° Tiến hành đốt dụng cụ đĩa cấy lửa đèn cồn để tiêu diệt vi sinh vật bề mặt Việc khử trùng bề mặt việc quan trọng đảm bảo không tồn vi sinh vật bề mặt làm việc - Khử trùng cổ chai mẫu lửa đèn cồn, dùng kẹp gắp mẫu đĩa cấy Khử trùng cổ chai mẫu nhằm loại bỏ vi sinh vật bám xung quanh cổ chai mẫu Lưu ý gắp mẫu đĩa phải đảm bảo mẫu phải nằm đĩa cấy, tránh mẫu bị rớt chạm vào mép đĩa tránh cho mẫu bị nhiễm - Trước cấy mẫu vào bình mơi trường, nên loại bỏ phần hoại tử mẫu Nếu không loại bỏ phần hoại tử mẫu q trình ni cấy chúng phát triển chậm, yếu không phát triển, ảnh hưởng tới kết nuôi cấy - Tách mẫu thành cụm chồi - Hơ khử trùng cổ chai môi trường cấy chuyền Công việc đảm bảo điều kiện vô trùng kỹ cấy mẫu vào môi trường Dùng kẹp gắp mẫu cắm vào chai môi trường, không cắm sâu ảnh hưởng tới phát triển mẫu - Sau cắm mẫu vào chai, hơ khử trùng cổ chai xung quanh lửa đèn cồn, đậy nắp lại - Dùng bút ghi giấy tên mẫu cấy, môi trường cấy, ngày cấy chuyền, người cấy để tiện theo dõi kết tránh nhầm lẫn Sau dùng thun gắn giấy vào cổ chai mẫu vừa cấy - Cho vào phòng sáng với điều kiện thích hợp giúp mẫu cấy phát triển 43 Hình 4.7 Bình mẫu sau cấy chuyền đặt phịng sáng Cơng việc 3: Chuyển vườn - Khi đạt độ thích nghi định tiến hành để đưa vườn ươm - Dùng kẹp gắp khỏi bình thủy tinh, sau tách vàng, rễ chết thối khỏi rửa nước - Phân loại theo tiêu chuẩn khác - Tiếp theo tiến hành xử lí dung dịch phòng trừ nấm sâu bệnh hại, sau vớt ra, để ráo, cuối đem vườn trồng 44 Hình 4.8 Lan Dendrobium phân loại theo kích thước khác Hình 4.9 Vitamin B1 Hình 4.10 Thuốc trừ bệnh Nhận xét 4.1 Pha môi trường nuôi cấy mô thực vật Môi trường dùng nuôi cấy mô thực vật mà dạng thạch lỏng Ở mơi trường nuôi cấy dạng thạch thường sử dụng, trình tạo đơng mơi trường dễ bị ảnh hưởng nhiều yếu tố pH, nồng độ chất tạo đông, nhiệt độ, nên trình pha cần ý điều chỉnh thông số môi trường nuôi cấy cho phù hợp với sinh trưởng phát triển loại cây, đồng thời chọn chất tạo đông với nồng độ phù hợp để hạn chế việc gây hỏng môi trường nuôi cấy 45 4.2 Cấy chuyền lan Dendrobium Việc cấy chuyền mẫu sang môi trường dinh dưỡng dẫn đến việc nhiễm số loại vi sinh vật không mong muốn vào môi trường nuôi cấy dẫn đến việc gây chết mẫu cấy Thao tác cấy việc đảm bảo vô trùng vấn đề thiết yếu để đảm bảo việc sinh trưởng phát triển mơ thực vật Trong q trình thực tập Trung tâm, chúng thực thao tác cấy truyền chồi số loại lan Dendrobium, lan Gấm, góp phần tạo nên thành thục thao tác, tích lũy thêm kinh nghiệm việc cấy mô thực vật vào môi trường 4.3 Chuyển vườn Khi đạt độ thích nghi định tiến hành để đưa vườn ươm Ở giai đoạn này, tỉ lệ chết tương đối lớn chưa thích nghi với mơi trường 4.4 Thuận lợi hạn chế - Thuận lợi: Trong trình thực tập Trung tâm, tiếp thu kiến thức thực tế, thiết bị, cơng nghệ, máy móc đại, tiếp xúc với anh, chị chuyên viên nghành Cơng nghệ sinh học để học tập, trao dồi kiến thức bổ sung kỹ cơng việc, học tập để hồn thiện - Khó khăn: Thời gian thực tập trung tâm tháng nên chưa tiếp xúc nhiều với thiết bị thao tác với nhiều loại mẫu cấy khác ... Công nghệ cao Tp Hồ Chí Minh, chúng tơi chọn đề tài thực tập ? ?Nhân giống loại Lan phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật” để tìm hiểu thực tế tích lũy kinh nghiệm cho thân 6 CHƯƠNG GIỚI THIỆU... vitro: 1.1 Khái niệm: Nhân giống in vitro, nhân giống ống nghiệm hay nuôi cấy mô tế bào thực vật thuật ngữ thuật ngữ mô tả phương thức nuôi cấy phận thực vật ống nghiệm có chứa mơi trường xác định... bệnh Nhận xét 4.1 Pha môi trường nuôi cấy mô thực vật Môi trường dùng ni cấy mơ thực vật mà dạng thạch lỏng Ở môi trường nuôi cấy dạng thạch thường sử dụng, trình tạo đông môi trường dễ bị ảnh hưởng