  i  TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Nguyễn Thị Thu Hƣơng NGHI£N CøU TINH S¹CH Vµ X¸C §ÞNH TIÒM N¡NG CHèNG UNG TH¦ CñA PIPERINE Tõ Hå TI£U §EN (PIPER NIGRUM L.)   2013   ii  TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Nguyễn Thị Thu Hƣơng NGHI£N CøU TINH S¹CH Vµ X¸C §ÞNH TIÒM N¡NG CHèNG UNG TH¦ CñA PIPERINE Tõ Hå TI£U §EN (PIPER NIGRUM L.)     - 2013   iii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, người thầy đã tận tình hướng dẫn và khích lệ tinh thần giúp tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Thị Lương Hằng và TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, những nhà khoa học đã tạo điều kiện tốt nhất,giúp tôi giải đáp những thắc mắc trong thời gian tiến hành luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Trần Thị Thùy Anh, ThS. Ngô Thị Trang và ThS. Bùi Thị Vân Khánh, những cán bộ nghiên cứu đã giành nhiều thời gian và tâm huyết trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệm. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn Di truyền, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành nghiên cứu. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các anh chị, các bạn, các em trong các phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Di truyền học, Bộ môn Sinh lý thực vật - Hóa sinh và Bộ môn Sinh học tế bào đã nhiệt tình chỉ bảo, chia sẻ kinh nghiệm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình cùng những người bạn đã hết lòng ủng hộ, cổ vũ và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như cuộc sống, giúp tôi yên tâm hoàn thành công việc. Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2013. Nguyễn Thị Thu Hương   iv DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Viết đầy đủ ATCC American Type Culture Collection CDK Cyclin dependent kinase CTHH Công thc hóa h CTPT Công thc phân t DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium FBS Fetal bovine serum   HPLC High performance liquid chromatography -  IGF - 1 Insulin like Grow Factor-1 -  IPA Isopropyl alcohol LCMS Liquid chromatography mass spectrometry   N-hex N-hexane MCf  7 Michigan Cancer Foundation - 7 MTT (3(4,5-dimethylthiazol2yl) 5 (3  carbocymethoxyphenyl)  2 (4 -sulfophenyl) 2H tetrazolium) PBS Phosphate buffered saline Ppm Parts per million Rf Retardation factor -  RPMI Roswell park memorial institute medium TLC Thin layer chromatography - S ký b mng UV Ultraviolet - Tia cc tím   v DANH MỤC HÌNH  4  7 Hình 3. Henrietta Lacks và  11 -7 [38] 12  13  15  16  [23] 21  22  24  27  32  - 7  39   40  42  : n-hexane : ethyl acetate (trái )và n - hexane : ethyl  43 n - hexane : ethyl acetate (trái) hexane :          44 n-hexane : ethyl acetate  45  46   48   49   vi  50   53 Hình   54 Piperine 2 (P2) 55   57  57 -  58   µg/ml b) 10 µg/ml c) 1 µg/ml 59   µg/ml; b) 10 µg/ml; c) 1 µg/ml 59   100 µg/ml b) 10 µg/ml c) 1 µg/ml 60 -   60  - 7 61  64   65   65   66 Hìn  67   vii DANH MỤC BẢNG  1. Danh sách  29  41   47   51  52  56   7 62  50  7 62   67  50  68   viii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Khái quát về ung thƣ 3 1.1.1  3 1.1.2  4 1.1.3  8 1.1.4  11 1.1.4.1 Hela 11 1.1.4.2 -7 12 1.2 Hồ tiêu (Piper nigrum L.) và Piperine 12 1.2.1  12 1.2.1.1  12 1.2.1.2  14 1.2.1.3  14 1.2.2 Piperine 15 1.2.2.1  15 1.2.2.2   17 1.2.2.3  18 1.3 Kỹ thuật tinh sạch hợp chất và thử độc tính trên tế bào 20 1.3.1  20 1.3.1.1  Thin Layer Chromatography) 20 1.3.1.2  22 1.3.1.3  22 1.3.2  25 1.3.2.1  25 1.3.2.2  25 1.3.2.3  26 1.3.3  27   ix CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 29 2.2 Hóa chất, thiết bị và sinh phẩm 29 2.2.1  29 2.2.2  30 2.2.3  30 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.3.1  30 2.3.2  32 2.3.3  33 2.3.4   34 2.3.4.1  34 2.3.4.2  36 2.3.5  37 2.3.5.1  37 2.3.5.2  38 2.3.6 và MCF  7 38 2.3.6.1  7 39 2.3.6.2  40 CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Kết quả tinh sạch Piperine từ Hồ tiêu đen 41 3.1.1  41 3.1.2  42 3.1.3  45 3.1.4   47 3.1.4.1   47   x 3.1.4.2  52 3.2 Kết quả nghiên cứu mức độ tác động của Piperine trên một số dòng tế bào ung thƣ 56 3.2.1  7 56 3.2.2  MCF  7 57 3.2.3  . 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 [...]... bào ung thư khác nhau Dựa trên mục đích và tiềm năng, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu tinh sạch và xác định tiềm năng chống ung thƣ của Piperine từ Hồ tiêu đen (Piper nigrum L ) Mục tiêu của đề tài l tinh sạch hợp chất Piperine từ cây Hồ tiêu đen, thử hoạt tính trên một số dòng tế bào ung thư, xác định mức độ tác động của hợp chất l n sự phát triển của tế bào, từ đó bước đầu đánh giá tiềm năng. .. Piperine từ Hồ tiêu Addison Ault đã tinh sạch thành công Piperine với hàm l ợng khoảng 3.4% bằng dung môi IPA (isopropyl alcohol) có bổ sung thêm bột calcium carbonate (CaCO 3) [10] Với dung môi ethanol 95%, Raphael Ikan (199 1) đã phân l p được Piperine dưới dạng tinh thể màu vàng [32] Một giải pháp khác được thực hiện bởi William W Epstein, David F Netz và Jimmy L Seidel (200 3) l sử dụng dung môi dichloromethane... Orsted l người đầu tiên phát hiện và tinh sạch Piperine từ quả Hồ tiêu Piper nigrum L vào năm 1819 Piperine l một loại alkaloid có trong quả của Piper longum L. ; Piper retrofractum Vahl.; Piper clusii C.D.C và từ vỏ rễ của cây Piper geniculatum Sw thuộc họ Piperaceae (Hình 6) Hình 6 Cấu trúc hóa học của Piperine [31] CTPT: C17H19 NO3 Tên IUPAC: 1–[5–(1,3-Benzodioxol-5- yl)-1-oxo-2,4-pentadienyl] piperidine... Dạng ung thư phổ biến nhất ở nam giới l ung thư tiền liệt tuyến, ở nữ giới l ung thư vú Dạng ung thư phổ biến nhất ở cả hai giới l ung thư phổi [29] Hình 1 Quá trình phát sinh và di căn ung thƣ [31] Dựa vào nguồn gốc phát sinh của ung thư, người ta chia ung thư ra thành 3 loại: Ung thư phát sinh do các đột biến tự phát trong các tế bào soma, ung thư phát sinh từ các đột biến tế bào mầm sinh dục và ung. .. MCF – 7 l dòng tế bào được tách từ khối u của bệnh nhân ung thư vú Hiện nay dòng MCF – 7 l một trong những dòng tế bào được sử dụng phổ biến trong việc thử độc tính của các hoạt chất sinh học l n tế bào ung thư [28, 53] Thời gian nhân đôi của dòng MCF – 7 l 24.5 giờ (Hình 4) Hình 4 Dòng tế bào ung thƣ vú MCF-7 [38] 1.2 Hồ tiêu (Piper nigrum L. ) và Piperine 1.2.1 Hồ tiêu (Piper nigrum L. ) 1.2.1.1... Hồ tiêu còn gọi l cổ nguyệt, hắc cổ nguyệt, bạch cổ nguyệt, tên khoa học l Piper nigrum L. , l một loài cây leo có hoa thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae), trồng 12 Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hương chủ yếu để l y quả và hạt (Hình 5) Hồ tiêu có thân dạng dây leo, nhẵn, không mang l ng, bám vào các cây khác bằng rễ Thân mọc cuốn, mang l mọc cách L như l trầu không, nhưng dài và thuôn hơn Có hai loại... trong và ngoài nước chú trọng nghiên cứu 10 Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hương 1.1.4 Một số dòng tế bào ung thư dùng trong nghiên cứu 1.1.4.1 Dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela Ung thư cổ tử cung l bệnh hay gặp chiếm tỷ l cao trong tổng số các bệnh ung thư (11% trong tổng số ung thư cả hai giới và 22.35% trong ung thư sinh dục n ) Tuổi thư ng gặp l 30 - 59, đỉnh cao l 45 - 50, tuy nhiên vẫn có... việc sàng l c thuốc mới l rất l n [32] Điều đó cho thấy tiềm năng khai thác dược phẩm của Việt Nam, một trong những nước nhiệt đới có mức độ đa đạng thực vật cao, l rất khả quan Hồ tiêu đen (Piper nigrum L. ) l một loài thực vật nhiệt đới được trồng rộng rãi ở Việt Nam với thành phần chính l Piperine Trên thế giới đã có nhiều đề tài nghiên cứu về tác động của Hồ tiêu đen nói chung và Piperine nói... 95% l ung thư thượng bì gai, 5 - 10% còn l i l ung thư thượng bì tuyến Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu l do nhiễm khuẩn sinh dục, đặc biệt l virus Hepes type II (HVII) và Papiloma virus 16 - 18 và 3 - 33 Bệnh l y qua đường tình dục ở l a tuổi 18 - 30, đặc biệt l l c có thai [4] Hình 3 Henrietta Lacks và dòng tế bào Hela [4] Dòng tế bào Hela l dòng tế bào được nuôi cấy từ các tế bào khối u cổ tử cung... tính của Piperine với các dòng tế bào ung thư khác nhau và thu được nhiều kết quả khả quan Phương pháp thử độc tính được sử dụng rộng rãi nhất đó l sử dụng chất thử 3 – (4, 5 - dimethylthiazol – 2 – yl) – 2, 5 dyphenyl – tetrazolium bromide (MTT) Daniel và cộng sự (200 5) đã sử dụng phương pháp MTT khi nghiên cứu về độc tính của Piperine trên dòng tế bào ung thư phổi B16F – 10 và 2 dòng tế bào ung thư .   Nghiên cứu tinh sạch và xác định tiềm năng chống ung thƣ của Piperine từ Hồ tiêu đen (Piper nigrum L. )  tiêu  l ti  Piperine . Foundation - 7 MTT (3(4,5-dimethylthiazol2yl) 5 (3  carbocymethoxyphenyl)  2 (4 -sulfophenyl) 2H tetrazolium) PBS Phosphate buffered saline Ppm Parts per million Rf Retardation factor.  µg/ml b) 10 µg/ml c) 1 µg/ml 59   µg/ml; b) 10 µg/ml; c) 1 µg/ml 59 