ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HOÀNG YẾN ÁP DỤNG HÌNH THÁI HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC – VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HỒNG YẾN ÁP DỤNG HÌNH THÁI HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC – VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số : 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THU HƢƠNG PGS TS NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN Hà Nội, 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc khóa luận cao học này, tơi nhận đƣợc nhiều giúp đỡ cá nhân, tổ chức Tôi xin chân thành cảm ơn: Các thầy/cô Phịng Sau đại học Bộ mơn Di truyền học - khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN Ban giám đốc Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng, Khoa Dịch tễ Sốt rét tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân TS Nguyễn Thu Hƣơng - hai ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS TS Trịnh Đình Đạt, PGS TS Lê Thanh Hịa, TS Nguyễn Thị Hƣơng Bình, TS Nguyễn Thị Hồng Ngọc, TS Trƣơng Văn Hạnh, TS Lê Xuân Hợi anh/chị em Khoa Ký sinh trùng, Khoa Sinh học phân tử, Khoa Dịch tễ sốt rét giúp đỡ tơi q trình thực đề tài nhƣ đóng góp ý kiến quý báu cho luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn bạn lớp cao học K21 Sinh học, bạn bè, đồng nghiệp gia đình giúp đỡ, động viên chia sẻ vui buồn với suốt thời gian qua Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Hoàng Yến i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nhiễm sán gan lớn ngƣời động vật 1.1.1 Bệnh sán gan lớn giới 1.1.2 Bệnh sán gan lớn Việt Nam 1.2 Đặc điểm sinh học sán gan lớn 1.2.1 Phân loại sinh học 1.2.2 Hình thể sán trƣởng thành 1.2.3 Hình thể trứng 1.3 Chu kỳ phát triển sán gan lớn 1.4 Các vật chủ sán gan lớn 11 1.4.1 Vật chủ 11 1.4.2 Vật chủ trung gian 11 1.4.3 Vật chủ tình cờ 12 1.5 Các yếu tố nguy bệnh sán gan lớn 12 1.5.1 Thói quen ăn uống 12 1.5.2 Môi trƣờng 13 1.5.3 Tuổi giới 13 1.6 Đặc điểm bệnh sán gan lớn 14 1.6.1 Đặc điểm lâm sàng 14 1.6.2 Đặc điểm cận lâm sàng 14 1.7 Tính đa dạng di truyền Fasciola spp 16 1.7.1 Các yếu tố tác động đến đa dạng di truyền Fasciola spp 16 1.7.2 Vai trò việc xác định lồi phân tích đa hình sán gan lớn 17 1.8 Các phƣơng pháp xác định loài sán gan lớn 18 1.8.1 Phƣơng pháp hình thái 18 1.8.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 19 ii 1.9 Thuốc điều trị sán gan lớn Việt Nam 23 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tƣợng, địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị chung 25 2.3 Hóa chất 27 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 28 2.4.2 Cỡ mẫu phân tích 29 2.4.3 Phƣơng pháp xác định kích thƣớc số hình thái 29 2.4.4 Các phƣơng pháp định loài kỹ thuật sinh học phân tử 31 2.5 Xử lý số liệu nghiên cứu 33 2.6 Đạo đức nghiên cứu 33 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 34 3.1 Kết hình thái sán gan lớn địa điểm nghiên cứu 34 3.1.1 Kích thƣớc sán gan lớn động vật 34 3.1.2 Các số trứng SLGL thu đƣợc động vật (vật kính 40x) 42 3.2 Kết định loại phƣơng pháp sinh học phân tử 44 3.2.1 Kết nhân đoạn gen ITS-2 kỹ thuật PCR 44 3.2.2 Kết PCR - RFLP 45 3.2.3 Kết so sánh sai khác, tỷ lệ tƣơng đồng trình tự ITS-2 49 3.2.4 Kết mối tƣơng quan phả hệ 58 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC iii CHỮ VIẾT TẮT ADN : Axit deoxyribonucleic ARN : Axit ribonucleic Atp8 : Gen mã hóa adenosine triphosphatase BL : Body length (chiều dài thể) bp : Base pair (cặp bazơ) BR : Body roundness (chu vi thể) BW : Body width (chiều rộng thể) Buffer : Dung dịch đệm CL : Cone length (Chiều dài đầu sán) CS : Cộng CW : Cone width (chiều rộng đầu sán) COX : Cytochrome oxidase COB : Cytochrome oxidase b CT : Côn trùng dATP : Deoxy adenosine triphosphate dCTP : Deoxy cytosine triphosphate dGTP : Deoxy guanidine triphosphate dTTP : Deoxy thymidine triphosphate dNTP : Deoxy nucleotide triphosphate FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức lƣơng thực nông nghiệp Liên Hiệp quốc) GOT : Glutamic oxaloacetic transaminase GPT : Glutamic pyruvic transaminase ITS : Internal Transcribed Spacer (đoạn giao gen) KST : Ký sinh trùng Marker : Thang đo trọng lƣợng phân tử NAD : Nicotinamide dehydrogenase subunit iv NA : Nghệ An OS : Oral sucker (giác miệng) PBS : Phosphate buffered saline (dung dịch đệm) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi Polymerase) RFLP : Restriction fragment length polymorphism (đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) Primer : Mồi SLG : Sán gan SLGL : Sán gan lớn TL : Taking both testes together length (độ dài tinh hoàn) TW : Testicular space width (độ rộng tinh hoàn) TBE : Tris Boric acid VCTG : Vật chủ trung gian VS : Ventral sucker (giác bụng) VS-P : Khoảng cách giác miệng điểm cuối thân Vit-P : Khoảng cách từ cuối tuyến hoàng thể đến cuối thân WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tỷ lệ nhiễm SLGL trâu/bò huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam [13] Bảng 2.1 Kết dự đoán sản phẩm ADN kỹ thuật PCR PCR - RFLP 33 Bảng 3.1 Kích thƣớc chiều dài chiều rộng sán gan lớn 34 Bảng 3.2 Tỷ lệ chiều dài chiều rộng sán gan lớn 35 Bảng 3.3 Chu vi giác bụng giác miệng 36 Bảng 3.4 Kích thƣớc chiều rộng cổ chiều dài đầu sán 37 Bảng 3.5 Kích thƣớc khoảng rộng dài tinh hồn 37 Bảng 3.6 Kích thƣớc đoạn từ giác bụng đến cuối thân đoạn từ giao điểm tuyến hoàng thể đến cuối thân 38 Bảng 3.7 Sự phù hợp loài sán theo số BL/BW VS-P 39 Bảng 3.8 Các số kích thƣớc trứng thu động vật 42 Bảng 3.9 Tỷ lệ chiều dài chiều rộng trứng sán gan lớn thu động vật 43 Bảng 3.10 Vị trí biến đổi nucleotide vùng gen ITS-2 mẫu sán [11] 56 Bảng 3.11 Sự sai khác mức độ tƣơng đồng nucleotide mẫu SLGL điểm nghiên cứu với F gigantica Niger 57 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thể sán gan lớn trƣởng thành Hình 1.2 Cấu tạo quan sán gan lớn Hình 1.3 Hình thể trứng sán gan lớn Hình 1.4 Chu kỳ phát triển sán gan lớn 11 Hình 1.5 Tổn thƣơng gan sán gan lớn siêu âm 15 Hình 1.6 Mơ hình cấu trúc ribosome ADN gen nhân [17] 20 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 28 Hình 2.2 Các số sán gan lớn trƣởng thành [51] 30 Hình 3.1 So sánh tỷ lệ BL/BW sán gan lớn tỉnh miền Bắc 35 Hình 3.2 So sánh tỷ lệ VS-P sán gan lớn tỉnh miền Bắc 38 Hình 3.3 So sánh phù hợp loài sán theo tỷ lệ (%) BL/BW VS-P 39 Hình 3.4 Một số hình ảnh sán gan lớn 41 Hình 3.5 Hình thể kích thƣớc mẫu SLGL số điểm nghiên cứu 41 Hình 3.6 Một số hình ảnh trứng sán gan lớn Ảnh chụp vật kính 40x (hình a, b) vật kính 10x (hình c, d), thƣớc đo = 10 µm 42 Hình 3.7 So sánh tỷ lệ chiều dài/chiều rộng trứng SLGL thu động vật 43 Hình 3.8 Kết nhân gen mẫu SLGL phản ứng PCR 45 Hình 3.9 Sản phẩm PCR-RFLP mẫu sán cho kết F gigantica 45 Hình 3.10 Trình tự đoạn ADN thu đƣợc với trình tự mồi BD1 mẫu trứng BGS1 46 Hình 3.11 Sản phẩm PCR-RFLP mẫu sán cho kết F hepatica (mẫu THT2) 46 Hình 3.12 Trình tự đoạn ADN thu đƣợc với trình tự mồi BD1 mẫu trứng THT2 47 Hình 3.13 Sản phẩm PCR-RFLP mẫu sán cho kết F gigantica/F hepatica (mẫu NA6) 48 Hình 3.14 Trình tự đoạn ADN thu đƣợc với trình tự mồi BD1 mẫu trứng NA6 48 Hình 3.15 Kết so sánh trình tự ITS-2 mẫu THT2 (H5) với trình tự mẫu F hepatica Niger (AM900370.1) (độ tƣơng đồng 99%) GENBANK 50 Hình 3.16 Kết so sánh trình tự ITS-2 mẫu THT2 (H5) với trình tự mẫu F gigantica Niger (JN828955.1) (độ tƣơng đồng 99%) GENBANK 51 vii Hình 3.17 Kết so sánh trình tự ITS-2 mẫu BGS1 (H3) với trình tự mẫu F gigantica Niger (AM900370.1) (độ tƣơng đồng 99%) GENBANK 52 Hình 3.18 Kết so sánh trình tự ITS-2 mẫu BGS1 (H3) với trình tự mẫu F hepatica Tây Ban Nha (AM709649.1) (độ tƣơng đồng 99%) GENBANK 53 Hình 3.19 Kết so sánh trình tự ITS-2 mẫu NA6 (H6) với trình tự mẫu F hepatica Tây Ban Nha (AM709499.1) (độ tƣơng đồng 99%) GENBANK 54 Hình 3.20 Kết so sánh trình tự ITS-2 mẫu NA6 với trình tự mẫu F gigantica Niger (AM850108.1) (độ tƣơng đồng 99%) GENBANK 55 Hình 3.21 Sơ đồ hình biểu mối quan hệ phả hệ dựa trình tự đoạn gen thu đƣợc SLGL nghiên cứu với SLGL số nƣớc khu vực giới 58 viii Tuy nhiên, cặp mồi BD1 BD2 khơng đặc trƣng cho lồi nên kết PCR-RFLP chƣa đủ sở để phân biệt SLGL F hepatica hay F gigantica Vì vậy, chúng tơi lựa chọn 01 mẫu F hepatica, 01 mẫu nghi ngờ dạng lai F hepatica/F gigantica lựa chọn ngẫu nhiên 01 mẫu F gigantica từ 312 mẫu lại để giải trình tự trực tiếp máy giải trình tự tự động ABI3130 (USA) với mồi xuôi mồi ngƣợc (BD1 BD2) Sử dụng kỹ thuật Blast để truy cập xác định loài cách so sánh với trình tự chuỗi ITS-2 đƣợc nhân F hepatica F gigantica đƣợc công bố Ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Sau giải trình tự chuỗi nucleotide mẫu cho kết mẫu BGS1 (H3) có quan hệ gần với F gigantica Việt Nam, mẫu NA6 (H6) có xu hƣớng lai F gigantica F hepatica nghiêng nhiều nhóm F gigantica phân loại, mẫu THT2 (H2) có xu hƣớng lai F gigantica F hepatica nghiêng nhiều nhóm F hepatica phân loại So sánh đối chiếu thành phần nucleotide đoạn gen ITS-2 mẫu SLGL nghiên cứu với mẫu SLGL Niger cho thấy mức độ tƣơng đồng cao (99%) Mẫu SLGL Bắc Giang mẫu trứng SLGL trâu bị Thanh Hóa có 13 nucleotide sai khác mức độ tƣơng đồng đạt 98,59 % Mẫu trứng SLGL ngƣời Nghệ An có nucleotide sai khác mức độ tƣơng đồng đạt 99,47 % Vị trí sai khác đƣợc tìm thấy đoạn gen ITS-2 mẫu vị trí 327 Nhƣ vậy, với phân tích cho thấy nghiên cứu phân loại hình thái sinh học phân tử SLGL khơng đồng SLGL có tính đa hình hình thái dựa vào hình thái khơng khơng đủ sở để kết luận SLGL thuộc loài Do vậy, muốn xác định loài SLGL cần dựa vào công cụ sinh học phân tử Tuy nhiên, phân loại hình thái góp phần bổ sung sở liệu định hƣớng lựa chọn hƣớng nghiên cứu phù hợp cho nghiên cứu chuyên sâu liên quan đến SLGL 60 KẾT LUẬN Kết hình thái học SLGL trƣởng thành nghiên cứu đa số Fasciola gigantica Dựa vào tỷ lệ chiều dài/chiều rộng thân sán có 90/150 mẫu phù hợp với F gigantica (chiếm 60%) Theo số VS-P, có 137/150 mẫu phù hợp với F gigantica (chiếm 91,33%) Kết phân loại hình thái nghiên cứu lồi SLGL trâu bị tỉnh phía Bắc Việt Nam F gigantica Kết kích thƣớc trứng SLGL trâu bị nghiên cứu có 148/150 mẫu trứng F gigantica, 2/150 mẫu trứng F hepatica Chiều dài trứng SLGL dao động từ 150 µm đến 184 µm (trung bình 170,2±7,2 µm), chiều rộng dao động từ 89 µm đến 114 µm (trung bình 100,6±6,1 µm) Tỷ lệ chiều dài chiều rộng trứng SLGL dao động từ 1,4 đến 2,06 (trung bình 1,69±0,12) Kết phân tích PCR - RFLP 150 mẫu sán gan lớn trâu bị tỉnh nghiên cứu (Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An, Bắc Giang, Nam Định), có 150 mẫu thuộc lồi F gigantica, khơng có mẫu thuộc lồi F hepatica Kết chạy PCR - RFLP 150 mẫu trứng sán gan lớn trâu bò tỉnh nghiên cứu có 01 mẫu F hepatica, 149 mẫu F gigantica Kết chạy PCR - RFLP 14 mẫu trứng sán gan lớn ngƣời tỉnh nghiên cứu có 13 mẫu F gigantica; 01 mẫu lai F hepatica/F gigantica tỉnh Nghệ An Kết giải trình tự chuỗi nucleotide ITS-2 mẫu SLGL nghiên cứu có tỷ lệ tƣơng đồng cao so với F gigantica Niger Mẫu SLGL Bắc Giang mẫu trứng SLGL trâu bị Thanh Hóa có 13 nucleotide sai khác mức độ tƣơng đồng đạt 98,59 % Mẫu trứng SLGL ngƣời Nghệ An có nucleotide sai khác mức độ tƣơng đồng đạt 99,47 % Kết mối quan hệ loài phả hệ cho thấy mẫu BGS1 (H3) có quan hệ gần gũi với F gigantica Việt Nam, Thái Lan Indonesia Mẫu NA6 (H6) có quan hệ gần gũi với F gigantica Trung Quốc, Burkina Faso mẫu lai Hàn Quốc Mẫu THT2 (H5) có quan hệ gần gũi với dạng lai Fasciola Việt Nam F hepatica Uruguay 61 KIẾN NGHỊ Cần có phối hợp phƣơng pháp phân loại SLGL mặt hình thái phân loại sinh học phân tử để có kết luận xác lồi Tiếp tục nghiên cứu SLGL thị di truyền khác (nhƣ COX1, NAD1, ITS-1…) phân tích biến đổi mức độ phân tử để có kết luận sâu tính đa hình di truyền SLGL Việt Nam 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Duy Bắc, Nguyễn Khắc Lực, Đặng Thị Cẩm Thạch, Lê Bách Quang (2011), “Xác định loài sán gan lớn gây bệnh bò khu vực miền Trung Tây Nguyên (Việt Nam) thị phân tử gen ty thể COX1”, Tạp chí Y-Dược học Quân sự, số 2-2011, tr 96-101 Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Duy Bắc, Nguyễn Khắc Lực, Nguyễn Thị Vân, Lê Trần Anh (2011), “Xác định loài tỉ lệ nhiễm sán gan lớn trâu/bò huyện Đại Lộc - Quảng Nam”, Cơng trình khoa học báo cáo Hội nghị ký sinh trùng toàn quốc lần thứ 38 Nhà xuất Y học-2011, tr 151-156 Bộ Y tế, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng (2006), “Hướng dẫn chẩn đoán điều trị số bệnh giun sán Việt Nam”, Hà Nội – 2006, tr 40-48 Nguyễn Văn Chƣơng, Triệu Nguyên Trung, Nguyễn Văn Khá, Bùi Văn Tuấn (2009), “Nghiên cứu tỉ lệ số yếu tố ảnh hƣởng đến nhiễm sán gan lớn ngƣời tỉnh Quảng Nam, Quảng Ngãi Gia Lai”, Tạp chí Y dược học Quân sự, số chuyên đề 1, tr 82-87 Nguyễn Quốc Doanh, Lê Thanh Hoà (2006), Một số đặc điểm hình thái phân tử sán gan (Fasciola spp) bò tỉnh Nghệ An Cao Bằng Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 13(5): 59-67 Nguyễn Văn Đề (2003), “Thông báo ca bệnh sán gan lớn miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Thơng tin Y-Dược, tr 7-20 Nguyễn Văn Đề (2004), "Tình hình bệnh sán gan lớn Fascicoliasis đƣợc phát miền Bắc Việt Nam", Tạp chí Y học thực hành, 8, tr 40-44 Nguyễn Văn Đề (2012), "Tỷ lệ nhiễm sán gan lớn nhóm bệnh nhân đƣợc chẩn đốn "u gan" bệnh viện Hà Nội năm 2010-2011", Kỷ yếu Hội nghị khoa học quốc tế Mékong Santé III, tr 22-29 Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa (2008), “Những nghiên cứu sinh học phân tử lĩnh vực ký sinh trùng Việt Nam”, Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV hóa sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật-2008, tr.456 63 10 Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, Lê Khánh Thuận (2004), “Xác định loài sán gan lớn từ trứng phân bệnh nhân phƣơng pháp phân tử hệ gen ty thể”, Tạp chí Phịng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, số 4/2004, tr 72-79 11 Nguyễn Văn Đề, Nguyễn Thị Khuê Lê Thanh Hịa (2011), "Tính lai chéo ngƣợc mẫu sán gan lớn Fasciola sp thu nhận bệnh nhân Nghệ An", Tạp chí Nghiên cứu Y học, 76(5), tr 34-40 12 Võ Thị Hải Lê (2010), “Tình hình nhiễm sán gan lớn trâu, bò số điểm thuộc tỉnh Nghệ An”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XVII, số 5-2010, tr 30-33 13 Nguyễn Khắc Lực (2010), “Nghiên cứu số đặc điểm nhiễm sán gan lớn (Fasciola spp.) hiệu số biện pháp can thiệp huyện Đại Lộc – Quảng Nam”, Luận án tiến sỹ y học, Học viện Quân y, Hà Nội 14 Phạm Văn Lực (2006), “Bệnh sán gan trâu bò (Fasciolaliasis) yếu tố nguy lây nhiễm sang ngƣời tỉnh Đăk Lăk”, Tạp chí y học thực hành, số năm 2006, tr 41-43 15 Trần Vinh Hiển, Phan Anh Tuấn, Đặng Tất Thế, Nguyễn Khắc Lực (2008), “Tỷ lệ nhiễm SLGL Fasciola sp hai xã Chƣ pả H’ Bơng tỉnh Gia Lai”, Tạp chí Y dược học quân sự, (2), tr 75-78 16 Lê Thanh Hịa (2007), “Xác định lai ngoại lồi F hepatica F gigantica quần thể sán gan lớn Việt Nam sở phân tích sinh học phân tử”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, tập 11, phụ số 2/2007, tr 89-97 17 Lê Thanh Hòa (2007), Chỉ thị di truyền phân tử sử dụng giám định, chẩn đoán, phân loại, phả hệ, dịch tễ học di truyền quần thể ký sinh trùng Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, 11(PB2):9-14 18 Nguyễn Thế Hùng, Lê Thanh Hòa Giang Hoàng Hà (2008), "Kết định loại sán gan lớn thu thập lò mổ Hà Nội bằn phƣơng pháp PCR", Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XV (số 3), tr 50-55 19 Lê Quang Hƣng, Hồ Việt Mỹ, Võ Hƣng, Nguyễn Văn Quốc, Đặng Tất Thế, Cao Văn Viên, Trần Vinh Hiển, Trần Thị Kim Dung (2003), “Nghiên cứu định loại đặc điểm dịch tễ học SLGL Bình Định”, Báo cáo Hội nghị 64 phòng chống bệnh sán người WHO FAO tổ chức Hà Nội, ngày 26-28/11/2002 20 Nguyễn Thu Hƣơng (2012), “Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ học sán gan lớn hiệu điều trị Triclabendazole Quảng Ngãi, năm 20092011”, Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Viện, Hà Nội 2012 21 Lê Bách Quang (2008), Ký sinh trùng trùng y học (Giáo trình giảng dạy đại học) Nhà xuất Quân đội nhân dân, tr 233-236 22 Nguyễn Thị Giang Thanh, Triệu Nguyên Trung Lê Thanh Hịa (2010), "Nghiên cứu thẩm định lồi sán gan lớn (Fasciola spp.) gây bệnh dê Việt Nam thị phân tử", Tạp chí Công nghệ Sinh học (1), 2010, tr 21 - 27 23 Lê Thị Tuyết (2009), “Kết xét nghiệm trứng sán gan lớn (Fasciola spp.) phân ngƣời trâu/bò số xã huyện Xuân Trƣờng, tỉnh Nam Định”, Tạp chí y học thực hành, 12/2009 24 Nguyễn Văn Văn (2012), “Nghiên cứu thực trạng sán gan lớn ngƣời hiệu số biện pháp can thiệp cộng đồng dân cƣ tỉnh Quảng Nam (2009 - 2011)” Luận án tiến sỹ, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 25 Anderson, N., Luong, T.T., Vo, N.G., Bui, K.L., Smooker, P.M., Spithill, T.W (1999), “The sensitivity and specifictity of two methods for detecting Fasciola infection in cattle” Vet Parasitol 83, pp 15-24 26 Boore JL (1999), “Animal mitochondrial genomes” Nucleic Acids Res, 27(8):1767-1178 27 Boray J.C (1982), CRC Handbook Series in Zoonoses Section C: Parasitic Zoonoses, Fascioliasis, pp 71-88 28 Brian Kendall S and Parfitt J.W (1953), "Life-history of Fasciola gigantica Cobbold 1856", Nature Journal 171, pp 1164 - 1165 29 Dalton J.P (1999), Fascioliasis, CABI Publishing, Walling ford, UK 30 Dang TT, Nawa Y (2005), Fasciola and Fascioliasis in Vietnam Asian Parasitol 1: 57-60 65 31 Esteban JG, Bargues MD, Mas-Coma S (1998), Geographical distribution, diagnosis and treatment of human fascioliasis a review Res Rev Parasitol (58)13-48 32 Farag, H.F (1998), A short note on praziquantel in human fascioliasis, J Tropical Medicine and Hygein, 89, pp 79 33 Fritzscha G., Schjegel M., Stadler PF (2006), Alignments of mitochondrial genome arrangements: applications to metazoan phylogeny J Theor Biol 21;240(4):511-520 34 Gil G.F., Cervero J.M., Torres P.R., Jussdado Ruiz-Capillas J.J (2006), “Hepatobiliary fasciolasis without eosinophilia”, Rev Clin Esp; 206 (9), pp 464 35 Ghavami MB., Rahimi P., Haniloo A., Mosavinasab SN (2009), “Genotypic and Phenotypic Analysis of Fasciola Isolates”, Iranian J Parasitol, Vol 4, No 3, 2009, pp 61-70 36 Guarro J, GenéJ, Stchigel AM (1999), Review Developments in fungal taxonomy Clin Microbiol Rev 12(3):454-500 37 Gulsen M.T, M.C., Savas M., Koruk A., Kadayifci F., Demirci (2006), “Fascioliasis: a report of five cases presenting with common bile duct obstruction”, The Netherlands journal of Medicine, 64 (1), pp 17-19 38 Holland, W.G., Luong, T.T., Nguyen, L.A., Do, T.T (2000), “The epidemiology of nematode and fluke infections in cattle in the Red Rive Delta in Viet Nam”, Veterinary Parasitology, 93, pp 141-147 39 Hu M., Gasser RB (2006), Mitochondrial genomes of parasitic nematodes progress and perspectives Trends Parasitol 22(2):78-84 40 Hussein A.A, Refaat M.A Khalifa (2010), "Phenotypic description and prevalence of Fasciola species in Qena Governorate, Egypt with special reference to a new strain of Fasciola hepatica", Journal of King Saud University (Science), 22, pp 1-8 41 Itagaki, T., Sakaguchi, K., Terasaki, K., Sasaki, O., Yosshihara, S., Van Dung, T (2009), “Occurrence of spermic diploid and aspermic triploid forms of Fasciola in Vietnam and their molecular characterization base on nuclear and mitochondrial DNA”, Parasitol Int.58, pp 81-85 66 42 Le T.H., Blair, D., Agatsuma, T., Humair, P.F., Campbell, N.J., Iwagami, M., Littlewood, D.T., Peacock, B., Johnston, D.A., Bartley, J., Rollinson, D., Herniou, E.A., Zarlenga, D.S and McManus, D.P (2000b), Phylogenies inferred from mitochondrial gene orders-a cautionary tale from the parasitic flatworms, Mol Biol Evol 17(7)1123-1125 43 Le TH, Blair D and McManus DP (2002), Mitochondrial genomes of parasitic flatworms Trends in Parasitology, 18:206-213 44 Le TH, De NV, Agatsuma T, Nguyen TGT, Nguyen QD, McManus DP, Blair D (2008), “Human fascioliasis and the presence of hybrid/introgressed forms of Fasciola in Vietnam”, Int J Parasitol, 38, pp 725-730 45 Le TH, De NV, Agatsuma T, Blair D, Vercruysse J, Dorny P, Nguyen TGT, and McManus DP (2007), Molecular confirmation that Fasciola gigantica can undertake aberrant migrations in human hosts Journal of Clinical Microbiology, 45(2):648-650 46 Lin Ai (2011), “Genetic characterization, species differentiation and detection of Fasciola spp By molecular approaches”, Parasites & Vectors, 2011, (101): 1-6 47 Mahami-Oskouei M (2011), "Molecular identification and differentiation of Fasciola isolates using PCR – RFLP method based on Internal Transcribed Spacer (ITS1, 5.8S rDNA, ITS2)", Iranian J Parasitol, Vol 6, No.3, 2011, pp 35-42 48 Mas-Coma S (1998), in: Angelico M (Ed), “Human fascioliasis in Europe and Latin America, Balaaban Publishers”, Rehovot, Israel, pp 1-17 49 Mas-Coma S (2004), “Human Fascioliasis: Epidemiological patterns in human endemic areas of south America, Africa and Asia”, Southeast Asian J Trop Med Public Health, 35 (1), pp 1-11 50 Mas-Coma S (2005), “Epidemiology of fascioliasis in human endemic areas”, J Helminthol, 79, pp 207-216 51 Mas-Coma S., Valero M.A, Bargues MD (2009), Fasciola, lymnaeids and human fascioliasis with a global overview on disease transmission, epidemiology, evolutionary genectics, molecular epidemiology and control Adv Parasitol 69:41-146 67 52 Mas-Coma S (2005), “Fascioliasis and other plant-borne trematode zoonoses”, Int J Parasitol, 35, pp 1255-1278 53 Mas-Coma S., Angles R., Esteban J.G, Bargues M.D., Buchon P., Franken M., and Strauss W (1999), “The Northern Bolivian Altiplano: a region highly endemic for human fascioliasis”, Trop Med Int Health, 4, pp 454-467 54 Mas-Coma S and Bargues MD (1997), "Human liver flukes ", A review Res Rev Parasitol, 57, pp 145-218 55 Mas-Coma S., Bargues MD., Esteban JG (1999), “Human fasciolosis in Dalton”, JP Fasciolosis Wallingford, Oxon, UK: CABI Pub pp 411-434 56 McManus DP, Dalton JP (2006), “Vaccines against the zoonotic trematodes Schistosoma Japonicum, Fasciolasis hepatica and Fasciolasis gigantica”, Parasitology, 133 (1), pp 43-61 57 J.A Munguisa-Xoschihua, F Ibarra-Velarde, A Ducoing-Watty, N Montenegro-Cristino and H Quiroz-Romero (2006), “Prevalence of Fasciola hepatica (ELISA and fecal analysis) in ruminants from a semi-desert area in the northwest of Mexico”, Parasitology Research, 101 (1), pp 127-130, DOI: 10.1007/s00436-006-0438-y Original Paper (online) 58 Nguyen TGT, De NV, Vercruysse J, Dorny P, Le TH (2009), Genotypic characterization and species identification of Fasciola spp with implications regarding the isolates infecting goats in Vietnam Exp Parasitol 123: 354-361 59 Periago M.V (2006), "Phenotypic comparison of allopatric populations of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica from European and African bovines using a computer image analysis system (CIAS)", Parasitol Res (2006) 99, pp 368-378 60 Periago M.V (2008), "First phenotypic description of Fasciola hepatica/ Fasciola gigantica intermediate forms from the human endemic area of the Nile Delta, Egypt", Infection, Genetics and Evolution, 8, pp 51-58 61 Se – Eun Choe, Thuy Thi – Dieu Nguyen, Tae – Gyu Kang, Chang – Hee Kweon, Seung – Won Kang (2011), “Genetic analysis of Fasciola isolates from cattle in Korea based on second internal transcribed spacer (ITS-2) 68 sequence of nuclear ribosomal DNA”, Parasitol Res, DOI 10.1007/s00436011-2323-6 62 Szymanski, M., M.Z Barciszewska, J Barciszewski, and V.A Erdmann (2000), 5S ribosomal RNA database Y2K Nucleic Acids Res 28, 166-167 63 Thomas H Cribb (2000), Chapter 16 The Digenea, Interrelationships of the Platyhelminthes, R A Bray D T J Littlewood, ed, CRC Press 64 Urquhard GM (1996), "Veterinary Parasitology", Blackwell Science, Oxford 65 Valero MA (1999), "Comparison of adult live flukes from highland and lowland populations of Bolivian and Spainish sheep", J Helminthol, 73, pp 341-345 66 Valero M.A Periago M.V., Panova M., Mas-Coma S (2006), "Phenotypic comparison of allopatric populations of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica from European and African bovines using a computer image analysis system (CIAS)", Parasitol Res (2006) 99, pp 368-378 67 Valero MA, Perez-Crespo I, Periago MV, Khoubbane M, Mas-Coma S (2009), Fluke egg characteristics for the diagnosis of human and animal fascioliasis by Fasciola hepatica and F gigantica Acta Trop 111(2):150-159 68 Van de peer Y., Chapelle S., De Wachter R (1996), A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA Nucleic Acids Res 24(17): 3381-3391 69 WHO (1994), Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasite World Health Organization, Geneva 70 WHO (1995), Control of foodborne trematode infections Report of a WHO Study Group WHO technical Report Series, No 849: annex 71 WHO (2006), “Report of the WHO Informal Meeting on use of triclabendazole in fascioliasis control”, WHO headquarters, Geneva, Switzerland, 17-18 October 2006 72 Zarowiecki MZ, Huyse T, Littlewood DT (2007), Making the most of mitochondrial genomes markers for phylogeny, molecular ecology and barcodes in Schistosoma (Platyhelminthes: Digenea) Int J Parasitol 37(12):1401-18 69 PHỤ LỤC Phụ lục 1: So sánh tỷ lệ BL/BW nghiên cứu với BL/BW số nƣớc Loài sán F hepatica Quốc gia Ai Cập Tác giả Periago Vật chủ Cỡ BL/BW mẫu (n) Min Max TB Bò 82 1,65 2,76 2,27 ± 0,03 Bò 126 1,86 3,37 2,61 ± 0,03 Bò 12 3,43 5,50 4,37 ± 0,17 Bò 84 1,29 2,77 1,74 ± 0,03 Bò 81 3,40 6,77 4,70 ± 0,08 Bò 99 1,58 3,08 2,28 ± 0,03 Bò 152 1,54 4,01 2,43 ± 0,04 Bò 150 2,33 4,94 3,43±0,49 cs, 2008 Fasciola sp Ai Cập Periago cs, 2008 F gigantica Ai Cập Periago cs, 2008 F hepatica Tây Ban Nha Periago cs, 2008 F gigantica Burkina Faso Periago cs, 2008 F hepatica Bolivia K Ashrafi cs, 2006 F hepatica Iran K Ashrafi cs, 2006 Fasciola sp Việt Nam Nghiên cứu Phụ lục 2: So sánh số VS-P nghiên cứu với VS-P số nƣớc Loài sán F hepatica Quốc gia Ai Cập Tác giả Periago Vật chủ Cỡ VS-P mẫu (n) Min Max TB Bò 82 12,40 25,08 20,79 ± 0,31 Bò 126 20,60 41,11 30,59 ± 0,33 Bò 12 31,01 45,39 41,02 ± 1,21 Bò 84 9,51 19,94 14,40 ± 0,22 Bò 81 26,28 50,09 36,39 ± 0,59 Bò 99 8,88 24,92 16,24 ± 0,32 Bò 152 8,54 31,58 18,90 ± 0,35 Bò 150 25 38 30,85±3,22 cs, 2008 Fasciola sp Ai Cập Periago cs, 2008 F gigantica Ai Cập Periago cs, 2008 F hepatica Tây Ban Nha Periago cs, 2008 F gigantica Burkina Faso Periago cs, 2008 F hepatica Bolivia K Ashrafi cs, 2006 F hepatica Iran K Ashrafi cs, 2006 Fasciola sp Việt Nam Nghiên cứu Phụ lục 3: Bảng kết chạy PCR – RFLP mẫu sán trứng sán gan lớn TT Tên tỉnh Số lƣợng (mẫu) Kết PCR-RFLP Con sán gan lớn trƣởng thành Loại mẫu Hà Nội 30 30 (+) với F gigantica Nghệ An 30 30 (+) với F gigantica Nam Định 30 30 (+) với F gigantica Thanh Hóa 30 30 (+) với F gigantica Bắc Giang 30 30 (+) với F gigantica Loại mẫu Trứng sán trâu bò Hà Nội 30 30 (+) với F gigantica Nghệ An 30 30 (+) với F gigantica Nam Định 30 30 (+) với F gigantica Thanh Hóa 30 29 (+) với F gigantica 01 (+) với F hepatica 10 Bắc Giang 30 30 (+) với F gigantica Trứng sán ngƣời Loại mẫu 11 Hà Nội 01 01 (+) với F gigantica 12 Thanh Hóa 01 01 (+) với F gigantica 13 Nghệ An 12 11 (+) với F gigantica 01 (+) với F gigantica/ F hepatica 312 (+) với F gigantica Tổng số 314 01 (+) với F hepatica 01 (+) với F gigantica/ F hepatica Phụ lục 4: So sánh số chiều dài, chiều rộng tỷ số dài/rộng nghiên cứu so với số nƣớc (Valero et al, 2009) Loài sán Quốc gia Tác giả Vật chủ Cỡ mẫu (n) Valero Fasciola sp Bolivia CS Ngƣời 154 (2009) Valero F hepatica Bolivia CS Bò 168 Cừu 104 Lợn 186 Lừa 161 (2009) Valero F hepatica Bolivia CS (2009) Valero F hepatica Bolivia CS (2009) Valero F hepatica Bolivia CS (2009) Valero Fasciola sp Peru CS Ngƣời 167 (2009) Valero Fasciola sp Georgia CS Ngƣời 53 Bò 117 (2009) F hepatica Georgia Valero Chiều dài Chiều rộng (µm) (µm) 119,8-159,5 67,6-102,1 1,4-2,2 (139,7±8,2) (76,9±5,2) (1,8±0,1) 105,3-155,9 61,7-82,5 1,6-2,3 (132,0±10,5) (71,14±4,3) (1,8±0,2) 114,8-151,1 65,5-81,4 1,5-2,1 (130,8±7,1) (72,6±3,9) (1,8±0,1) 73,8-148,6 58,1-82,6 1,1-2 (123,8±11,3) (71,8±4,4) (1,7±0,2) 96,4-140,8 63,3-84,7 1,3-2 (125,4±8,3) (75,0±3,7) (1,7±0,1) 100,6-161 65,9-104,6 1,3-2,1 (138,4±9,9) (80,2±6,6) (1,7±0,2) 104,5-162,2 72,1-96,6 1,3-2 (140,1±11,8) (82,1±4,7) (1,7±0,1) 116,3-156,8 72,2-98,1 1,3-2 Dài/rộng CS (140,2±10,1) (83,4±6,9) (1,7±0,2) 106,5-171,5 63,9-95,4 1,4-2,5 (139,4±11) (76,7±5,4) (1,8±0,2) 120,6-163,9 69,2-93,8 1,6-2,1 (146,7±14,2) (80,3±6,4) (1,8±0,1) 130,3-175 74-123,6 1,3-2 (149,4±8,3) (94,6±6,8) (1,6±0,1) 150,9-182,2 85,1-106,2 1,5-2 (165,3±6,2) (95,9±4,4) (1,7±0,1) 156,2-182,8 90,6-114,9 1,4-1,9 (169,9±5,3) (104,1±5,7) (1,6±0,1) 129,6-204,5 61,6-112,5 1,3-2,6 (156,8±1,1) (89,4±0,7) (1,8±0,0) 100-180 50-110 1,4-2,6 (2009) Valero Fasciola sp Ai Cập CS Ngƣời 608 (2009) Valero F hepatica Ai Cập CS Bò 35 Bò 73 Ngƣời 67 Bò 101 Bò 142 (2009) Valero F gigantica Ai Cập CS (2009) Fasciola sp F gigantica F gigantica Việt Nam Việt Nam Burkina Faso Valero CS (2009) Valero CS (2009) Valero CS (2009) Nguyễn Fasciola sp Việt Nam Thu Hƣơng Ngƣời 114 CS (152,5±1,75) (79,39±1,43) (1,95±0,2) (2012) Fasciola sp Việt Nam Nghiên cứu 150 Bò 56-84 31-50 1,2-2,25 (69,06±5,89) (41,35±4,74) (1,69±0,22) ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HOÀNG YẾN ÁP DỤNG HÌNH THÁI HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC – VIỆT... tài: ? ?Áp dụng hình thái học sinh học phân tử định loại sán gan lớn số tỉnh miền Bắc – Việt Nam? ?? nhằm mục tiêu: Xác định đƣợc loài sán gan lớn sử dụng thị hình thái học thị phân tử ITS-2 Chƣơng TỔNG... 1.1 Tình hình nhiễm sán gan lớn ngƣời động vật 1.1.1 Bệnh sán gan lớn giới 1.1.2 Bệnh sán gan lớn Việt Nam 1.2 Đặc điểm sinh học sán gan lớn 1.2.1 Phân loại sinh học