BÁO CÁO MỘT SỐ KẾT QUẢ DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP LÀM VẬT LIỆU CHE PHỦ ĐẤT REPORT RESULTS THE TRIAL PRODUCTION PROJECT PERFECTING ANUFACTURE TECHNOLOGIES AND APPLICATIONS MICROBIAL PRODUCTS ROCESSING AGRICULTURAL WASTE PRODUCTS AS SOIL COVER MATERIAL TS. Hoàng Minh Tâm. ThS. Trần Tiến Dũng Đơn vị chủ trì: Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung bộ SUMARY Technology used in the project is modern biotechnology and suitable for the development of a sustainable agriculture is being government and local development priorities. The project has selected 04 strains of microorganisms metabolize organic compounds rich in carbohydrates is SHX01, SHX15, SHX012, SHXDL47; 03 strains of microorganisms convert insoluble phosphate compound is SHV7, SHV10, SHV17; 05 strains of microorganisms countervailing pathogenic rhizosphere upland crops is NA1, SHB17, SHB18, SHB19, SHB21. At the same time, has identified the strains including 06 strains of microorganisms in accordance with the Central South Coastal conditions as a basis for the production of microbial preparations processing agricultural waste products as soil cover material is SHX012, SHXDL47, SHX01, SHB17, SHV7, SHY06. Perfecting processes using of the bio-organic cover substances and inspect and evaluate the quality of bio-organic overlay and build technological processes produce microbial products processing agricultural waste products as soil cover material with the full range of specifications, the density of microbial cells ≥ 10 8 CFU / g. Besides, the project has identified the conditions of storage products, best used after 3 months of storage, test methods and established basic standards for quality products. I. THÔNG TIN CHUNG Công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật (VSV) là kết quả nghiên cứu thuộc đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân bón VSV chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái” (Mã số KC04.04) nằm trong chương trình nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học giai đoạn 2001 - 2005 do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam chủ trì và được Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn công nhận là tiến bộ khoa học kỹ thuật. Sản phẩm được ứng dụng xử lý nhiều loại cơ chất hữu cơ như: phân gia súc, bã nấm, thân xác thực vật, phế phụ phẩm của sản xuất nông nghiệp và một số ngành sản xuất công nghiệp…làm phân bón hữu cơ sinh học và làm nguyên liệu sản xuất cơ chất hữu cơ vi sinh. Công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đã được hoàn thiện và ứng dụng sản xuất thành công tại tỉnh Nghệ An, Đăklăk. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Các chủng VSV chuyển hoá hợp chất hữu cơ giàu hydratcacbon + Phương pháp kiểm tra mật độ: Sử dụng phương pháp Kock, kiểm tra mật độ VSV tổng số trên môi trường thạch thịt, kiểm tra mật độ xạ khuẩn trên môi trường Gause, kiểm tra mật độ nấm men trên môi trường Hansen. + Phương pháp kiểm tra hoạt hoạt tính: Hoạt tính của VSV được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch, trong đó hoạt tính sinh học được xác định bằng đường kính vòng phân giải; đó là vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch (đối với trường hợp khoan lỗ thạch). + Xác định hoạt độ enzym phân giải: Hoạt độ enzym phân giải xenluloza được xác định thông qua hoạt độ endo- glucanse (CMCase) do VSV sinh tổng hợp. - Các chủng VSV đối kháng + Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng: Chủng vi khuẩn đối kháng cần kiểm tra được cấy bằng tăm vô trùng lên điểm giữa của bề mặt môi trường KB (môi trường đặc). + Tuyển chọn: Sử dụng phương pháp đục lỗ thạch và cấy chấm điểm + Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng: Xác định một số 1 đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn đối kháng theo phương pháp của N.W. Schaad - 2001. - Các chủng VSV chuyển hóa hợp chất phosphat khó tan + Môi trường kiểm tra: Môi trường dùng để kiểm tra mật độ VSV phân giải hợp chất photpho khó tan được sử dụng là môi trường chứa nguồn photpho duy nhất là Tricanxi phophat [Ca3( PO4) 2 ] hoặc Lexitin. + Xác định hoạt độ enzym phân giải: Xác định hoạt tính phân giải photphataza của các chủng VSV lựa chọn được định thông qua hoạt tính enzym phytase (cơ chất chứa photphat hữu cơ) bằng dung dịch màu Amonium molypdate - Xác định bộ chủng VSV phù hợp: Sử dụng những kỹ thuật VSV thường quy phòng thí nghiệm nhằm xác định mật độ và hoạt tính các chủng VSV đã lựa chọn trong điều kiện tổ hợp. - Xây dựng và hướng dẫn kiểm tra chất lượng chế phẩm: Phương pháp kiểm tra chất lượng chế phẩm được xây dựng trên cơ sở các tiêu chuẩn Việt Nam và tiêu chuẩn ngành TCVN 6168:1996, 6167:1996, 10TCN:714-2006, 10 TCN 867-2006 về chất lượng và phương pháp kiểm tra chất lượng chế phẩm và phân bón VSV. Kiểm tra chất lượng chế phẩm thông qua việc xác định mật độ VSV, tính số lượng VSV trên ml hoặc trên g mẫu từ số khuẩn lạc phát triển trong các đĩa được chọn . III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lựa chọn chủng giống VSV chuyển hóa hợp chất hữu cơ giàu hydratcacbon phù hợp với điều kiện vùng DHNTB 3.1.1. Lựa chọn bộ chủng xạ khuẩn vật phân giải cellulose - Hoạt tính sinh học của các chủng VSV: Bảng 1: Hoạt tính sinh học của chủng VSV TT Ký hiệu Đường kính vòng phân giải CMC (D-d) cm Đường kính vòng phân giải tinh bột (D-d) cm 1 SHXDL23 + 1,8 2 SHX02 2,2 + 3 SHXDL47 5,6 2,0 4 SHX04 - 1,8 5 SHX05 - 1,8 6 SHX012 4,8 2,0 Ghi chú: (+): Vòng phân giải nhỏ (<1 cm), (-): Không có hoạt tính Kết quả kiểm tra hoạt tính phân giải cellulose của các chủng VSV trong bảng 1 cho thấy chủng SHXDL47 và SHX012 có hoạt tính sinh học phân giải CMC cao nhất. Chủng SHXDL47 có đường kính vòng phân giải CMC (D-d) = 5,6 cm, Chủng SHX012 có đường kính vòng phân giải CMC (D-d) = 4,8 cm, kết quả đánh giá c€ng cho thấy ngoài khả năng phân giải cellulose chủng SHXDL47 và SHX012 còn có hoạt tính phân giải tinh bột (đường kính vòng phân giải tinh bột của chủng SHXDL47 và chủng SHX012 là (D-d) = 2,0 cm), tính chất đa hoạt tính sinh học này làm tăng thêm hiệu quả xử lý chất thải hữu cơ khi ứng dụng trong thực tế. Dựa vào kết quả nghiên cứu thu được dự án lựa chọn chủng SHXDL47 và SHX012 làm vật liệu phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo. - Đặc điểm sinh lý, hình thái các chủng SHXDL47 và SHX012 : + Chủng SHXDL47 được tuyển chọn trên môi trường Gauze trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy 37 0 C. Sau 72-96 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc tròn, có đường kính 2-2,5mm, màu trắng đục, có mùi thơm ngái, chân khuẩn lạc bám sâu, chặt vào môi trường. Khi được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể (Gauze), sau 72 giờ chủng SHXDL47 tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤ 1 mm, làm trong môi trường nuôi cấy, trên thành bình tạo vòng váng màu trắng và bám chặt vào thành bình, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 72 giờ nuôi cấy cho thấy SHXDL47 đạt 2 mật độ ≥ 8.10 8 CFU/ml. Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau 72-96 giờ chủng SHXDL47 phát triển làm môi trường dịch thể chia làm 2 trạng thái, phía dưới ở trạng thái huyền phù, phía trên trong hơn, bề mặt môi trường không đóng váng, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 96 giờ nuôi cấy cho thấy SHXDL47 đạt mật độ ≥ 3.10 6 CFU/ml. + Chủng SHX012 được tuyển chọn trên môi trường Gauze trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy 370C. Sau 72-96 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc chủng SHX012 tròn, đường kính 2-2,5 mm, rìa ngoài màu trắng đục, tâm màu xanh, có mùi hắc, chân khuẩn lạc bám sâu, chặt vào môi trường. Khi được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể (Gauze), sau 72 giờ chủng SHX012 tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤ 1 mm, làm trong môi trường nuôi cấy, trên thành bình tạo vòng váng màu trắng và bám chặt vào thành bình, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 72 giờ nuôi cấy cho thấy SHX012 đạt mật độ ≥ 8.10 8 CFU/ml. Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau 72-96 giờ chủng SHX012 phát triển làm môi trường dịch thể chia làm 2 trạng thái, phía dưới ở trạng thái huyền phù, phía trên trong hơn, bề mặt môi trường không đóng váng, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 96 giờ nuôi cấy cho thấy SHX012 đạt mật độ ≥ 10 6 CFU/ml. 3.1.2. Lựa chọn bộ chủng xạ khuẩn phân giải tinh bột - Hoạt tính sinh học của các chủng VSV: Bảng 2: Hoạt tính sinh học của chủng VSV TT Ký hiệu chủng Đường kính vòng phân giải tinh bột (D-d) cm Đường kính vòng phân giải CMC (D-d) cm 1 SHX01 2,8 1,8 2 SHX12 + 1,6 3 SHX13 + 1,6 4 SHX14 - 2,5 5 SHX15 4,2 2,2 6 SHX16 + 2,2 Ghi chú: (+) Vòng phân giải <1 cm, (-) Không có hoạt tính Kết quả kiểm tra hoạt tính phân giải tinh bột của các chủng VSV trong bảng 2 cho thấy chủng SHX01 và SHX15 có hoạt tính sinh học phân giải CMC cao nhất. Chủng SHX01 có đường kính vòng phân giải CMC (D-d) = 2,8 cm, chủng SHX15 có đường kính vòng phân giải CMC (D-d) = 4,2 cm, kết quả kiểm tra c€ng cho thấy ngoài khả năng phân giải tinh bột chủng SHX01 và SHX15 còn có hoạt tính phân giải cellulose (đường kính vòng phân giải CMC của chủng SHX01 (D-d) = 1,8 cm và chủng SHX 15là (D-d) = 2,2 cm). - Đặc điểm sinh lý, hình thái các chủng SHX01 và SHX15 : + Chủng SHX01 được tuyển chọn trên môi trường Gauze trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy 37 0 C. Sau 72-96 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc tròn, có đường kính 3-4 mm, màu trắng xám, có mùi thơm ngái, chân khuẩn lạc bám sâu, chặt vào môi trường. Khi được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể (Gauze), sau 72 giờ chủng SHX01 tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤1 mm, làm trong môi trường nuôi cấy, trên thành bình tạo vòng váng màu trắng và bám chặt vào thành bình, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 72 giờ nuôi cấy cho thấy SHX01 đạt mật độ ≥ 8.10 8 CFU/ml. Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau 72-96 giờ chủng SHX01 phát triển làm môi trường dịch thể chia làm 2 trạng thái, phía dưới ở trạng thái huyền phù, phía trên trong hơn, bề mặt môi trường không đóng váng, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 96 giờ nuôi cấy cho thấy SHX01 đạt mật độ ≥4,0 6 CFU/ml. + Chủng SHX 15 được tuyển chọn trên môi trường Gauze trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy 37 0 C. Sau 72-96 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc chủng SHX15 tròn, đường kính 2-2,2 mm, rìa ngoài mọc thành sợi, có mùi hắc, chân khuẩn lạc bám sâu, chặt vào môi trường. Khi được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể (Gauze), sau 72 giờ chủng SHX15 tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤1 mm, làm trong môi trường nuôi cấy, trên thành bình tạo vòng váng màu trắng và 3 bám chặt vào thành bình, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 72 giờ nuôi cấy cho thấy SHX15 đạt mật độ ≥8,10 8 CFU/ml. Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau 72-96 giờ chủng SHX15 phát triển làm môi trường dịch thể chia làm 2 trạng thái, phía dưới ở trạng thái huyền phù, phía trên trong hơn, bề mặt môi trường không đóng váng, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 96 giờ nuôi cấy cho thấy SHX15 đạt mật độ ≥ 10 6 CFU/ml. 3.1.3. Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất hydratcabon phù hợp với điều kiện vùng DHNTB Bảng 3: Các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV phân giải hydratcacbon Các yếu tố Chủng VSV SHX01 SHX15 SHX012 SHXDL47 pH 7,5 7,0 7,5 7,0 Nhiệt độ ( o C) 35±2 30±2 35±2 30±2 Thời gian nuôi cấy (giờ) 72 72 72 72 Nguồn C 20g/l 20g/l 20g/l 20g/l Nguồn N 5g/l 5g/l 5g/l 5g/l Lưu lượng không khí (dm 3 không khí/dm 3 môi trường/ phút) 0,75 0,75 0,75 0,75 Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy (vòng/phút) 350-400 350-400 350-400 350-400 3.2. Lựa chọn chủng giống VSV chuyển hóa hợp chất phosphat khó tan phù hợp với điều kiện vùng DHNTB 3.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng VSV Việc lựa chọn các chủng VSV chuyển hóa hợp chất photphat khó tan có hoạt tính sinh học cao và ổn định từ các mẫu đã phân lập phù hợp điều kiện vùng DHNTB cho kết quả. Bảng 4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV STT Kí hiệu chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 1 SHV7 Khuẩn lạc màu vàng nhạt, mép không gọn 2 SHV10 Khuẩn lạc màu vàng, mép tròn, gọn 3 SHV17 Khuẩn lạc màu trắng đục, nhỏ, mép không gọn Bảng 5: Hoạt tính sinh học của các chủng VSV Kí hiệu chủng Hoạt tính sinh học Phân giải Ca 3 (PO 4 ) 2 (D-d=mm) SHV7 24 SHV10 20 SHV17 21 Số liệu bảng 4, 5 cho thấy, đã lựa chọn được 3 mẫu VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất photphat khó tan với hoạt tính cao, ổn định và chủng VSV SHV7 có hoạt tính sinh học cao hơn chủng SHV10 và chủng SHV17. 3.2.2. Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất photphat khó tan phù hợp với điều kiện vùng DHNTB Dự án đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất photphat khó tan. Bảng 6: Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV phân giải photphat khó tan 4 Các yếu tố Chủng VSV SHV7 SHV10 SHV17 pH KCl 7,0 7,0 7,0 Nhiệt độ ( 0 C) 30 30 30 Thời gian nuôi cấy (giờ) 48 48 48 Nguồn C 20g/l 20g/l 20g/l Nguồn N 5g/l 5g/l 5g/l Lưu lượng không khí (dm 3 không khí/dm 3 môi trường/phút) 0,70-0,75 0,70-0,75 0,70-0,75 Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy (vòng/phút) 400 400 400 3.3. Lựa chọn chủng giống VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn phù hợp với điều kiện vùng DHNTB 3.3.1. Đặc điểm hình thái các chủng VSV đối kháng với VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn Dự án đã tiến hành tuyển chọn được 5 chủng VSV đối kháng vi sinh gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn phù hợp với vùng DHNTB. Bảng 7: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV STT Ký hiệu chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạctrên môi trường King B Hình dạng Kích cỡ Màu sắc 1 NA 1 Tròn, mép gấp nép Trung bình Trắng đục 2 SHB17 Bề mặt sần sùi, mép ko gọn Trung bình Trắng vàng 3 SHB18 Phẳng, nhẵn Trung bình Vàng 4 SHB19 Chảy Trung bình Vàng nhạt 5 SHB21 Tròn, dạng đa đặc Nhỏ Vàng Bảng 8. Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh R. solanacearum STT Vi khuẩn gây bệnh héo xanh Đường kính vòng ức chế tạo ra bởi các chủng vi khuẩn đối kháng trên thảm vi khuẩn gây bệnh chỉ thị (cm) NA1 SHB17 SHB18 SHB19 SHB21 1 BHT1 1,4 2,3 2,2 1,4 1,4 2 TT1 1,4 2,5 2,4 1,6 1,6 3 TH1 1,4 2,3 2,4 1,6 1,8 4 HTV2 1,6 2,6 2,2 1,6 1,4 5 SV2 1,4 2,2 2,4 1,4 1,6 3.3.2. Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn Tiến hành nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn cho kết quả. Bảng 9: Điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có khả năng chuyển hóa Các yếu tố Chủng VSV NA1 SHB17 SHB18 SHB19 SHB21 pH 7,5 7,0 7,0 7,0 7,0 Nhiệt độ ( 0 C) 30±2 30±2 30±2 30±2 30±2 Thời gian nuôi cấy (giờ) 48 48 48 48 48 Nguồn C 20g/l 20g/l 20g/l 20g/l 20g/l Nguồn N 5g/l 5g/l 5g/l 5g/l 5g/l 5 Lưu lượng không khí (dm 3 không khí/dm 3 môi trường/phút) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy (vòng/phút) 350-400 350-400 350-400 350-400 350-400 3.4. Lựa chọn bộ chủng giống VSV phù hợp với điều kiện vùng DHNTB 3.4.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng VSV được tuyển chọn Tiến hành tổ hợp các cặp đôi, cặp ba, cặp bốn, cặp năm, cặp sáu và chủng SHY06 đã lựa chọn ra được tổ hợp gồm 6 chủng VSV. Bảng 10: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV STT Ký hiệu chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Hình dạng Kích cỡ Màu sắc 1 SHX012 Tròn, bề mặt khô, nhăn, chân khuẩn lạc bám sâu vào môi trường thạch 2 - 2,5mm Trắng xám 2 SHXDL47 Tròn, bề mặt khô, nhăn, chân bám sâu vào môi trường 2,5 - 3mm Vàng đen 3 SHX01 Khuẩn lạc tròn, có mùi thơm ngái, chân bám sâu vào môi trường 2 - 2,5mm Trắng đục 4 SHB17 Khuẩn lạc không tròn đều, có mùi hôi. 1,5 - 2mm Vàng nhạt 5 SHV7 Khuẩn lạc tròn, nhăn, bề mặt khô 2,5 - 3mm Trắng vàng 6 SHY06 Tròn, lồi, trơn, có mùi thơm 1,5 - 2mm Trắng ngà Bảng 11: Hoạt tính sinh học của chủng VSV ((D-d) cm) TT Ký hiệu Đường kính vòng phân giải CMC Đường kính vòng phân giải tinh bột Đường kính vòng phân giải phosphat Đường kính vòng kháng VSV gây bệnh 1 SHX012 4,8 2,0 - - 2 SHXDL47 5,6 2,0 - - 3 SHX01 1,8 4,2 - - 4 SHB17 + + - 2,4 5 SHV7 - - 1,8 - 6 SHY06 2,7 3,6 - - Ghi chú: (+): có hoạt tính, (-): Không có hoạt tính 3.4.2. Các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của bộ chủng VSV phù hợp với điều kiện Vùng DHNTB Bảng 12: Điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có khả năng chuyển hóa Các yếu tố Chủng VSV SHX012 SHXDL47 SHX01 SHB17 SHV7 SHY06 pH 7,5 7,5 7,0 7,0 7,0 7,0 Nhiệt độ ( o C) 35±2 30±2 35±2 30±2 30±2 30±2 Thời gian nuôi cấy (giờ) 72 72 72 48 48 48 Nguồn C 20g/l 20g/l 20g/l 20g/l 20g/l 20g/l Nguồn N 5g/l 5g/l 5g/l 5g/l 5g/l 5g/l Lưu lượng không khí (dm 3 không khí/dm 3 môi trường/phút) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy (vòng/phút) 350-400 350-400 350-400 350-400 350-400 350-400 6 Trên cơ sở kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh khối của các chủng VSV và kế thừa các kết quả nghiên cứu đã được thực hiện trước đây, dự án đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm vật liệu che phủ đất. 3.5.Qui trình sản xuất chế phẩm VSV 3.5.1. Sơ đồ qui trình Các chủng giống gốc ở dạng ống thạch nghiêng bảo quản trong điều kiện lạnh hoặc chế phẩm gốc. Có thể cấy truyền giống gốc sang ống thạch nghiêng thứ cấp, song phải bảo đảm tuyệt đối mức độ thuần của chủng giống. 3.5.2. Nội dung quy trình 3.5.2.1. Chuẩn bị - Dụng cụ, thiết bị: Bên cạnh các thiết bị dụng cụ sử dụng cho phòng thí nghiệm VSV (thiết bị, dụng cụ khử trùng, thiết bị dụng cụ nuôi, cấy VSV và thiết bị dụng cụ phục vụ đánh giá kiểm tra VSV), để sản xuất sinh khối VSV cần hệ thống lên men (nồi lên men, thiết bị lên men xốp), thiết bị đóng gói và bảo quản chế phẩm VSV. - Hoá chất, vật tư: + Môi trường nhân sinh khối các VSV + Môi trường kiểm tra hoạt tính các vi sinh + Cơ chất sử dụng cho sản xuất chế phẩm VSV có thành phần chủ yếu là cám gạo đã nghiền mịn, khô (độ ẩm <12%) được sản xuất từ thóc mới và than bùn không bị nhiễm nấm mốc, tốt nhất đã được khử trùng + Dinh dưỡng là các nguồn cung cấp năng lượng (đường, mật rỉ…), cung cấp N (hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ) và một số hoạt chất kích thích sự sinh trưởng, phát triển của VSV. + Thành phần nguyên liệu của cơ chất xốp được phối trộn với nhau theo tỷ lệ 90% than bùn, 9% cám gạo và 1% rỉ mật - Khử trùng + Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong sản xuất phải tiệt trùng bằng một trong các phương pháp: Trong tủ sấy ở nhiệt độ từ 170 o C đến 180 o C, không ít hơn 1 giờ; Trong nồi hấp áp lực 1 at (121 0 C), không ít hơn 15 phút. 7 Vi khuẩn PG Xenlulose Vi khuẩn PG Lân Nấm men phân giải protein Kiểm tra hoạt tính các chủng VSV Giống gốc chủng 1 Giống gốc chủng 2 Giống gốc chủng 3 Lên men cấp 1, 2. Sinh khối cấp 2 chủng 1 Sinh khối cấp 2 chủng 2 Sinh khối cấp 2 chủng 3 Lên men bề mặt với cơ chất xốp khử trùng hoặc không khử trùng Chế phẩm VSV + Các loại môi trường được pha chế theo thứ tự các hoá chất trong thành phần đã cho. Sau đó phân phối vào các dụng cụ thuỷ tinh hoặc nồi lên men đã chuẩn bị trước và đưa đi khử trùng dưới áp lực 1 at (121 0 C) không ít hơn 30 phút. + Cơ chất xốp dùng cho sản xuất chế phẩm là than bùn được khử trùng bằng hơi nước bão hoà trong thời gian 1 giờ. 5.5.2.2. Các bước tiến hành BƯỚC 1. Kiểm tra đánh giá hoạt tính VSV Để đảm bảo chất lượng chế phẩm, trước mỗi đợt sản xuất, hoạt tính sinh học của các chủng VSV cần được kiểm tra đánh giá. BƯỚC2. Nhân sinh khối cấp I - Môi trường lên men cấp 1 được pha chế theo đúng thành phần đã hướng dẫn cho từng loại chủng giống. Hoà tan thành phần môi trường trong nước ấm, điều chỉnh pH cho phù hợp với yêu cầu từng loại. Phân chia môi trường vào các bình tam giác. Làm nút bông, bọc giấy sạch và khử trùng bằng hơi nước bão hoà (nồi hấp khử trùng) trong thời gian 20 phút (chú ý với môi trường có hàm lượng đường cao thời gian khử trùng không quá 15 phút). - Có thể cấy giống trực tiếp từ ống giống gốc vào các bình tam giác môi trường đã chuẩn bị sẵn, mỗi bình tam giác 1 vòng que cấy đầy. Tuy nhiên với cách cấy này cần thiết phải lên men cấp 1 trong thời gian dài hơn. Cách tốt nhất là chuẩn bị giống thứ cấp trước 48-36 giờ và sau đó cấy trực tiếp từ ống giống thứ cấp. Mỗi bình tam giác cần sử dụng 1 ống giống. Khử trùng miệng ống giống và miệng bình môi trường. Từ bình tam giác lấy một ít môi trường cho vào ống giống, sao cho lượng dịch lỏng phủ hết bề mặt lớp thạch nghiềng. Dùng que gạt gạt hết sinh khối VSV trên bề mặt thạch. Lắc đều và đổ trở lại vào bình tam giác (các thao tác phải bảo đảm vô trùng tuyệt đối). C€ng có thể nuôi cấy vi sinh trong các ống nghiệm chứa môi trường lỏng trước 48-36 giờ sau đó sử dụng sinh khối này làm giống gốc. - Sau khi cấy giống các bình tam giác được đưa lên giàn máy lắc, tốc độ lắc 150-200 vòng/phút. Trong điều kiện 30-40 0 sinh khối VSV đảm bảo yêu cầu sau 48-96 giờ tùy yêu cầu của từng chủng VSV. BƯỚC 3. Nhân giống cấp II - Chuẩn bị môi trường lên men: tương tự như chuẩn bị môi trường cho quá trình lên men cấp I, tuy nhiên lượng môi trường lên men có số lượng lớn sau đó cho vào các thùng lên men và đặt chế độ khử trùng tự động trong thời gian 30 phút. Làm nguội môi trường đến 45 0 C÷50 0 C. - Cấy truyền từ giống cấp 1 sang nồi lên men, lượng dịch cấp 1 cần thiết cho quá trình lên men cấp 2 là 5,0-10,0% so với lượng môi trường. Dùng đuốc, đền cồn cháy to hoặc đèn gas khử trùng miệng bình tam giác và nồi lên men. Chuyển sinh khối trong bình tam giác vào nồi lên men. Chú ý thao tác nhanh dưới đèn khử trùng. Khử trùng bề mặt các điểm nối dây dẫn khí và lắp đặt hệ thống cấp khí. Chú ý kiểm tra độ an toàn của dây dẫn và nồi lên men trước khi khởi động máy nén (hệ thống dây dẫn, bộ lọc khí và các nắp đậy nồi lên men phải được khử trùng và kiểm tra độ vô trùng trước khi sử dụng). - Nhân sinh khối cấp 2 ở điều kiện phù hợp với nhu cầu sinh trưởng phát triển của từng chủng VSV thông qua việc điều chỉnh các thông số kỹ thuật của hệ thống lên men. Thời gian lên men là 24-36 giờ. Trong suốt quá trình nhân sinh khối cần tiến hành kiểm tra độ thuần và mật độ các VSV theo phương pháp được trình bày chi tiết trong chuyên đề kiểm tra đánh giá chất lượng chế phẩm VSV. Mật độ VSV đảm bảo khi đạt >10 8 VSV/ml dịch lên men . BƯỚC4. Sản xuất chế phẩm VSV - Hỗn hợp cơ chất xốp và chất dinh dưỡng sau khi khử trùng được phối trộn với sinh khối VSV từ các quá trình nhân sinh khối cấp 2 và đưa vào các khay lên men (có thể sử dụng túi bóng đen). Thành phần chính của cơ chất xốp được sử dụng trong sản xuất chế phẩm là cám 8 gạo, than bùn với tỷ lệ 9:1 được phơi khô nghiền mịn (kích thước hạt < 0,5mm), xử lý loại bỏ tạp nhiễm VSV và trung hoà bằng bột nhẹ sao cho pH đạt 6,8-7,0. Độ ẩm cơ chất xốp không vượt quá 15%. Để đảm bảo điều kiện dinh dưỡng và môi trường sống tối ưu cho VSV. - Bổ sung sinh khối VSV sau quá trình lên men với tỷ lệ các chủng VSV là 1:1:1, liều lượng hỗn hợp VSV bổ sung vào so với cơ chất xốp là 10-20%. Sau 3 ngày lên men tiến hành đảo trộn và tiếp tục để VSV phát triển trong khoảng 3 ngày tiếp theo. - Sản phẩm được coi là đảm bảo chất lượng khi VSV phát triển đều khắp, tạo màu trắng cho cả khối cơ chất. Hỗn hợp sau khi lên men được sấy ở nhiệt độ không quá 40 o C để đảm bảo độ ẩm cuối cùng đạt 15-20%. Trong trường hợp sản xuất chế phẩm trên nền chất mang khử trùng, tất cả các công đoạn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng. Trước khi đóng bao gói, hỗn hợp cần được được kiểm tra mật độ các chủng VSV. Sản phẩm đảm bảo chất lượng khi mật độ mỗi nhóm VSV chứa trong chế phẩm đạt >10 8 VSV/g. BƯỚC 5. Kiểm tra chất lượng chế phẩm Chất lượng chế phẩm VSV được kiểm tra theo các tiêu chuẩn TCVN 6167:1996 về VSV phân giải lân, TCVN 6168:2002 về VSV phân giải xenlulo, TCVN 9300:2012 về VSV đối kháng VSV gây bệnh 3.6. Điều kiện bảo quản chế phẩm và tiêu chuẩn cơ sở về chất lượng chế phẩm Chế phẩm vi sinh sau khi sản xuất được đóng gói và bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ thường, tiến hành kiểm tra thường xuyên mật độ để đánh giá chất lượng của chế phẩm. Bảng 13: Mật độ của chế phẩm tại các thời điểm bảo quản khác nhau Chủng VSV Mật độ tế bào (CFU/ml) 0h 1 tháng 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng SHB17 3,44x10 5 2,34x10 9 3,06x10 8 3,74x10 8 4,12x10 7 4,2x10 7 3,32x10 6 SHV7 4,12x10 6 4,24x10 9 4,12x10 8 4,26x10 8 3,28x10 7 3,8x10 7 2,28x10 6 SHX012 5,26x10 5 3,44x10 8 5,24x10 8 5,38x10 8 4,16x10 7 4,6x10 7 2,16x10 6 SHXDL47 4,32x10 5 4,52x10 8 6,18x10 9 6,34x10 8 5,44x10 8 5,04x10 7 1,44x10 6 SHX01 5,46x10 5 4,36x10 8 4,62x10 8 5,34x10 8 5,42x10 8 5,2x10 7 2,42x10 6 SHY06 3,56x10 5 4,68x10 9 4,06x10 9 4,12x10 8 4,34x10 7 4,16x10 7 4,06x10 9 Bảng 14: Hoạt tính của các chủng trong chế phẩm sau thời gian bảo quản Chủng VSV Hoạt tính (mm) 0h 1 tháng 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng SHB17 24 26 25 24 22 20 17 SHV7 22 23 22 22 20 18 15 SHX012 30 32 31 31 30 28 25 SHXDL47 32 33 32 32 30 28 25 SHX01 29 30 30 30 28 27 25 SHY06 ++ +++ +++ +++ ++ ++ + Kết quả bảng 13, 14 cho thấy chế phẩm sản xuất và bảo quản sử dụng tốt nhất sau 3 tháng. Với các kết quả đạt được chế phẩm xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm vật liệu che phủ đất sản xuất tại vùng DHNTB đã được công bố tiêu chuẩn cơ sở về chất lượng. Sản phẩm được sản xuất tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp DHNTB và Công ty cổ phần Phân bón và Dịch vụ tổng hợp Bình Định có tên thương mại DHSH-01. A/ Yêu cầu kĩ thuật Yêu cầu về nguyên liệu chính - Môi trường nuôi cấy VSV: Than bùn, cám gạo, rỉ mật - Các chủng VSV (Bacillus, Strepmomyces, Saccharomyces) 9 - Các enzym thủy phân (xenlluloza, proteaza, phytaza) Yêu cầu đối với sản phẩm Sản phẩm chế phẩm vi sinh xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp có các chỉ tiêu và mức chất lượng theo quy định sau: Tên chỉ tiêu Mức chất lượng 1.Ngoại quan Tơi xốp, không vón cục, màu nâu nhạt hoặc trắng xám 2.VSV(CFU/g): - Bacillus không nhỏ hơn - Strepmomyces không nhỏ hơn - Saccharomyces không nhỏ hơn 10 7 10 7 10 7 3.Các enzim thủy phân: Xenluloaza (D-d, cm) Không nhỏ hơn Proteaza (D-d, cm) Không nhỏ hơn Phytaza (D-d, cm) Không nhỏ hơn 3,0 2,5 2,0 4. Khối lượng đóng gói: Gram Gram Gram 1.000 2.000 5.000 B/ Phương pháp thử Ngoại quan: Dùng mắt và tay để kiểm tra dạng và màu sắc của sản phẩm - Xác định thành phần và số lượng các nhóm VSV theo phương pháp cấy pha loãng trên môi trường thạch đĩa (Koch) - Nhận biết Bacillus bằng kĩ thuật soi kính hiển vi, hoặc nhận dạng khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa, hoặc bằng kĩ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16s ARN reboxom - Nhận biết Strepmomyces bằng kĩ thuật soi kính hiển vi hoặc nhận dạng khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa, hoặc bằng kĩ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16s ARN reboxom - Nhận biết Saccharomyces bằng kĩ thuật soi kính hiển vi hoặc nhận dạng khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa, hoặc bằng kĩ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16s ARN reboxom - Xác định hoạt lực enzym ngoại bào bằng phương pháp khuyêch tán trên thạch C/ Khối lượng đóng gói theo quy định hiện hành - Bao gói: Sản phẩm được đóng trong túi PE hoặc bao gói theo yêu cầu của khách hàng. - Ghi nhãn: Sản phẩm có nhãn ghi với nội dung sau - Tên cơ sở - Các chỉ tiêu, mức chất lượng chính: - Địa chỉ - Ngày, tháng, năm sản xuất: - Tên sản phẩm - Thời hạn sử dụng - Thành phần - Khối lượng tịnh - Công dụng - Sản xuất theo TCCS - Hướng dẫn sử dụng Tiến hành lấy mẫu chế phẩm VSV và kiểm tra chất lượng của sản phẩm sau khi sản xuất, kết quả cho thấy sản phẩm sản xuất đảm bảo được tiêu chuẩn Việt Nam. Bảng 15: Chất lượng chế phẩm VSV sản xuất tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp DHNTB và Công ty cổ phần Phân bón và Dịch vụ tổng hợp Bình Định Loại VSV Đơn vị đo Chất lượng Xạ khuẩn chuyển hóa hyratcacbon CFU/g 5,1 x 10 8 VSV phân giải lân CFU/g 4,3 x 10 9 VSV đối kháng VSV gây bệnh CFU/g 7,8 x 10 9 10 [...]... 06 chủng VSV làm cơ sở tiến hành sản xuất chế phẩm VSV xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm vật liệu che phủ đất là SHX012, SHXDL47, SHX01, SHB17, SHV7, SHY06 - Hoàn thiện quy trình sử dụng chất che phủ hữu cơ sinh học và kiểm tra, đánh giá chất lượng chất che phủ hữu cơ sinh học - Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm vật liệu che phủ đất với đầy đủ... Văn Hưng, Phạm Văn Toản (2003): Công nghệ vi sinh vật trong nông nghiệp và xử ly môi trường Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội 6 Phạm Văn Toản (2002): Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm VSV chuyển hoá nguyên liệu, phế thải giàu hợp chất cacbon (Compost maker) làm phân bón hữu cơ sinh học Báo cáo hội nghị KH chuyên ngành đất, phân bón và hệ thống nông nghiệp - Bộ NN&PTNT, Nha Trang 8/2004 7 Phạm Văn... bảo quản chế phẩm, sử dụng tốt nhất sau 3 tháng bảo quản, phương pháp kiểm tra và xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở về chất lượng chế phẩm - Sản xuất thành công 15 tấn chế phẩm sinh học DHSH01 an toàn đối với môi trường và sức khỏe người, vật nuôi, mật độ VSV hữu ích đạt ≥ 108 CFU/g TÀI LIÊU THAM KHẢO 1 Nguyễn Lân Dũng (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, 2, 3, Nhà xuất bản Khoa...3.7 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học DHSH-01, cơ chất hữu cơ làm chất che phủ hữu cơ sinh học và hiệu chỉnh quy trình kỹ thuật Năm 2012, dự án đã triển khai sản xuất thành công 15 tấn chế phẩm DHSH-01 đảm bảo theo TCVN 7168, phù hợp với điều kiện vùng DHNTB tại Công ty cổ phần Phân bón và Dịch vụ tổng hợp Bình Định Với giá bán 100.000.000 VNĐ/tấn,... cáo tổng kết đề tài KC.04.04: Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân bón vi sinh vật đa chủng, phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái 8 Uta Krogman (1994): Neueste Erkenntnisse ueber die Grundlagen der Kompostierung, Abfallwirtschaft 4/94, 13-21 9 TCVN 6168-2002: Chế phẩm vi sinh vật phân giải xenlulo 10 TCVN 6167:1996: Phân vi sinh vật phân giải lân Người phản biện: TS Nguyễn... ty cổ phần Phân bón và Dịch vụ tổng hợp Bình Định Với giá bán 100.000.000 VNĐ/tấn, tổng doanh thu đạt 1.500.000.000 VNĐ, tổng chi phí cho sản xuất là 1.133.155.000 VNĐ, như vậy lãi thuần đạt được từ sản xuât 15 tấn chế phẩm DHSH-01 là 366.845.000 VNĐ V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - Lựa chọn được 04 chủng VSV chuyển hóa hợp chất hữu cơ giàu hydratcacbon phù hợp với điều kiện vùng DHNTB là SHX01, SHX15, SHX012,... nông nghiệp 2 Coughlan, M and Mayer F (1998): Cellulose decomposing bacteria and their enzyme system ,The procayotes, chapter 20, 460-502 3 Demain A.L and Soloman N.A (1986): Manual of industrial microbiology and biotechnology, 32-39, Ameriacan Society for microbiology, Washington D.C 4 Gaur.A.C (1992): Manure and organic matter 5 Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản (2003): Công nghệ vi sinh . BÁO CÁO MỘT SỐ KẾT QUẢ DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP LÀM VẬT LIỆU CHE PHỦ ĐẤT REPORT RESULTS THE TRIAL. xuất nông nghiệp và một số ngành sản xuất công nghiệp làm phân bón hữu cơ sinh học và làm nguyên liệu sản xuất cơ chất hữu cơ vi sinh. Công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đã được hoàn thiện và ứng dụng. thấy chế phẩm sản xuất và bảo quản sử dụng tốt nhất sau 3 tháng. Với các kết quả đạt được chế phẩm xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm vật liệu che phủ đất sản xuất tại vùng DHNTB đã được công