Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nâng cao kết quả thụ tinh nhân tạo cho dê bằng tinh đông lạnh cọng rạ Đinh Văn Bình 1 , Chu Đức Tụy 1 , Đỗ Văn Thu 2 Lê Thành Đô 2 1 Trung tâm Nghiên cứ Dê và Thỏ Sơn Tây ; 2 Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Summary In Vietnam the studying on Artificul insumenation (AI) are pay attention by evry one now. Technology of AI by using strow semen is very nesseseries for crossed breeding and maitend genetic of goat breeds in Vietnam. There for up to now these technologies have not study and apply well in Vietnam. The results of it are only 30-35%. So studying on technologies of AI have been done in Vietnam. The results of studied from Junuary to December 2006 in Goat and Rabbit research Center showed that: Activities of sperm is more than 35%; Using hot water is in 37oC with time is 60 secon for prepearing semen ; Apply method mating with using one peple keeping goat; Duration mating for goat is 8 hours ; That will be get very good resul (66.6% interest) 1. Đặt vấn đề Trên thế giới từ đầu thế kỷ XX, việc ứng dụng thụ tinh nhân tạo vào chăn nuôi dê phát triển mạnh, nhất là ở các nớc Nga, Mỹ, Anh, Pháp, Đan Mạch và Hà Lan. Cho đến nay nh Pháp trên 90% đàn dê đợc phối TTNT bằng tinh đông lạnh cọng rạ. ở Việt Nam nghiên cứu TTNT cho dê đang là vấn đề đợc nhiều ngời quan tâm, Kỹ thuật TTNT cho dê bằng tinh cọng rạ tinh đông lạnh là nhu cầu cần thiết trong công tác lai tạo giống dê. Công nghệ đông lạnh lu giữ tinh trùng lâu dài trong nitơ lỏng (-196 o C) góp phần khai thác triệt để tiềm năng sinh sản của đực giống, nhất là đực giống cao sản, mở rộng phạm vi thụ tinh, góp phần lu giữ quỹ gen và tính đa dạng sinh học các giống dê Việt Nam, giúp cho xuất nhập khẩu và thơng mại giống dễ dàng, tránh cận huyết và dịch bệnh, tránh đợc sự chênh lệch về khối lợng cơ thể, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho chăn nuôi. Tuy vậy vấn đề này cha đợc đầu t nghiên cứu áp dụng ở nớc ta. Kết quả áp dụng kỹ thuật TTNT cho dê bằng tinh đông lạnh mới chỉ đạt 30-35% vì vậy nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nâng cao kết quả TTNT cho dê bằng tinh đông lạnh cọng rạ là nhu cầu bức thiết của sản xuất đặc biệt trong công tác lu giữ nguồn gene để lai tạo giống dê ở nớc ta Với lý do trên chúng tôi đã thực hiện đề tài Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nâng cao kết quả TTNT cho dê bằng tinh đông lạnh cọng rạ" 2. Vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu Vật liệu: sử dụng tinh dê đông lạnh cọng rạ thuộc các giống dê: Boer, Alpine, Saanen, Barbary, Beetal, Jumnabari, Bách Thảo. Tinh đông lạnh cọng rạ đợc nghiên cứu sản xuất bởi sự kết hợp giữa Trung Tâm Nghiên Cứu Dê và thỏ Sơn Tây, Viện Khoa Học Việt Nam, Trung tâm tinh đông lạnh Moncada năm 2004- 2005-2006 với 5000 liều đợc bảo quản trong Nitơ lỏng - 196 0 C. Chất lợng tinh đông lạnh cọng rạ khi bảo quản: hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh 30 - 55%, số lợng tinh trùng trong một cọng rạ 62,74 - 85,98 triệu. Địa điểm nghiên cứu: đề tài đợc thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây. Thời gian nghiên cứu: 1/1/2006 - 31/12/2006 3. Nội dung và phơng pháp nghiên cứu nghiên cứu 3.1. Nội dung nghiên cứu - ảnh hởng của hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh đến tỷ lệ thụ thai - ảnh hởng của phơng pháp giải đông đến hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh - ảnh hởng thời điểm phối giống thích hợp đối với dê cáitỷ lệ thụ thai - ảnh hởng của các phơng pháp phối giống đến tỷ lệ thụ thai 3.2. Phơng pháp nghiên cứu ảnh hởng của hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh đến tỷ lệ chửa: Chọn những cọng tinh của cùng một con đực, đợc sản xuất cùng một ngày, dùng kéo cắt bỏ hai đầu, lấy một giọt tinh dịch đặt lên phiến kính sạch, và có nhiệt độ (30 - 35 0 C). Dùng một lá kính khô, sạch đậy lên giọt tinh dịch, sao cho giọt tinh dịch đợc dàn đều ra 4 cạnh của lá kính. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi (Olympus) và xem với độ phóng đại 200 - 400 lần. Khi kiểm tra hoạt lực tinh trùng, tiêu bản đợc sởi ấm ở 38 - 40 0 C Chọn những cọng tinh của cùng một đực giống, đợc sản xuất trong một năm do hoạt lực tinh trùng khi đông lạnh đợc khai thác ở khác nhau, mùa vụ khác nhau dẫn đến hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh cũng khác nhau. Sau khi kiểm tra hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh bằng kính hiển vi, sau đó tiến hành mang phối cho dê cái động dục tự nhiên, thí nghiệm đợc chia thành 3 lô, mỗi lô 6 con; lô 1 chọn những cọng tinh có hoạt lực sau đông lạnh nhỏ hơn hoặc bằng 30%; lô 2 chọn những cọng tinh có hoạt lực sau đông lạnh bằng 35%; lô 3 chọn những cọng tinh có hoạt lực sau đông lạnh lớn hơn hoặc bằng 40%. ảnh hởng của các phơng pháp giải đông tinh đông lạnh đến tỷ lệ thụ thai Dựa phơng pháp giải đông của Visser (1974); Olar (1977), tinh đông lạnh đợc giải đông ở nhiệt độ: 20 o C; 37 o C; 42 o C, với các khoảng thời gian: 30; 60; 90; 120 giây. Xác định hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh, theo dõi hoạt lực tinh trùng trong thời gian ủ ở 37 o C. Chọn những cọng tinh của cùng một con đực, đợc sản xuất cùng một ngày , ở các mức nhiệt độ khác nhau chúng tôi đã tiến hành giải đông 15 lần, sau đó kiểm tra hoạt lực sau đông lạnh bằng kính hiển vi và tiến hành mang phối cho dê cái động dục tự nhiên ảnh hởng của thời điểm phối giống thích hợp đến tỷ lệthụ thai Dùng dê đực sinh sản, khoẻ mạnh, hăng sử dụng khố vải buộc lấy dơng vật sau đó đa đến đàn dê cái để kiểm tra vào lúc 7 giờ sáng hàng ngày. Nếu thấy con đực theo con cái đây là biểu hiện động dục, khi con cái có biểu hiện đứng lai đuôi ngoe nguẩy chờ phối thì đây là biểu hiện động dục; khi dê cái không chịu đây là thời gian hết động dục. Rất sớm Tốt Rất tốt Muộn Rất muộn 0 6 12 18 24 30 36 Trứng rụng ảnh hởng của các phơng pháp phối giống đến tỷ lệ thụ thai Dựa theo phơng pháp phối giống của Ritar (1990), Chemineau (1991), Corteel (1977): dùng súng bắn tinh bơm tinh dịch vào trong tử cung với độ sâu 1,5 - 3,0 cm, phối lặp (2 lần). Phơng pháp 1: có sử dụng mỏ vịt, để dê ở t thế tự nhiên. Phơng pháp 2: có sử dụng mỏ vịt, có giá đỡ kê ngang giữa phần bụng và hai chân sau. Phơng pháp 3: có sử dụng mỏ vịt kết hợp có ngời giữ hoặc treo hai chân sau của dê lên. Tỷ lệ chửa đợc xác định theo chu kỳ động dục của dê cái, số liệu đợc thu thu thập hàng ngày và đợc sử lý trên phần mềm trên Minitab 13 Mô hình toán học: Yi = M +ai+ ei Trong đó: Yi là các giá trị theo dõi M: là giá trị trung bình ai là: giống, các phơng pháp phối giống, khoảng cách giữa hai lần phối giống ei : các giá trị sai số . Kết quả và thảo luận . ảnh hởng của hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh đến tỷ lệ thụ thai Sau khi kiểm tra hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh bằng kính hiển vi, thí nghiệm đợc chia thành 3 lô, mỗi lô 6 con; lô 1 chọn những cọng tinh có hoạt lực sau đông lạnh nhỏ hơn hoặc bằng 30%; lô 2 chọn những cọng tinh có hoạt lực sau đông bằng 35%; lô 3 chọn những cọng tinh có hoạt lực sau đông lạnh lớn hơn hoặc bằng 40%, đem phối cho dê cái động dục tự nhiên, kết quả thể hiện ở bảng 1. Bảng 1 . ảnh hởng của hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh đến tỷ lệ thụ thai Lô thí nghiệm Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh (%) n Số con Tổng số con phối (lần) Số con chửa (con) Tỷ lệ chửa % Lô 1 30 6 6 2 33,3 Lô 2 35 6 6 3 50,0 Lô 3 40 6 6 4 66,7 T B 50,0 Kết quả ở bảng 1 cho thấy ở lô 1 có hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh nhỏ hơn hoặc bằng 30% có tỷ lệ chửa đạt thấp nhất 33,3%, ở lô 3 cho kết quả cao nhất đạt 66,7 % nh vậy hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh đã ảnh hởng tới tỷ lệ thụ thai và trong TTNT cho dê nên sử dụng những cọng tinh có hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh từ 30% trở lên. Kết quả về hoạt lực tinh trùng có liên quan đến khả năng thụ tinh của tinh trùng. Theo Corteel (1977), hoạt lực tinh trùng có liên quan đến tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng. Tinh trùng có hoạt lực tốt thì đạt tỷ lệ thụ tinh cao. . Kỹ thuật giải đông tinh dê đông lạnh Chất lợng tinh trùng sau đông lạnh, không chỉ phụ thuộc các yếu tố nh phẩm chất tinh dịch, môi trờng đông lạnh, kỹ thuật đông lạnh, mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ và thời gian giải đông tinh đông lạnh. Chúng tôi tiến hành giải đông tinh đông lạnh của dê Beetal và Barbari ở nhiệt độ 20 o C, 37 o C, 42 o C, trong 30; 60; 90; 120 giây, xác định hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh tinh dịch. Sau khi xác định đợc khoảng thời gian giải đông thích hợp đối với từng nhiệt độ giải đông, cho hoạt lực tinh trùng sau giải đông cao, tinh dịch sau giải đông đợc ủ ở 37 o C và kiểm tra hoạt lực tinh trùng ở các thời điểm sau giải đông: 0; 2; 4; 6 giờ. Kết quả trình bày ở bảng 2 và đồ thị 1, đồ thị 2. Bảng 2 . ảnh hởng của phơng pháp giải đông đến hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh Hoạt lực tinh trùng (%) khi kiểm tra Nhiệt độ giải đông Trung bình n lần 30 giây 60 giây 90 giây 120 giây 20 o C 21,05 15 10,0 a 2,1 19,5 b 3,8 24,4 c 3,9 30,3 d 3,9 37 o C 37,53 15 34,6 a 4,5 39,0 b 3,7 38,6 b 3,7 38,0 b 4,1 42 o C 36,45 15 36,4 a 4,7 38,7 a 4,3 37,2 a 4,1 33,2 b 4,8 Hoạt lực tinh sau khi sản xuất: 38,98 7,89 (%) Qua bảng 2 cho thấy kết quả của chúng tôi tơng đơng và thấp hơn kết quả nghiên cứu của Đỗ Văn Thu, 2000, tại nhiệt độ 20 o C đạt 21,25%; tại nhiệt độ 37 o C trung bình: 42,45%; tại nhiệt độ 42 o C trung bình đạt 40%. Đồ thị 1 . Hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh ứng với nhiệt độ giải đông Đồ thị 2 . Hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh ứng với thời gian giải đông ở 37 C 36.4 39 38.6 38 20 30 40 30 60 90 120 Thời gian (giây) A% Kết quả ở bảng 2 cho thấy: hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh chịu ảnh hởng của nhiệt độ và thời gian giải đông tinh đông lạnh. Cùng nhiệt độ nhng thời gian giải đông khác nhau, có ảnh hởng lên họat lực tinh trùng sau đông lạnh 21.05 37.53 36.45 0 10 20 30 40 20oC 37oC 42oC Nhiệt độ A% khác nhau. Tinh dịch giải đông trong khoảng thời gian nh nhau, nhng nhiệt độ giải đông khác nhau, thu đợc hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh khác nhau. Giải đông tinh đông lạnh ở nhiệt độ 20 o C trong khoảng thời gian 120 giây, cho hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh (30%) cao hơn hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh trong trờng hợp giảm thời gian giải đông (30, 60, 90 giây). Giải đông tinh đông lạnh ở 37 o C: Hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh 37,53% (chung cho các khoảng thời gian giải đông) cao hơn không rõ rệt so với hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh, khi giải đông ở 42 o C: (36,45%), nhng cao hơn rất rõ rệt (P 0,001) so với hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh, khi giải đông ở 20 0 C (21,05%). Tinh đông lạnh giải đông ở nhiệt độ 37 o C cho hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh cao nhất với thời gian giải đông là 60 giây, và khác nhau không rõ (P 0,05) so với khoảng thời gian giải đông 90 và 120 giây (38,6%; 38,0%). Tinh đông lạnh giải đông ở nhiệt độ 42 o C cho hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh cao khi thời gian giải đông là 60 giây (38,7%) và 90 giây (37,2%). Tinh đông lạnh giải đông ở nhiệt độ 42 o C trong 120 giây, cho hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh (33,2%) kém hơn so với thời gian giải đông 60; 90 giây. Hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh khác nhau không rõ khi giải đông tinh đông lạnh với thời gian giải đông 60 giây hoặc 90 giây ở nhiệt độ 37 o C so với 42 o C. Kết quả chúng tôi nhận đợc phù hợp với kết quả của các tác giả (Corteel (1974); Ritar (1982), (1983); Deka (1986); Chemineau (1991); Singh (1995); Tuli (1995) ), cho rằng giải đông tinh đông lạnh dê ở nhiệt độ 37 - 40 o C, trong khoảng thời gian 12 - 120 giây. Smirnov (1974) đã khẳng định sự phụ thuộc trực tiếp của phần trăm tinh trùng vận động sau đông lạnh vào tốc độ giải đông. Deka (1987) nhận thấy: hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh cao có ý nghĩa thống kê khi giải đông nhanh so với giải đông chậm, nhng giải đông nhanh hay chậm, ảnh hởng không có ý nghĩa thống kê đối với tỷ lệ acrosom h hỏng. Nh vậy phơng pháp giải đông tinh đông lạnh ảnh hởng trực tiếp đến sức sống tinh trùng, vì vậy ảnh hởng đến khả năng thụ tinh của tinh trùng. 4.3. ảnh hởng của thời điểm phối thích hợp đến tỷ lệ thụ thai Dê cái có chu kỳ động dục bình quân là 17 ngày (16-18 ngày). Động dục ở dê xảy ra trong khoảng 1,5-3 ngày, phổ biến là 18-24 giờ, nhng thời gian phối có chửa chỉ kéo dài 10-12 giờ, do vậy việc phát hiện động dục là vô cùng cần thiết. Ngoài việc chọn ghép đôi giao phối thích hợp, tránh đồng huyết thì TTNT đúng thời điiểm là rất quan trọng, tỷ lệ thụ thai của dê cái đợc quyết định bởi: số lợng và chất lợng tinh trùng, kỹ thuật giải đông, kỹ thuật phối, thời điểm phối giống thích hợp Thời gian phối giống thích hợp Bảng 3. Kết quả xác định thời điểm phối thích hợp Thời gian Tổng số con phối (con) Số con phối chửa (con) Tỷ lệ chửa % 12 giờ 14 9 64.29 18 giờ 15 10 66.67 24 giờ 12 4 30,77 30giờ 11 2 18.8 c Trong đó thời điểm phối giống thích hợp cho dê là quan trọng nhất, dê thờng động dục về đêm, thời gian động dục là 1 ngày, kết quả ở bảng 3 cho thấy thời gian phối thích hợp từ 12 và 18 giờ tỷ lệ chửa đạt: 64,29- 66,67%, và phối tại 24, 30 giờ muộn do vậy tỷ lệ thụ thai không cao đạt 18,8-30,77%. 4.4. ảnh hởng của phơng pháp phối giống đến tỷ lệ thụ thai Các phơng pháp phối giống Để TTNT cho dê đạt kết quả cao chúng tôi đã tiến hành phối thử nghiêm Với các phơng pháp sau: Phơng pháp 1: có sử dụng mỏ vịt, để dê ở t thế tự nhiên. Phơng pháp 2: có sử dụng mỏ vịt, có giá đỡ kê ngang giữa phần bụng và hai chân sau. Phơng pháp 3: có sử dụng mỏ vịt kết hợp có ngời giữ hoặc treo hai chân sau của dê lên. Kết quả thể hiện ở bảng 4. Bảng 4 . Kết quả các phơng pháp phối giống Các phơng pháp phối giống Tổng số con phối (con) Số con phối có chửa (con) Tỷ lệ chửa (%) Phơng pháp 1 16 3 18.75 Phơng pháp 2 15 4 26.67 Phơng pháp 3 14 14 64.29 Kết quả cho thấy đối với phơng pháp thứ nhất khó thực hiện đợc vì tầm vóc của dê nhỏ và do cấu tạo đờng sinh dục của dê cái cong do vậy không quan xát rõ cổ tử cung và khó thao tác dẫn đến tỷ lệ chửa thấp đạt 18,75%. Phơng pháp thứ 2: kết quả cho thấy khi sử dụng giá đỡ đã tỳ vào bụng dẫn đến khó quan xát cổ tử cung, đồng thời dê cái luôn ở trạng thái cỡng bức, do vậy khi sử dụng phơng pháp này thờng khó thao tác. Phơng pháp thứ 3 cho thấy khi có ngời cố định dê nh vậy thì quan xát cổ tử cung rất rõ ràng, thao tác nhẹ nhàng và dê cái không có phản ứng mãnh liệt, do vậy phơng pháp thứ 3 là phơng phơng pháp thích hợp đạt kết quả cao nhất 64,29%. ảnh hởng của khoảng cách giữa hai lần phối giống Thời gian và khoảng cách giữa hai lần phối giống cũng có ảnh hởng tới tỷ lệ thụ thai, kết quả đựa thể hiện ở bảng 5. Bảng 5 . Thời gian và khoảng cách giữa hai lần phối giống Khoảng cách giữa hai lần phối Tổng số lần phối (con) Tổng số lần phối có chửa (con) Tỷ lệ chửa (%) 4 giờ 14 8 57,1 8 giờ 15 10 66,6 12 giờ 9 4 44,4 Kết quả ở bảng 5 cho thấy khoảng cách giữa hai lần phối là 8 giờ cho kết quả tốt nhất đạt 66,6 %, thấp nhất kết quả ở bảng 5 phù hợp với các tác giả Trịnh Thị Kim Thoa, Đỗ Văn Thu, Nguyễn Anh, 1999. Qua kết quả phối giống thì giống dê Boer và giống dê Alpine cho kết quả cao nhất đạt 58,7 % và trung bình đạt 62,31%. . Kết luận và đề nghị . Kết luận Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh cần đảm bảo hoạt lực là:35% trở lên thì tỷ lệ thụ thai đạt 50%. ảnh hởng của phơng pháp giải đông tinh dịch dê: Tinh đông lạnh giải đông ở nhiệt độ 37 o C cho hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh cao nhất đạt 38,6% với thời gian giải đông là 60 giây, hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh khi giải đông ở nhiệt độ 20 0 C thấp nhất đạt (21,05%). ảnh hởng của các phơng pháp phối giống: sử dụng phơng pháp có ngời giữ nâng cao một góc khoảng 45 o . ảnh hởng của khoảng cách giữa hai lần phối giống: khoảng cách phối giữa lần thứ nhất cách nhau 8 giờ cho kết quả cao nhất đạt tỷ lệ chửa 66,6%. 5.2. Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện các phơng pháp thụ tinh nhân tạo cho dê bằng tinh đông lạnh cọng rạ. Mở rộng mạng lới thụ tinh nhân tạo cho dê bằng tinh đông lạnh cọng rạ vào các vùng trong cả nớc. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Tấn Anh, Đinh Văm Bình, Nguyễn Kim Lin, 1995. Một số kết quả bớc đầu nghiên cứu về dê đực Bách Thảo. Tạp chí Khoa học - Công nghệ và Quản lý kinh tế. 8. 1995. Trang 296- 297. 2. Trịnh Thị Kim Thoa, Đỗ Văn Thu, Nguyễn Anh, 1999. Nghiên cứu quy trình công nghệ bảo quản tinh dịch dê và kết quả bớc đầu về thụ tinh nhân tạo bằng tinh đông lạnh. Hội nghị công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội 1999, Trang 1005 - 1011. 3. Trịnh Thị Kim Thoa, Đỗ Văn Thu, 1997. Nghiên cứu công nghệ sản xuất tinh đông lạnh dê. Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học - Trung tâm KHTN và CNQG. Trang 462 - 467 4. Artificial insemination in Canada. Annual Report 1987. 1988, 22pp. Ottawa, Canada. 5. Chemineau P. and Cagnié, Y. 1991. Training manual on artificial insemination in sheep and goats. FAO. Animal Production and Health, paper 83 - Rome 1991. Corteel J.M, 1977. Production, storage and insemination of goat semen. Proceedings of the Symposium: Management of Reproduction in Sheep and Goat, S., Jul. 24-25, Madison. . t nghiên cứu áp dụng ở nớc ta. Kết quả áp dụng kỹ thuật TTNT cho dê bằng tinh đông lạnh mới chỉ đạt 30-35% vì vậy nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nâng cao kết quả TTNT cho dê bằng tinh đông. Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nâng cao kết quả thụ tinh nhân tạo cho dê bằng tinh đông lạnh cọng rạ Đinh Văn Bình 1 , Chu Đức Tụy 1 , Đỗ Văn Thu 2 Lê Thành Đô 2 1 Trung tâm Nghiên. pháp kỹ thuật nâng cao kết quả TTNT cho dê bằng tinh đông lạnh cọng rạ& quot; 2. Vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu Vật liệu: sử dụng tinh dê đông lạnh cọng rạ thuộc các giống dê: Boer,