SO SÁNH ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH NANG TRỨNG LỢN VÀ HUYẾT THANH THAI BÊ ĐẾN KẾT QUẢ TẠO PHÔI LỢN IN VITRO Đỗ Văn Hương, Quản Xuân Hữu, Vũ Thị Thu Hương, Nguyễn Khánh Vân, Nguyễn Thị Hương Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật Tóm tắt Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá được ảnh hưởng của việc bổ sung dịch nang trứng lợn (PFF) so với huyết thanh thai bê (FCS) vào môi trường IVM đến kết quả tạo phôi lợn in vitro. PFF được hút từ các nang trứng đường kính 3-8mm trên bề mặt buồng trứng lợn thu thừ lò mổ. Hút phần dịch nổi bên trên đem ly tâm (3000 vòng/phút, 90 phút, 40C). Sau ly tâm, PFF được lọc bằng màng lọc Microfilter 0.22µm. Trung bình thu được 0,46ml PFF/buồng trứng. Phần lắng được hòa tan bằng môi trường IVM để tìm tế bào trứng dưới kính hiển vi soi nổi. Trứng sau khi tìm và phân loại được nuôi trong 2 loại môi trường nuôi chín in vitro IVM bổ sung10% PFF, và IVM bổ sung 10% FCS. Sau 44-48h nuôi chín in vitro, trứng được phân loại và đánh giá tỷ lệ chín in vitro. Trứng chín in vitro đem thụ tinh in vitro. Trong thí nghiệm này, chúng tôi thu được 302 ml dịch nang trứng và đã so sánh về tỷ lệ chín in vitro, thụ tinh in vitro, tạo phôi dâu, phôi nang in vitro khi sử dụng hai với 2 loại môi trường IVM (10% PFF), IVM (10% FCS) tương ứng là : 68,1%; 66,84%; 7,85%; 14,18% so với 40,86%; 60,76; 10,55; 9,7%. ) 1. Đặt vấn đề Kỹ thuật tạo phôi in vitro (IVF) kết hợp nuôi chín in vitro (IVM) hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm. Trong kỹ thuật IVF lợn, phần lớn những nghiên cứu trước đây sử dụng FCS để bổ sung vào môi trường nuôi chín in vitro tế bào trứng cũng như nuôi cấy hợp tử. FCS chứa nhiều các yếu tố sinh trưởng, các hormone và nhiều thành phần khác cần thiết cho sự phát triển của tế bào trứng in vitro cũng như quá trình phát triển của hợp tử và phôi. Mặc dù, FCS luôn có sẵn trên thị trường nên việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy rất thuận tiện nhưng giá của FCS rất cao. Tuy nhiên, có thể sử dụng dịch nang trứng lợn để bổ sung vào môi trường IVM tế bào trứng lợn. Dịch nang trứng lợn có sẵn trong các nang trứng của buồng trứng lợn. Nó cũng chứa các yếu tố rất cần thiết cho sự phát triển của tế bào trứng. Khai thác PFF rất thuận lợi vì nguồn buồng trứng lợn thu từ lò mổ rất dồi dào và rẻ tiền. Nhưng một câu hỏi lớn được đặt ra là “ Liệu PFF có tác dụng như thế nào tới tỷ lệ chín in vitro của tế bào trứng lợn so sánh với FCS và ảnh hưởng của nó tới sự phát triển đến sự phát triển đến giai đoạn phôi nang của phôi như thế nào?”. Để làm sáng tỏ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài “ So sánh ảnh hưởng của dịch nang trứng lợn và huyết thanh thai bê đến kết quả tạo phôi lợn in vitro”. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu - Buồng trứng lợn thu ở lò mổ. - Tinh lợn Landrace đông lạnh trong cọng rạ loại 0,25ml. - Các môi trường pha chế tại phòng thí nghiệm: PBS, IVM1, IVM2, IVC… - Các thiết bị phòng thí nghiệm: máy li tâm lạnh, kính hiển vi soi nổi, tủ nuôi cấy CO 2 , bể ổn nhiệt, panh, dao, kéo, đĩa petri 2.2. Nội dung nghiên cứu -Tách chiết dịch nang trứng lợn từ buồng trứng thu ở lò mổ (theo phương pháp của Kikuchi và cộng sự). - Thụ tinh IVF (theo phương pháp của Kikuchi và cộng sự). So sánh kết quả tạo phôi dâu, phôi nang khi nuôi trứng lợn trong môi trường nuôi thành thục in vitro bổ sung 10% dịch nang trứng, và môi trường nuôi thành thục in vitro với 10% huyết thanh thai bê. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Thu buồng trứng lợn từ lò mổ Buồng trứng lợn được cắt, rửa sạch bằng dung dịch đệm PBS(-) có bổ sung kháng sinh . Cho vào chai thuỷ tinh và đặt vào phích nước ấm 35˚C -37˚C, đưa về phòng thí nghiệm trong khoảng thời gian từ 3 đến 5 giờ. 2.3.2. Tách chiết dịch nang trứng và thu tế bào trứng từ buồng trứng lợn - Rửa sạch buồng trứng bằng dung dịch PBS(-), dùng kéo vô trùng cắt bỏ dây chằng rốn buồng trứng, cho buồng trứng vào lọ môi trường PBS(-), giữ ấm ở 37˚C. Dùng panh vô trùng lấy buồng trứng cho vào đĩa petri θ 90, dùng dao nhọn hoặc xi lanh với kim 18 G thu trứng và dịch trong nang trứng. Cho dịch nang trứng và tế bào trứng vào ống falcol giữ ấm trong bể ổn nhiệt 37˚C sau 5-10 phút, hút phần trên cho vào ống falcon để tách dịch nang trứng (PFF). - Điều chỉnh máy li tâm xuống nhiệt độ 4 0 C, với tốc độ 3000 vòng/phút, sau đó đưa ống falcon chứa dịch nang trứng vào máy li tâm, li tâm trong thời gian 90 phút, hút phần nổi ở trên, lọc vô khuẩn bằng màng lọc 0,22µm. Chuyển dịch nang trứng đã tách chiết vào ống falcon. - Bổ sung dịch nang trứng đã sử lý vào môi trường nuôi chín IVM hoặc cất vào tủ lạnh sâu – 20 0 C để sử dụng sau này. - Sau khi tách nang trứng phần còn lại chứa các tế bào trứng chuyển sang đĩa môi trường M- 119 air và soi tìm trứng trên kính hiển vi soi nổi. - Những tế bào trứng lợn có chất lượng tốt với 2-3 lớp tế bào cumulus nguyên vẹn, và sáng màu được chọn lựa chia đều vào hai nhóm: Nhóm thí nghiệm (nuôi chín trong môi trường có bổ sung 10% dịch nang trứng, thụ tinh in vitro). Nhóm đối chứng (nuôi chín trong môi trường có bổ sung 10% huyết thanh thai bê, thụ tinh in vitro). 2.3.3. Nuôi trứng chín in vitro Nhóm thí nghiệm Những tế bào trứng có tế bào cumulus đầy đủ được rửa 3 lần trong môi trường nuôi chín IVM1 bổ sung 10% dịch nang trứng, và HCG, PMSG, dbc AMPC ). Sau đó chuyển vào nuôi trong đĩa 4 giếng, mỗi giếng 500µl môi trường IVM1, cho 20 trứng, cho đĩa nuôi vào trong tủ nuôi cấy 38,5˚C, 5% CO2 độ ẩm tối đa trong 20-22 giờ. Chuyển trứng sang đĩa môi trường IVM2 (NCSU-37, bổ sung D- sobitol, D(+) Gluco, L- systein - Me, dịch nang trứng, kháng sinh, không có dbc-AMP và hormon) cho vào tủ nuôi cấy 38,5˚C, 5% CO2 độ ẩm tối đa nuôi trong 20-24 giờ. Trứng sau khi nuôi chín, chọn những tế bào trứng chín có lớp màng cumulus giãn nở, 2-3 khối cumulus liên kết với nhau được dùng cho thụ tinh ống nghiệm. Nhóm Đối chứng Thay 10% Dịch nang trứng trong môi trường IVM bằng 10% Huyết thanh thai bê FCS 2.3.4. Hoạt hoá tinh trùng Hoạt hoá tinh trùng bằng môi trường M 199- PH 7,6-7,7 Pha M 199 Earl-salts trong nước cất khử ion, bổ sung NaHCO3 và Hepes, D- glucose, Calcium lactacte, PFF, và kháng sinh. Lấy 8ml môi trường 199 cho vào ống Falcon (1), lấy 200 l môi trường trong ống Falcol (1) cho vào ống Falcon(2), ủ ấm cả 2 ống trong nước ấm 37˚C. Lấy cọng rạ tinh đông lạnh ra khỏi bình nitơ cho vào nước ấm 37˚C trong 30 giây, cắt đầu cọng rạ cho tinh trùng vào ống Falcol (1) ly tâm 2000v/phút trong 2 phút, hút bỏ phần trên lấy phần cặn. Bổ sung 60µl 199- ở ống Falcon (2) cho vào ống Falcon (1) trộn đều, lấy 60 µl cho vào đĩa θ 35mm phủ dầu khoáng cho vào tủ incubator ủ trong 15 phút. Tính nồng độ tinh trùng cần cho thụ tinh, đếm số lượng tinh trùng bằng buồng đếm Thoma, pha loãng tinh trùng bằng môi trường Pig-FM điều chỉnh số lượng tinh trùng (1.000.000 tinh trùng/ 1ml ). Trong cùng một lượt thí nghiệm sử dụng từ một cọng tinh đông lạnh. 2.3.5. Thụ tinh in vitro Môi trường thụ tinh ống nghiệm là môi trường Pig-FM có bổ sung caffeine anhydrous và BSA (fatty acid free - Sigma). Tế bào trứng sau khi nuôi chín trong môi trường IVM2, chọn những trứng có tế bào cumulus phát triển rửa 3 lần trong môi trường Pig-FM, sau đó chuyển sang giọt (Pig-FM) và cho vào tủ nuôi cấy 38,5˚C có 5% CO2 ẩm độ tối đa, lấy 10µ dung dịch tinh trùng đã hoạt hoá cho vào mỗi giọt thụ tinh (Pig-FM đã có tế bào trứng). Tinh trùng đã hoạt hoá được cho như nhau vào cả 2 nhóm đối chứng và thí nghiệm. Tiến hành ủ tinh trùng và trứng trong 3 giờ ở 38,5˚C có 5% CO2, ẩm độ tối đa. Sau thụ tinh 3 giờ, rửa hợp tử giả định 3 lần trong môi trường IVC1 (IVC- Pyruvate lactac) để loại bỏ những tế bào cumulus và tinh trùng bám vào màng trong suốt. Ngày thụ tinh được xem là ngày 0. 2.3.6. Nuôi cấy phôi in vitro Môi trường cơ sở dùng cho IVC là NCSU-37 có bổ sung 4 mg/ml BSA và 50 µM β- mercaptoethanol. Từ ngày 0-2, các hợp tử được nuôi trong môi trường NCSU-37 cải tiến có chứa 0,17 mM Na pyruvate và 2,73 mM Na Lactate (IVC1) và từ ngày 2-6, chúng tôi dùng môi trường NCSU-37 cải tiến có chứa 5,55 mM D-Glucose (IVC2). Đánh giá khả năng thụ tinh qua sự hình thành 2 thể cực và phát triển đến 2-4 tế bào từ ngày 0- 2, và phát triển của phôi đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang ở ngày 2-6 của cả 2 nhóm thí nghiệm và đối chứng 3. Kết quả 3.1. Kết quả tách chiết dịch nang trứng lợn Bảng 1. Kết quả tách chiết dịch nang trứng lợn Tổng số buồng trứng Tổng số Dịch nang trứng thu được Trung bình dịch nang trứng thu được/1buồng trứng Dịch nang trứng thu được sau khi tách chiết Trung bình dịch nang trứng thu được/1buồng trứng sau khi tách chiết n ml ml ml % ml 40 23,0 0,58 18,5 80,43 0,46 44 23,5 0,53 19,5 82,98 0,44 50 30,0 0,60 26,0 86,67 0,52 38 22,0 0,58 18,5 84,09 0,49 46 24,5 0,53 20,5 83,67 0,45 48 25,0 0,52 22,0 88,00 0,46 40 22,0 0,55 18,5 84,09 0,46 36 20,0 0,56 16,0 80,00 0,44 44 24,0 0,55 19,5 81,25 0,44 42 24,0 0,57 21,0 87,50 0,50 48 25,0 0,52 20,5 82,00 0,43 40 23,0 0,58 19,5 84,78 0,49 38 20,0 0,53 17,5 87,50 0,46 46 27,0 0,59 22,0 81,48 0,48 46 25,0 0,54 22,5 90,00 0,49 646 358 0.55 302 84,35 0,46 Qua 15 lần thí nghiệm với 646 buồng trứng lợn thu từ lò mổ chúng tôi đã tách chiết được 302 ml dịch nang trứng lợn trung bình thu được 0,46 ml/ một buồng trứng. 3.2. So sánh kết quả nuôi trứng thành thục và tạo phôi giữa hai nhóm bổ sung PFF và bổ sung FCS vào môi trường IVM Bảng 2. Kết quả so sánh bổ sung PFF và FCS đến sự chín và phát triển phôi lợn in vitro. Lần TN Số trứng đem nuôi từng nhóm Tế bào trứng Thành thục Thụ tinh Phôi dâu Phôi nang TN(n,%) ĐC (n,%) TN(n,%) ĐC (n,%) TN(n,%) ĐC (n,%) TN(n,%) ĐC (n,%) 1 80 52(65) 27(33,6) 22(42,3) 16(59,3) 3(5,77) 5(18,52) 8(15,38) 2(7,41) 2 100 50(50) 36(36) 36(72) 21(58,3) 9(18,0) 2(5,56) 7(14) 3(8,33) 3 120 78(65) 42(35) 43(55,1) 32(76,2) 5(6,41) 4(9,52) 11(14,1) 5(11,9) 4 120 80(66,7) 60(50) 55(68,7) 25(41,7) 4(5,0) 5(8,33) 13(16,25) 6(10) 5 80 64(80) 46(57,5) 48(75) 28(60,9) 8(12,5) 3(6,52) 7(10,94) 5(10,9) 6 80 71(88) 26(32,5) 60(84,5) 22(84,6) 2(2,82) 6(23,08) 10(14,08) 2(7,69) Tổng 580 395(68,1) 237(40,86) 264(66,84) 144(60,8) 31(7,85) 25(10,55) 56(14,18) 23(9,7) TN: Nhóm Thí nghiệm có bổ sung 10% dịch nang trứng vài môi trường IVM ĐC: Nhóm đối chứng có bổ sung 10% huyết thanh thai bê vào môi trường IVM Tỷ lệ tế bào trứng nuôi chín in vitro trung bình đạt 68,10% khi nuôi cấy trong môi trường nuôi chín in vitro bổ sung 10% dịch nang trứng, tỷ lệ thụ tinh trung bình là 66,84%, tỷ lệ phôi dâu là 7,85% và tỷ lệ phôi nang đạt 14,18%. Tỷ lệ nuôi chín in vitro của tế bào trứng lợn khi nuôi trong môi trường bổ sung 10% huyết thanh thai bê trung bình là 40,86% và không có sự biến động nhiều giữa các lần thí nghiệm. Tỷ lệ thụ tinh đạt 60,76%. Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang trung bình đạt 9,70% và tương đối ổn định qua các đợt tạo phôi in vitro. 4. Thảo luận Trong thí nghiệm này chúng tôi đã thành công trong việc tách chiết dịch nang trứng lợn và khi tiến hành bổ sung dịch nang trứng này vào môi trường IVM. Nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng huyết thanh thai bê hoặc albumin huyết thanh bò (BSA) vào môi trường nuôi IVM nhiều loài động vật như thỏ, bò, cừu, lợn đã đạt được nhiều thành công. Hiệu quả của huyết thanh thai bê đối với thụ tinh ống nghiệm trên bò đã thành công. Hơn nữa, huyết thanh thai bê luôn có sẵn trên thị trường nên rất thuận tiện khi sử dụng. Các nhà khoa học tại trường đại học Cambridge đã thử nghiệm sử dụng dịch nang trứng vào môi trường nuôi thành thục in vitro. Dịch nang trứng với thành phần tương tự như trong huyết thanh thai bê. Tuy nhiên, nó có chứa nhiều hormone và các yếu tố sinh trưởng. Khi nuôi tế bào trứng in vitro trong môi trường 100% dịch nang trứng, không có sự thành thục in vitro của các tế bào trứng đem thí nghiệm. Nếu nuôi trứng trong môi trường bổ sung 40% dịch nang trứng, tỷ lệ thành thục in vitro của tế bào trứng đạt được rất thấp. Một điều đáng chú ý khi bổ sung 10% dịch nang trứng thì tỷ lệ trứng chín in vitro thu được rất cao. Sau các lần tách chiết dịch nang trứng lợn chúng tôi thu được 302 ml dịch trung bình 0,46ml/1 buồng trứng. Một vấn đề quan tâm là chất lượng của PFF có tốt hay không, liệu có nhiễm khuẩn trong quá trình khai thác. Kỹ thuật thao tác cẩn thận vô trùng cùng với công đoạn lọc qua màng lọc microfilter có kích thước lỗ lọc là 0,22µm, đã tránh được sự nhiễm khuẩn. Hiện nay, việc sử dụng dịch nang trứng trở lên phổ biến vì nguồn khai thác dồi dào và rất kinh tế. Tuy vậy, bổ sung PFF vào môi trường nuôi IVM thực sự có hiệu quả hay không chúng tôi tiến hành thí nghiệm giữa bổ sung dịch nang trứng 10% vào môi trường IVM so với đối chứng bổ sung 10% huyết thanh thai bê vào môi trường IVM. Sau đó so sánh kết quả tạo phôi dâu và phôi nang. Ngày nay, mặc dù đã có nhiều thành công nhưng hệ thống nuôi trứng thành thục in vitro và thụ tinh in vitro vẫn tồn tại hai vấn đề lớn cần khắc phục. Đó là hiện tượng đa tinh trùng cao và tỷ lệ tạo thành phôi nang thấp và chất lượng phôi kém hơn so với phôi tạo ra trong cơ thể mẹ (in vivo). Một vài hệ thống môi trường nuôi tế bào trứng thành thục in vitro đã được chuẩn hóa. Bijttebier [1] và cộng sự đã sử dụng môi trường nuôi chín trứng bổ sung dịch nang trứng. Kikuchi [2] và cộng sự đã xây dựng một hệ thống nuôi cấy hợp tử hoàn hảo sau khi nuôi trứng chín in vitro và thụ tinh ống nghiệm sử dụng hệ thống nuôi chín in vitro với nồng độ khí ô xi thấp và môi trường nuôi cấy hợp tử cải tiến đã tạo ra phôi nang chất lượng rất tốt. Qua bảng 2 ta thấy tỷ lệ chín in vitro trung bình của tế bào trứng lợn nuôi trong môi trường IVM bổ sung 10% PFF là 68,10%. Tuy nhiên, tỷ lệ thành thục in vitro có sự dao động giữa các mẻ dịch nang trứng. Điều này có thể được giải thích chất lượng dịch nang trứng khác nhau giữa các lần thí nghiệm. Chất lượng PFF khác nhau ảnh hưởng tới khả năng phát triển của lớp tế bào cumulus. Tế bào cumulus giãn nở là chỉ tiêu quan trọng trong việc đánh giá phân loại tế bào trứng thành thục in vitro. Dịch nang thu ở các nang có kích thước 3-5 mm có chất lượng tốt nhất. Buồng trứng của lợn phát triển theo các giai đoạn khác nhau trong một chu kì động dục. Ở giai đoạn tiền động dục các nang trứng quan sát được với kích thước lớn và số lượng nhiều. Trái lại ở giai đoạn yên tĩnh, xa giai đoạn động dục các nang nhỏ và ít. Tỷ lệ thành thục in vitro của trứng khác nhau giữa thí nghiệm bổ 10% PFF và bổ sung 10% huyết thanh thai bê vào môi trường IVM. Tỷ lệ chín in vitro (68,10%) trong thí nghiệm bổ sung PFF là tương đương so với kết quả của Nguyễn Thị Thoa và cộng sự [3] (70,82%). Trong thí nghiệm của chúng tôi, tỷ lệ tế bào trứng lợn chín in vitro trong môi trường nuôi chín in vitro IVM bổ sung 10% huyết thanh thai bê là 40,86% và trong môi trường bổ sung 10% PFF là 68,10%. Kết quả này của chúng tôi thấp hơn so với kết quả của Suzuki và cộng sự [5]. Năm 2006, nhóm nghiên cứu do Suzuki [5] đứng đầu đã sản xuất thành công lợn con bằng thụ tinh ống nghiệm trứng được nuôi thành thục in vitro có sử dụng NCSU-37 bổ sung huyết thanh thai bê. Các tác giả trên đã báo cáo tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro khi bổ sung 10% huyết thanh thai bê là 41% và cũng thấp hơn khi bổ sung huyết thanh thai bê thấp hơn khi dùng môi trường IVM 10% dịch nang trứng lợn (74%). Xét về tỷ lệ phôi nang ở thí nghiệm về dịch nang trứng là 14,18% cao hơn tỷ lệ này trong thí nghiệm về bổ sung huyết thanh thai bê là 9,70%. Tỷ lệ phôi nang của chúng tôi thấp hơn so với kết quả của Suzuki và cộng sự [5] (với tỷ lệ phôi nang là 19%). Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các yếu tố quan trọng có trong dịch nang trứng lợn đã giúp tế bào trứng chín. Sự chín này bao gồm sự chín nhân và chín tế bào chất. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng. Bởi vì sự chín không hoàn toàn tế bào chất có thể gây ra hiện tượng đa tinh trùng và giảm sút sự phát triển của phôi. Hơn nữa, dịch nang trứng kích thích sự phát triển của lớp tế bào cumulus đã hạn chế hiện tượng nhiều tinh trùng cùng xâm nhập vào bên trong một tế bào trứng. Một vài báo cáo đã chỉ rõ những yếu tố chống ô xi hóa và các chất đại phân tử lên sự thành thục của tế bào trứng. Tatemoto và cộng sự (2004) [6] đã khám phá ra hoạt tính của men superoxide dismutase trong dịch nang trứng bảo vệ tế bào trứng chống lại các stress ô xi hóa trong quá trình nuôi chín tế bào trứng. Để đánh giá lợi ích của dịch nang khi bổ sung vào môi trường nuôi chín trứng, các tác giả đã tập trung vào vai trò chống ô xi hóa của men trên trong dịch nang trứng. Kết quả thí nghiệm cho thấy dịch nang khai thác từ những nang 2-6 mm có mức hoạt tính cao gấp 7,2 lần so với huyết thanh thai bê. Tatemoto [6] kết luận rằng dịch nang trứng giữ vai trò vô cùng quan trọng bảo vệ trứng khỏi các stress ô xi hóa từ đó làm tăng khả năng chín in vitro của tế bào trứng đồng thời gia tăng khả năng phát triển của phôi đến giai đoạn phôi nang. Trong dịch nang trứng còn chứa các hoc môn steroid tác động đến sự giãn nở của lớp tế bào cumulus, sự thành thục in vitro của trứng và liên quan chặt tới tỷ lệ phôi nang thu được. 5. Kết luận Chúng tôi đã thành công trong việc tách chiết dịch nang trứng lợn. Đã tách chiết được 302ml. Kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng bổ sung 10% dịch nang trứng lợn vào môi trường nuôi chín tế bào trứng lợn in vitro IVM làm nâng cao hiệu quả tạo thành phôi nang. Tài liệu tham khảo 1. BijttebierA. Van Soom, E. Meyer, B. Mateusen and D. Maes. Preovulatory follicular fluid during in vitro maturation decreases polyspermic fertilization of cumulus-intact porcine oocytes In vitro maturation of porcine oocytes. Theriogenology 2008 2. Kikuchi K, Onishi A, Kashiwasaki N, Iwamoto M, Noguchi J, Kaneko H, Akita T, Nagai T. Successful piglet production after transfer of blastocyst produced by a modified in vitro system. Biol Reprod 2002;66:1033-1041. 3. Nguyễn Thị Thoa, Lưu Ngọc Anh, Vũ Thị Hương, Trần Sơn Hà, Đỗ Văn Hương, Nguyễn Thị Hương. Nghiên cứu tạo phôi lợn trong ống nghiệm sử dụng môi trường NCSU-37 bổ sung 10% PFF. Hội nghị Á Úc lần 13, Hà Nội, Việt Nam. 4. Ozama M, Nagai Takashi, Kaneko H, Noguchi J, Ohnuma K, Kikuchi K. Successful pig embryonic development in vitro outside a CO2 gas-regeluted incubator: Effects of pH and osmolality. Theriogenology 2006;65:860-869. 5. Suzuki Misae, Misumi K, Manabu O, Noguchi, Kaneko H, Ohnuma K, Fuchimoto D, Onishi A, Iwamoto M, Saito N, Nagai T, Kikuchi K. Successful piglet production by IVF of oocytes matured in vitro using NSCU-37 supplemented with fetal bovine serum. Theriogenology 2006;65:374-386. 6. Tatemoto H, Muto N, Sunagawa, Shinjo, Nagai N. Protection of porcine oocytes aganst cell Damage caused by oxidative stress during in vitro maturation: Role of superoxide dismutase activity in porcine follicular fluid. Biol Reprod 2004;71:1150-1157. . “ So sánh ảnh hưởng của dịch nang trứng lợn và huyết thanh thai bê đến kết quả tạo phôi lợn in vitro . 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu - Buồng trứng. SO SÁNH ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH NANG TRỨNG LỢN VÀ HUYẾT THANH THAI BÊ ĐẾN KẾT QUẢ TẠO PHÔI LỢN IN VITRO Đỗ Văn Hương, Quản Xuân Hữu, Vũ Thị Thu Hương, Nguyễn. Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá được ảnh hưởng của việc bổ sung dịch nang trứng lợn (PFF) so với huyết thanh thai bê (FCS) vào môi trường IVM đến kết quả tạo phôi lợn in vitro. PFF