Phân tích tính đa hình gen hormon sinh trởng và gen thụ thể của một số giống bò nuôi ở Việt Nam Trần Xuân Hoàn 1 , Đinh Đoàn Long 2 Nguyễn Thị Quỳnh Châu 1 và Phạm Phơng Mai 1 1 Viện Chăn Nuôi, 2 Trờng đại học Khoa học và Tự nhiên Hà Nội Summary Two genes were selected to study the polymorphism including GH gene and GHR gene. Studying on Hybrid dairy cows, HF dairy cows and bulls. Three pair of PCR primers were used to amplify GH gene (329 bp and 223 bp) and GHR gene (836 bp): GH1, GH2 and GHR1, respectively. The PCR products of GH gene (GH1 and GH2) and GHR gene were digested by restriction enzymes MspI, AluI. The digesting products were identified by agarose gel electrophoresis. The frequencies of GH, GHR genotypes in hybrid dairy cows and HF dairy cows and bulls were quite different: in hybrid dairy cows, the frequency of AB genotype (GH1) was quite high 0.4838 and when amplified with GH2 primer in GH gene, the frequency of LL genotype was high 0.925 and three genotypes for GHR1 primer had the approximate frequencies. In HF dairy cows, the frequencies of AA, LL genotypes were very high 0.875, 0.833, respectively and +/- genotype of GHR gene was 0.62. For bulls, the heterozygote genotypes were very high: 100% for GH gene and 71,24% for GHR gene. From the results of many researchers showed that the AA LL genotype in dairy cows had high milk production, in which our dairy cows almost had this genotype. 1. Đặt vấn đề Hiện nay, chăn nuôi bò để lấy sữa đang là một nghề rất phổ biến và đợc tiến hành trên nhiều tỉnh thành trong cả nớc. Chọn lọc ra bò có tiềm năng di truyền cho năng suất và chất lợng sữa cao để nâng cao hiệu quả chăn nuôi bò sữa là thiết thực. Với sự phát triển nhanh của các ngành khoa học đặc biệt là công nghệ sinh học, cho phép chúng ta có thể nghiên cứu sâu đến mức độ phân tử, đánh giá đợc tiềm năng di truyền các gen của vật nuôi. Gần đây, nhiều gen có tiềm năng đã đợc phát hiện có ảnh hởng tới các quá trình sinh lý và tính trạng sản xuất. Một trong số các gen đã đợc chọn để tiến hành nghiên cứu là gen hormon sinh trởng (GH) ở bò. Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu về đa hình gen GH ở bò, cho thấy gen này có ảnh hởng đến nhiều tính trạng sản xuất, trong đó có năng suất sữa. Andrzej Dybus (2002) đã tiến hành nghiên cứu đa hình gen hormone sinh trởng của bò Đen-Trắng, kết quả cho thấy có ảnh hởng tới các tính trạng sản xuất sữa của bò. Zhou và CS (2005), nghiên cứu gen GH cho thấy đa hình gen có liên quan với các tính trạng sản xuất sữa ở bò Holstein Bắc Kinh. Lucy (1996) và Yao (1996) đã phát hiện hai điểm đa hình nằm trong exon 5 của gen GH có ảnh hởng tới tính trạng sản xuất sữa. Trong các hoạt động sinh lý sinh hóa, hormon sinh trởng liên kết với một loại protein gọi là thụ thể (GHR) trên màng tế bào, để kích hoạt các enzym trong quá trình trao đổi chất. Sự tơng tác thích hợp giữa GH và GHR sẽ đem lại hiệu quả cao trong các quá trình sinh lý sinh hóa của cơ thể, do đó cũng đã có một số công trình nghiên cứu đa hình gen GHR. Theo nghiên cứu của Aggrey và CS (1999) cho thấy những đột biến trong trình tự của vùng điều hoà (vùng 5) của gen GHR cho thấy có liên quan đến các tính trạng sản xuất sữa ở bò đực Holstein. Viitala (2006) kết luận rằng tính trạng sản xuất ở bò Finnish Ayrshire bị ảnh hởng bởi các đột biến trong gen GHR. Theo Zhou (2006) đột biến ở exon 8 của gen bGHR có ảnh hởng đến sản lợng sữa của bò. Từ những kết quả thu đợc của các nhà nghiên cứu, với mục đích tìm hiểu ảnh hởng của đa hình gen GH và GHR của một số giống bò sữa ở Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: Phân tích tính đa hình gen hormon sinh trởng và gen thụ thể của một số giống bò nuôi ở Việt Nam. 2. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Đối tợng nghiên cứu Đối tợng: Nghiên cứu tổng số 100 con bò gồm +14 bò đực giống nuôi ở trung tâm tinh đông lạnh Moncada + 62 bò sữa lai nuôi ở Trung tâm nghiên cứu Bò và đồng cỏ Ba Vì + 24 bò sữa thuần nuôi ở Công ty giống bò sữa Mộc Châu 2.2. Phơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Lấy mẫu máu Máu bò lấy khoảng 0,5 ml và đợc chống đông bằng dung dịch 0,5 M EDTA theo tỷ lệ 1 EDTA: 20 máu. 2.2.2. Tinh sạch ADN Mỗi mẫu máu đã đợc chống đông lấy 200 àl tách ADN theo kit của hãng Fermentas. 2.3. Phản ứng PCR - Sử dụng cặp mồi ký hiệu là GH1 (Hứj 1993) để nhân vùng intron 3 của gen GH có trình tự nh sau: 5-CCCACGGGCAAGAATGAGGC-3 Xuôi 5-TGAGGAACTGCAGGGGCCCA-3 Ngợc Chu trình nhiệt: Sau khi biến tính ở 94 o C 5, thực hiện phản ứng 35 chu kỳ nh sau: 94 o C 1 , 60 o C 50 s, 72 o C 1. Sau đó kết thúc ở 72 o C trong 10. - Sử dụng cặp mồi ký hiệu là GH2 (Schlee, 1994) để nhân vùng exon 5 của gen GH có trình tự nh sau: 5-GCTGCTCCTGAGGGCCCTTCG-3 Xuôi 5-GCGGCGGCACTTCATGACCCT-3 Ngợc Chu trình nhiệt: Sau khi biến tính ở 94 o C 3, thực hiện phản ứng 35 chu kỳ nh sau: 94 o C 1 , 61 o C 1, 72 o C 1. Sau đó kết thúc ở 72 o C trong 5. - Sử dụng cặp mồi ký hiệu là GHR1 (Heap 1995) để nhân vùng 5 (vị trí 1871 đến 1036) của gen GHR có trình tự nh sau: 5-TGCGTGCACAGCAGCTCAACC-3 Xuôi 5-AGCAACCCCACTGCTGGGCAT-3 Ngợc Chu trình nhiệt: Sau khi biến tính ở 94 o C 10, thực hiện phản ứng 35 chu kỳ nh sau: 92 o C 1, 66 o C 80 s, 72 o C 2. Sau đó kết thúc ở 72 o C trong 5. 2.4. Sản phẩm PCR đợc cắt bằng enzym giới hạn: - Sản phẩm PCR từ cặp mồi GH1 đợc cắt bởi enzym MspI - Sản phẩm PCR từ cặp mồi GH2 đợc cắt bởi enzym AluI - Sản phẩm PCR từ cặp mồi GHR1 đợc cắt bởi enzym AluI 2.5. Điện di trên gel agarose Xác định đa hình ADN: Sản phẩm PCR từ cặp mồi GH1, GH2 và GHR1 đ- ợc cắt bằng enzym , độ lớn các đoạn ADN đợc xác định bằng phơng pháp điện di trên thạch agarose 2% (2,5%), nhuộm bằng ethidium bromide với điện thế là 65v trong 60 phút trên hệ đệm TBE 1X. Các băng điện di đợc đối chứng với các thang ADN chuẩn . Xác định kiểu gen cho từng cá thể dựa vào kết quả điện di. Địa điểm nghiên cứu: tại phòng thí nghiệm trọng điểm Viện Chăn Nuôi. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả phản ứng PCR Sản phẩm PCR nhân lên từ ba cặp mồi GH1, GH2 và GHR1 có kích thớc tơng ứng là 329 bp, 223 bp và 836 bp phù hợp với kết quả mong đợi . Kết quả đợc trình bày ở Hình 1. 1 2 3 4 5 6 M Hình 1. Sản phẩm PCR đợc nhân lên từ các cặp mồi M: Marker; 1,2: PCR mồi GH2; 3,4: PCR mồi GH1; 5,6: PCR mồi GHR1 3.2. Tính đa hình gen GH 3.2.1 Sản phẩm PCR từ cặp mồi GH1 khi cắt bằng MspI sẽ thu đợc 3 kiểu gen tơng ứng nh sau: AA khi chạy điện di thu đợc 2 băng có kích thớc là 224 bp và 105 bp, AB thu đợc 3 băng có kích thớc là 329 bp, 224 bp và 105 bp và BB thu đợc 1 băng 329 bp. 200bp bp 223 bp 329 bp 836 bp Kết quả cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GH1 đợc thể hiện ở Hình 2. 1 2 3 4 5 6 7 M Hình 2 . Sản phẩm PCR từ cặp mồi GH1 cắt bằng MspI M: Marker; 1: PCR cặp mồi GH1; 2: một băng; 3,4,6: hai băng; 5,7: ba băng. Sau khi sử dụng enzym cắt giới hạn MspI cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GH1 của 100 bò, chúng tôi thấy mức độ đa hình có sự khác nhau giữa các giống bò. Kết quả đợc trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Các kiểu gen GH đợc nhân lên bằng cặp mồi GH1 của bò Đối tợng bò n (số cá thể) Tỷ lệ kiểu gen AA (%) Tỷ lệ kiểu gen AB (%) Tỷ lệ kiểu gen BB (%) Bò sữa lai 62 41,94 48,38 9,68 Bò sữa thuần 24 87,50 8,30 4,20 Bò đực 14 0 100 0 Qua bảng 1 cho thấy trong đàn bò sữa lai nuôi ở Trung tâm nghiên cứu bò và đồng cỏ Ba Vì có tần số kiểu gen đồng hợp AA chiếm tỷ lệ khá cao 41,94%, kiểu gen AB chiếm tỷ lệ cao nhất 48,38% và thấp nhất là kiểu gen BB chiếm tỷ lệ 9,68%. Trong khi đó bò sữa HF thuần nuôi ở Mộc Châu có kiểu gen AA chiếm tỷ lệ cao nhất 87,5% và thấp nhất cũng là kiểu gen BB 4,2%. Nhng bò đực giống thuần và lai tất cả chỉ mang kiểu gen AB. Zhou (2005) sử dụng MspI để phân tích đoạn gen nhân lên từ cặp mồi GH1 trên đàn bò Holstein Bắc Kinh cho thấy kiểu gen AA, AB và BB có tần số tơng ứng là 0,77; 0,21 và 0,02. Tác giả cho biết bò HF mang kiểu gen AA có năng suất sữa cao hơn so với các cá thể có kiểu gen AB và BB trong cả 3 chu kỳ I, II và III. Qua những kết quả ban đầu trên cho thấy bò đực giống mang kiểu gen AB là 100%, nên ở đàn bò lai kiểu gen AB chiếm tỷ lệ cao nhất. Trong đàn bò thuần HF tuy số n còn nhỏ, nhng khả năng đàn bò sữa HF nuôi tại Mộc Châu đã đợc chọn lọc tơng đối tốt, nên tần số kiểu gen AA chiếm tỷ lệ cao nhất. So với bò HF của Bắc Kinh, đàn bò của chúng ta có tỷ lệ kiểu gen BB khá cao. Để đánh giá mức độ ảnh hởng của kiểu gen AA tới năng suất sữa của bò cần tiếp tục phân tích số lợng mẫu nhiều hơn và thu thập năng suất sữa của từng cá thể để tìm mối liên quan của kiểu gen với tính trạng này. 3.2.2. Cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GH2 bằng AluI sẽ thu đợc ba kiểu gen tơng ứng nh sau: LL khi chạy điện di thu đợc 2 băng có kích thớc là 171 bp và 52 bp, LV thu đợc 3 băng có kích thớc là 223 bp, 171 bp và 52 bp và VV thu đợc 1 băng là 223 bp. Kết quả chạy điện di cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GH2 bằng AluI đợc thể hiện ở hình 3. 1 2 3 4 5 6 7 M Hình 3. Sản phẩm PCR từ cặp mồi GH2 cắt bằng AluI M: Marker; 1: PCR cặp mồi GH2; 2,3,4,6,7: hai băng; 5: một băng. Kết quả các kiểu gen thu đợc sau khi sử dụng enzym cắt giới hạn AluI phân tích đa hình trong đoạn gen nhân lên từ cặp mồi GH2 trên tổng số 100 con bò trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Các kiểu gen GH đợc nhân lên bằng cặp mồi GH2 của bò Đối tợng bò n (Số cá thể) Tỷ lệ kiểu gen LL (%) Tỷ lệ kiểu gen LV (%) Tỷ lệ kiểu gen VV (%) Bò sữa lai 62 95,2 3,2 1,6 Bò sữa thuần 24 83,30 12,50 4,20 Bò đực 14 0 100 0 Qua bảng 2 cho thấy bò sữa lai và bò sữa HF thuần có kiểu gen LL chiếm tỷ lệ cao nhất 95,2% và 83,3% tơng ứng. Kiểu gen VV ở cả hai giống bò cũng chiếm tỷ lệ thấp nhất 1,6% và 4,2% tơng ứng. Nhng bò đực giống cũng chỉ có một kiểu gen LV. Andrzej Dybus (2002) cho biết bò đen-trắng Ba lan có kiểu gen LL chiếm tỷ lệ cao nhất 65,3% và thấp nhất là kiểu gen VV 2,3%. Tác giả cho biết bò mang kiẻu gen LL cho năng suất sữa cao hơn so với kiểu gen LV và VV. Theo Lucy (1996) bò Holstein-Friesian mang kiểu gen LL có năng suất sữa cao hơn bò có kiểu gen LV. Qua kết quả phân tích đa hình gen GH của đàn bò sữa lai và bò sữa thuần HF cho thấy bò đực giống chỉ có một kiểu gen dị hợp tử, nhng bò sữa có kiểu gen đồng hợp LL khá cao ở cả hai giống, điều này cho thấy khả năng kiểu gen này có ảnh hởng đến kiểu hình nên đàn bò của chúng ta đã đợc chọn lọc khá tốt, dẫn đến các kiểu gen cho năng suất sữa cao đã chiếm tỷ lệ cao nhất. 3.3. Tính đa hình gen GHR 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14 15 Hình 4. Sản phẩm PCR từ cặp mồi GHR1 cắt bằng AluI M: Marker; 1,8: PCR mồi GHR1; 2,9,10: bốn băng; 3,4,5,13: hai băng; 6,7,11,12,14,15: ba băng. Trong đoạn gen GHR nhân lên từ cặp mồi GHR1 có chứa 3 điểm cắt bằng AluI, nhng chỉ có một điểm cắt là đa hình. Do đó sử dụng AluI cắt sản phẩm PCR nhân lên từ cặp mồi GHR1 của gen GHR sẽ thu đợc 3 kiểu gen với những băng có kích thớc nh sau. Kiểu gen +/+ thu đợc 4 băng có kích thớc là 602 bp, 145 bp, 75 bp và 14 bp. Kiểu gen +/- thu đợc 5 băng có kích thớc là 747 bp, 602 bp, 145 bp, 75 bp và 14 bp. Kiểu gen -/- thu đợc 3 băng 747 bp, 75 bp và 14 bp. Nhng khi điện di trên gel agarose băng 14 bp không nhìn thấy. Kết quả chạy điện di cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GHR1 bằng AluI đợc thể hiện ở hình 4. Kết quả về tần số các kiểu gen GHR thu đợc khi cắt sản phẩm PCR bằng AluI trên tổng số 100 con bò trình bày ở bảng 3. Bảng 3. Các kiểu gen GHR đợc nhân lên bằng cặp mồi GHR1 của bò Đối tợng bò n (Số cá thể) Tỷ lệ kiểu gen +/+ (%) Tỷ lệ kiểu gen +/- (%) Tỷ lệ kiểu gen - /- (%) Bò sữa lai 62 30,65 32,26 37,09 Bò sữa thuần 24 17,00 62,00 21,00 Bò đực 14 14,29 71,42 14,29 Qua bảng 3 cho thấy kiểu gen GHR dị hợp tử chiếm tỷ lệ khá cao ở cả bò sữa lai, bò sữa HF và bò đực giống. Sự phân bố 3 kiểu gen GHR khá đồng đều ở bò sữa lai. Trong khi đó ở bò đực giống và bò sữa thuần kiểu gen dị hợp tử +/- chiếm tỷ lệ cao nhất 71,42% và 62% tơng ứng. Aggrey (1999) sử dụng AluI phân tích đa hình đoạn gen nhân lên từ cặp mồi GHR1 của gen GHR trên bò đực giống cho thấy tỷ lệ kiểu gen -/- là 43,28% ; kiểu gen +/- 40,30% ; kiểu gen +/+ 16,42%. Theo tác giả bò đực có kiểu gen +/+ có giá trị giống về mỡ sữa cao hơn bò -/ Qua các kết quả trên cho thấy bò đực giống chủ yếu mang kiểu gen dị hợp, nên bò sữa lai mang các kiểu gen -/- khá cao là hoàn toàn phù hợp với quy luật di truyền là do các cặp mẹ và con gái đã đợc phân tích kiểu gen. Điều này cho thấy khả năng ảnh hởng của gen này lên kiểu hình là không nhiều nên ảnh hởng của chọn lọc trong chăn nuôi bò sữa đến tần số xuất hiện kiểu gen không đáng kể. Tuy nhiên để đánh giá mức độ ảnh hởng của đa hình gen với năng suất sữa chúng ta cần tiếp tục phân tích với số lợng cá thể nhiều hơn, kết hợp với thu thập số liệu về năng suất sữa để tìm mối liên quan. 3.4. Các kiểu gen GH-GHR của bò sữa lai và bò sữa HF Nh vậy về mặt lý thuyết khi sử dụng các enzym MspI và AluI để cắt các sản phẩm PCR từ cặp mồi GH1, GH2 và GHR1 của gen GH và GHR tơng ứng tối đa sẽ thu đợc 27 kiểu gen khác nhau. Nhng trong thực tế khi phân tích trên 100 bò sữa lai và HF chúng tôi mới chỉ thu đợc 17 kiểu gen. Tần số xuất hiện của các kiểu gen này cũng khác nhau. Kết quả đợc trình bày ở bảng 4. Bảng 4 . Tần số xuất hiện các kiểu gen của bò sữa lai và HF Các kiểu gen Bò sữa lai (cá thể) Bò sữa thuần (cá thể) Bò đực giống (cá thể) GH1 GH2 GHR BB LL -/- 4 BB LL +/+ 1 BB LL +/- 2 AA VV +/+ 1 AA LL -/- 5 3 AA LL +/+ 13 AA LL +/- 6 13 AA LV -/- 1 AA LV +/+ 2 AA LV +/- 2 1 AB VV -/- 1 AB LL -/- 11 1 AB LL +/+ 5 AB LL +/- 9 1 AB LV -/- 2 2 AB LV +/+ 1 2 AB LV +/- 1 10 Qua bảng 4 cho thấy bò sữa lai có 13 kiểu gen/27 tổ hợp theo lý thuyết trong đó kiểu gen AA LL +/+ có tần số xuất hiện cao nhất. Trong khi đó bò sữa HF có 9 kiểu gen/27 tổ hợp theo lý thuyết và kiểu gen AA LL +/- có tần số xuất hiện cao nhất. Còn bò đực chỉ có 3 kiểu gen/ 27 tổ hợp gen. Kết hợp các kết quả nghiên cứu của Zhou (2005) và Lucy (1996) bò mang kiểu gen AA LL có năng suất sữa cao nhất. Điều này phản ánh tiến bộ di truyền của chúng ta trong công tác chọn giống bò sữa. 4. Kết luận - Sử dụng MspI phân tích đa hình gen GH cho thấy mức độ đa hình giữa các giống bò là khác nhau. Bò HF kiểu gen AA chiếm tỷ lệ cao nhất 87,5%, bò sữa lai kiểu gen AA và AB có tỷ lệ tơng ứng là 41,94% và 48,38%, nhng bò đực giống chỉ có kiểu gen AB. - Sử dụng AluI phân tích đa hình gen GH cho thấy bò sữa có tỷ lệ kiểu gen LL rất cao 95,2% ở bò sữa lai và 83,3% ở bò sữa HF thuần và kiểu gen LV thấp nhất, trong khi đó ở bò đực giống chỉ có một kiểu gen LV. - Phân tích đa hình gen GHR bằng AluI cho thấy sự phân bố ba kiểu gen ở bò sữa lai khá đồng đều, bò đực giống và bò sữa HF có kiểu gen +/- cao nhất, tơng ứng là 71.42% và 63,00%. [...]...- Phân tích đa hình gen GH và GHR của bò đã phát hiện đợc 13 kiểu gen ở bò sữa lai, 9 kiểu gen ở bò sữa HF và 3 kiểu gen ở bò đực giống trên tổng số 27 kiểu gen mong đợi, trong đó hai kiểu gen AA LL+/+ và AA LL+/- có tần số cao nhất ở bò sữa lai và bò sữa HF Tài liệu tham khảo 1 S E Aggrey, J Yao, M P Sabour, C Y Lin, D Zadworny,... growth hormone receptor gene and their association with milk-related traits in Holsteins, The Journal of Heredity 90:148-151 2 Andrzej Dybus 2002, Associations between Leu/Val polymorphism of growth hormone gene and milk production traits in Black-and-White cattle, Arch Tierz, Dummerstorf 45:421-428 3 Guo Li Zhou, Hai Guo Jin, Chen Liu, Shan Li Guo, Qi Zhu and Yu Hou Wu 2005, Association of genetic... M, Maki-Tanila A, Georges M, Vilkki J 2006, The role of the bovine growth hormone receptor and prolactin receptor genes in milk, fat and prolactin production in Finnish Ayrshire Dairy cattle, Genetics, 2006, 4 8 Zhou Y, Jiang H 2006, Short communication: A milk trait-associated polymorphism in the bovine growth hormone receptor gene does not affect receptor signaling, J Dairy Sci 89(5):1761-4 ... production traits in dairy Gyr bulls, Pesq agropec bras., Brasilia version 39, 2:147-150 5 Maj, C.S Pareek, M Klauzinska & L Zwierzchowski 2005, Polymorphism of 5-region of the bovine growth hormone receptor gene, J Anim Breed Genet 122:414-417 6 Ruta Skinkyte, Lech Zwierzchowski, Laura Riaubaite, Lina Baltrenaite, Ilona Miceikiene 2005, Distribution of allele frequencies important to milk production traits... Jin, Chen Liu, Shan Li Guo, Qi Zhu and Yu Hou Wu 2005, Association of genetic polymorphism in GH gene with milk production traits in Beijing Holstein cows, J Biosci, 30(5):595-598 4 Keiko Kusamura de Mattos, Silvia Nassif Del Lama, Mario Luiz Martinez and Ary Ferreira Freitas 2004, Association of bGH and Pit-1 gene variants with milk production traits in dairy Gyr bulls, Pesq agropec bras., Brasilia version . hởng của đa hình gen GH và GHR của một số giống bò sữa ở Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: Phân tích tính đa hình gen hormon sinh trởng và gen thụ thể của một số giống bò nuôi. Phân tích tính đa hình gen hormon sinh trởng và gen thụ thể của một số giống bò nuôi ở Việt Nam Trần Xuân Hoàn 1 , Đinh Đoàn Long 2 Nguyễn Thị Quỳnh Châu 1 và Phạm Phơng Mai 1 . ở bò sữa lai và 83,3% ở bò sữa HF thuần và kiểu gen LV thấp nhất, trong khi đó ở bò đực giống chỉ có một kiểu gen LV. - Phân tích đa hình gen GHR bằng AluI cho thấy sự phân bố ba kiểu gen ở