TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 67 KHẢO SÁT IN SILICO, XÂY DỰNG CƠ SỞ KHOA HỌC CHO VIỆC PHÁT HIỆN KẾT HỢP YẾU TỐ NHIỄM VÀ BẤT ỔN DI TRUYỀN TRONG UNG THƯ VÒM HỌNG Ngày nhận bài: 17/06/2014 Nguyễn Văn Trường, Nguyễn Thị Thúy Tài, Ngày nhận lại: 05/07/2014 Nguyễn Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Thị Thu Ngân, Ngày duyệt đăng: 09/09/2014 Lý Thị Tuyết Ngọc 1 Lao Đức Thuận 2 Lê Huyền Ái Thúy 3 TÓM TẮT Ung thư vòm họng là một dạng ung thư phổ biến ở Việt Nam với tỷ lệ tử vong khá cao lên đến 3,3% dân số vào năm 2012. Do vậy, việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư vòm họng là một vấn đề cấp thiết nhằm nâng cao khả năng sống sót của bệnh nhân. Các nghiên cứu gần đây khẳng định rằng sự xâm nhiễm của Epstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa bất thường trên gen DAPK là những nguyên nhân dẫn đến sự tăng sinh và phát triển khối u ở vòm họng. Với mục đích hướng tới việc phát triển một kỹ thuật chẩn đoán dựa trên việc kiểm tra sự hiện diện của gen EBNA-1 – một gen cần thiết cho sự xâm nhiễm và nhân lên của EBV – và sự methyl hóa bất thường trên gen DAPK như các dấu chứng sinh học trong tiên lượng và chẩn đoán sớm ung thư vòm họng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu bước đầu gồm (1) Khai thác dữ liệu, thống kê tần số methyl hóa trung bình có trọng số gen DAPK dựa trên các nghiên cứu trên thế giới; (2) Xác định phương thức thực nghiệm nhằm tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh ung thư vòm họng và khảo sát các bước in silico cần thiết. Từ khóa: ung thư vòm họng, EBV, EBNA-1, DAPK, methyl hóa. ABSTRACT Nasopharyngeal carcinoma is the common cancer in Vietnam counting for 3,3% in 2012. Therefore, there are necessary to prognosis and early diagnosis nasopharyngeal carcinoma in order to improve the survival of patients. Current studies affirmed that the infection of EBV (Epstein-Barr virus) and the aberrant methylation in DAPK gene were the reasons leading to the carcinogenesis of nasopharynx. For the aims to establish the method based on the present of EBNA-1 which was necessary to the infection and replication of EBV and the hypermethylation in DAPK as the biomarker for prognosis and early diagnosis nasopharyngeal carcinoma, in this study, we carried out (1) Data mining and statistically calculated the mean of methylation frequencies of DAPK based on the studies worldwide; (2) Determination of the mode of experiment for prognosis and early diagnosis the nasopharyngeal carcinoma. Keywords: nasopharyngeal carcinoma, EBV, EBNA-1, DAPK, methylation. 1 Trường Đại học Mở TP.HCM. 2 ThS, Trường Đại học Mở TP.HCM. 3 PGS.TS, Trường Đại học Mở TP.HCM. Email: lhathuy@gmail.com 68 CÔNG NGHỆ   ng là lo   bi  u trong các b     Vit Nam. S liu cy t l mc b   ng và t vong ln   n 3,9% và 3,3% dân s [17]        c ch  m b    ng s ha hn cho s phc hi và nâng cao kh  ng sót ca bnh nhân [13] ng t khi u có giá tr cao trong chn      m xâm ln gây t bnh nhân và ch c áp dn không còn sm ca bnh (kh [13] . Son các nhà nghiên cu trên th git sc n l tìm kim mt biomarker nhm tiên ng và chm bnh. Các công b g  u kh nh nguyên nhân dng là h qu ca s ri lon v mt di truyn và mt trong nhng kiu ri lon di truyn  c chng minh xy ra rt sm trong tin trình dn n ung  là s methyl hóa t mc xy ra  các gen c ch khi u hay các gen tham gia vào quá trình u hòa chu trình t bào bng s gn nhóm methyl (-CH 3 ) vào C 5  ca Cytosine thông qua liên kt cng hóa tr [1][5][9][20] . S methyl hóa xy ra ti các o CpG ca các gen c ch khi u, các gen u hòa chu trình t bào dn n s mt chc  ca các gen này, thúc y s  ng và phát sinh khi u [9] . Gen DAPK (Death Associated Protein Kinase) thuc nhóm gen u hòa chu trình t bào, nm  v trí 9q21.33, mã hóa cho protein DAPK có chc  trong vic u khin t bào cht theo  trình [15] . S methyl hóa trên gen DAPK  c khng nh là có liên quan n mt s loi ung  vi các tn s methyl hóa khác nhau ln t  ung  phi vi 34% [12] , ung  gan vi 52% [18] , u tuyn yên vi 34% [2] , ung  vú vi 17% [2] i vi ung  vòm hng, tn s methyl hóa gen này là rt cao; c th trong công b ca Kong et al (2006), tn s này chim 76,1% [15] . Mt nghiên cu khác ca Zhang et al (2002)  cho thy s methyl hóa t mc  gen DAPK trên ung  vòm hng chim t l rt cao, t 70-80% [20] . Bên cnh  nghiên cu ca Wong et al (2002)  cho thy s methyl hóa t mc trên promoter ca gen DAPK  ung  vòm hng là mt s kin din ra sm trong quá trình sinh u  vòm hng vi s methyl hóa trên gen DAPK  khi u  cp chim 75% và trên các dòng t bào ung  vòm hng chim 80% [16] . Ngoài ra, mt nguyên nhân khác n       n bnh (ung  xâm nhim ca virus Epstein Barr (EBV) [3][10] . EBV là mt loi virus thuc h Herpesvirus. C gen ca EBV là chu    kích c    cho trên 85 gen [10] . Khi EBV xâm nhp vào  th i, s phát trin ca EBV din tin theo ba ng (1) Xâm nhp vào t bào biu mô và nhân lên; (2) Gây  nhim và xâm nhp vào t bào lympho B và nhân lên; (3) Tim tàng và tin trin thành ung th khi có u kin [10][19] .  duy trì kh  tim tàng, EBV  hi phi có s tr giúp ca protein EBNA-1 c mã hóa trc tip t gen EBNA-1 [14][19] . Chi tit  EBNA-1 th hin vai trò bng vic duy trì EBV  dng vòng (episome EBV) trong t bào ch và thc hin chc  trong phiên mã thông qua vic EBNA-1 bám vào oriP khi phát s nhân lên ca DNA h gen EBV [7][14] . Gen EBNA-1 và các sn phm ca nó c tìm thy trong hu ht các khi u liên quan n EBV; s có mt ca EBV c xác nh lên ti 98% khi u [20] . Chính vì vy, có th khng nh rng: yu t nhim EBV là nguyên phát ca bnh ung  vòm hng. Nhm xây dng  s khoa hc cho thc nghim phát hin sm và tiên ng bnh ung  vòm hng, trong nghiên cu c u này, chúng tôi tin hành (1) Khai thác d liu  c công b trên th gii liên quan n s hin din ca EBNA-1 và s methyl hóa t mc DAPK liên quan n ung  vòm hng; (2) Xác nh  pháp chn  sm bnh da trên hai gen  gen ENBA-1 (yu t nhim) và DAPK (yu t th ch).         Khai thác   thu  trình  gen EBNA-1 và DAPK TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 69 Tn s       m methyl hóa trên gen DAPK c khai     d liu Pubmed và Pubmed central, t  n s trung bình có trng s c tính toán. Các trình t gen EBNA-1 c thu nhn t  d liu NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/) bng các mã s truy cp KC207814, KC207813, NC_009334, DQ279927, KF373730, JQ009376,  ng thi trình t gen DAPK  c thu nhn bng mã s truy cp NC_000009.12.        - DAPK Vic thit k mc thc hin bng các công c tin sinh hc bao gc tuyn BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), IDT analyzer (www.idtdna.com/analyzer/ Applications/OligoAnalyzer/), Annhyb, CLUSTALX, BatchPrimer 3 (http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/).   Chúng tôi b u bng vic tp trung trên tính cht methyl hóa b ng có liên      ng. Qua quá trình khai thác d liu t các nghiên cu trên th gi      mc  methyl hóa, chúng tôi nhn thy rng gen DAPK có t l t bc. Bng sau là tng hp t các công b n hình v t l methyl    c hin vi các ngun mu s dng trên gen này. B Nghiên cu Phng pháp Loi mu Sôi mu ung th/bình thng T l methyl hóa trên mu ung th (%) [3] MSP Mô sinh thit 49/- 67,3/- Dch pht 49/20 55,1/0 [5] MSP Mô c paraffin 41/- 76,0/- [6] MSP Mô sinh thit 30/- 76,7/- Dch pht 30/- 63,4/- [7] MSP, Real-Time PCR Mô c paraffin, Mô sinh thit 46/- 76,1/- [13] MSP Mô c paraffin 53/- 79,2/- [14] MSP Mô sinh thit 32/- 75,0/- Ghi chú: - trong nghiên cứu không thử nghiệm trên nguồn mẫu bình thường Da trên kt qu th hin  Bng 1 cho thy phn ln các công b u s dng mu sinh thi duy nht hai nghiên cu s dng dch ph kho sát. Kt qu thng kê ghi nhn t l methyl hóa trên gen DAPK u rt cao và có s ng t a các công b     không ghi nh           u  trên th giu s dng k thu   phát hin tính cht methyl hóa trên gen DAPKu k thuc phát trin. Bên c b ca tác gi Zhang và cng s   70 CÔNG NGHỆ 2012, các tác gi vn la chn MSP [3] . Chúng ng nht vi la chn này bi MSP nhy, d phát trin và nht l phân bic allele methyl (dù hin din ít) trong hn hp t     bào bình ng ca mu bnh phm. Nhm loi b s khác bit giu và các loi mu, chúng tôin s trung bình có trng s áp dng cho các s ling  c. Kt qu cho thy tn s methyl có trng s c th hin thông qua Hình 1. Hình 1. Tn s methyl hóa có trng s ca gen DAPK trên t ng và t bào bìng Ghi chú: Tâm ca các vòng tròn th hin tn s c báo cáo trong các công trình liên ng thng nm ngang hin th tn s methyl hóa trung bình có trng s da trên các nghiên cu mà chúng tôi phân tích. c bit c các công b v tính cht methyl hóa bt ng ca gen DAPK, các tác gi  cn yu t nguyên phát, tc là nhim EBV ca mu bnh phm. DAPK           trên gen DAPK Trình t gen DAPK c thu nhn t ngân hàng gen vi mã s truy cp NC_0ng thi, các vùng        nh bng các công c h tr trc tuyn Sequence view trên NCBI (D liu không trình bày). Hình 2. V trí gen DAPK nm trên nhim sc th s 9  o CpG thuc vùng promoter ca    nh bng phn mm  o CpG có chiu dài 662 bp (-n +370) kéo dài t vùng cui promoter n cui exon 1 (Hình 3). TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 71 Hình 3.  cu trúc gen DAPK Bên c m tra bng phn mm TF search, nhiu v trí phiên mã quan trng Sp1, MZF, CP2, ANML1a, p300, C/EBP, GATA,c nhn din no CpG ca gen DAPK (Hình 4.). Các nhân t phiên mã này hin din trong vùng promoter, vì vy vi    a chúng s quy  n ho ng phiên mã và biu hin c     chn vùng   methyl hóa ti các v trí CpG có th gây c ch quá trình phiên mã d n s im lng ca các gen thông qua  c thit k ng methyl hóa ti v trí các o CpG s  phiên mã quan tr i vi phn ng MSP, h thng mi bao gm mi methyl và mi unmethy phân bi c tình trng methyl hóa hay không methyl hóa ca các v trí CpG trong vùng kho  m khác bit duy nht gia hai mi methyl và unmethyl là nucleotide Cytosine trong trình t mi methyl s c thay th bng các Thymine trong trình t mi unmethyl. Trình t các cp mc th hin  Bng 2. Bng 2. Trình t m khui gen DAPK Cp mi Trình t m  (I) DAPK-MF GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC DAPK-MR CATAAACGCCAACGCCGAAAA (II) DAPK-UF GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT DAPK-UR CCATAAACACCAACACCAAAAA Ghi chú: Các v m và gi; Các cp mc kí hiu là Fmi xuôi. Rmc; Mmethyl; Uunmethyl Cp m    c tin       vt lý bao gm chiu dài, phng t do hình thành cu trúc th cp, bng công c trc tuy       c hiu thông qua chc tuyn BLAST hay METHBLAST trên NCBI (Bng 3). 72 CÔNG NGHỆ B vt lý mi methyl và unmethyl gen DAPK Tên mi T m ( o C) L %GC (1) (2) (3) Sn phm (bp) DAPK-MF 56,5 24 50,0 - 0,41 - 7,53 - 8,26 172 DAPK-MR 56,9 21 47,6 - 0,51 - 3,61 DAPK-UF 54,8 27 37,0 0,15 - 4,85 - 8,31 176 DAPK-UR 52,1 22 36,4 -0,51 -1,47    ng t    -1 ) hình thành (1) hairpin loop; (2) homodimer và (3) heterodimer; T m : nhi nóng chy, L: chiu dài (bp), %GC: ph Da trên kt qu phân tích các thông s vt lý ca mi (Bng 3.), phn ln các thông s vu phù hp vi các yêu cu lý thuyt t ra [11] . Ch duy nht %GC ca cp mi unmethyl thp nh là 50-60%,    c nghim sau này s   trong vic t      ca phn ng MSP. Ngoài ra, khi kic hiu b   u th hic hiu cao (D liu không trình bày). Mt khác, v s ng các CpG trong mi, mi xuôi và mc thit k bao ph ít nht ba v trí CpG, c th i vi mi xuôi methyl và unmethyl cha 4 v trí CpG và m c cha 3 v trí CpG. Cùng vi tính cht h thng m c thit k cha các v trí CpG trùng vi v trí ca các nhân t phiên mã quan tr  c hi  giá tình trng methyl hóa  t  hng (Hình 4). Hình 4. V trí bt cp mi methyl và unmethyl, các nhân t phiên mã quan trng trên gen DAPK   -- --UR). TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 73  vic thit k cp m   ng methyl hóa trên gen DAPK c     s dng trong các nghiên cu thc nghim sau này.                   cp  trên, s có mt ca c chng minh v  rt cao (trên 98%)  các khi u vòm hng [20] . M duy trì hình thc xâm nhim tim tàng vi DNA dng vòng, gen EBNA-1 cn th hin chc kho sát in silico k tip, chúng tôi tp trung trên gen EBNA-1, nhnh xem gen này có th làm trình t  xác nhn tính nhim và hình thc xâm nhim tim tàng ca EBV.  gen EBNA-1  các mã s truy c lit kê trong phn Vt li    da trên ngun gc công b có tính phân bit v chng hay type nhim. Các trình t này c tin hành sp gióng ct b  trình CLUSTALX (Hình 5). Hình 5. Kt qu sp gióng ct các trình t gen EBNA-1 Kt qu sp gióng ct các trình t EBNA-1 (Hình 5) cho thy t l bo tn ca gen này khá cao (th hin thông qua du * trong hình). Ngoài ra, các trình t bo tn ca u ro sát bng BLAST (d liu không trình bày). Do    kt lun rng, vùng bo tn thuc gen EBNA-1    làm trình t m phát hin EBV. Vic thit k mi cho các phn ng RT-c tin hành và kt qu c th hin trong Bng 4. Bng 4. Trình t mi cho phn ng PCR khui mt phn gen EBNA-1 Cp mi Trình t m  EBNA1_F GCCGGTGTGTTCGTATATGG EBNA1_R AGGGGAGACGACTCAATGGT Ghi chú: F mi xuôi; R mc Các thông s vt lý ca cp mc kim tra b IDT analyzer và th hin  Bng 5. Bng 5. Kt qu thông s vt lý ca cp mi EBNA1_F và EBNA1_R Trình t mi - L %GC Tm ( o C) (1) (2) (3) Sn phm (bp) EBNA1_F6 20 55,0 55,8 1,18 -9,75 -6,53 109 EBNA1_R6 20 55,0 57,9 -1,65 -3,61    ng t    -1 ) hình thành (1) hairpin loop; (2) homodimer và (3) heterodimer; T m : nhi nóng chy, L: chiu dài (bp), %GC: ph 74 CÔNG NGHỆ Da trên kt qu phân tích, các thông s v  u phù hp vi yêu cu ca thit k mi, ngoi tr  ng t do hình thành cu trúc homodimer là -9,75 < -9 Kcal.mole -1 . Tuy nhiên, khi tin hành kim tra bng phn mm trc tuyn IDT, cu trúc t bt cp xy ra   ng t do này không chênh lch quá nhiu so vi yêu cu (-9 Kcal.mole -1 p mi này vc s d kic hiu. Khi tin hành kic hiu bc tuyn BLAST, kt qu cho thy mi khuch c gen EBNA-1 ca virus human hepes (Mã s truy c   t 100% và giá tr E-value gn bng 0 (Ident=100%, E-value=0,089). y, v mt lý thuyt k thành công cp mi khui gen EBNA- 1 tha mãn vi các yêu cu v thông s, tính c hiu ca m      ng thc thc nghim nh  ng và ch  s   vòm hng s dEBNA- 1 (yu t nhim) và DAPK (yu t th ch) bng các phn ng kt hp RT-PCR và MSP.  T nhng kt qu nghiên cu, chúng tôi ghi nhn tn s methyl hóa trung bình có trng s ca gen DAPK   t 72,02%. Cùng vi tính cht methyl hóa cao này, s biu hin ca gen EBNA-1 c ghi nhm bo tính nhim  dng tim tàng, DNA dng vòng c     ch. Kt hp c hai yu t nh c thc nghim nhng và chng s da trên  EBNA-1 (yu t nhim) và DAPK (yu t th ch) bng các phn ng kt hp RT-PCR và MSP vi các b m c c thit k t trên lý thuyt. Kt qu kho sát in silico    khoa h  chúng tôi tin hành thc nghim trong thi gian sm nht. TÀI LIU THAM KHO 1.  hypermethylated tumor suppressor genes as tumor markers in mouth and throat rinsing Int J Cancer 105, p.851 855. 2.  of the death-associated protein kinase/p14/HDM2/p53/Apaf-1 apoptosis pathway in J Clin Pathol, 60 p.664-669. 3. Eugene AC., Julie MW., David ET., Stacey LI Role of the Epstein-Medscape J Med., 10(7), p.165. 4. Kong WJ., Zhang S., Guo CK., Wang YJ., Chen X., Zhang SL., Zhang D., Liu Z., Kong W    tion-associated silencing of the death-associated protein Anticancer Drugs 17(3), p.251-259. 5. Kwong J., Lo KW., To KF., Teo PM.      Clin Cancer Res, 8, p.131-137. 6. Leah CP., Marcie JG., Leah AD., Daniel EJ., Kieu D., Carmen ST., Steven AB. (2009).  death-associated protein kinase gene leads to differentially Carcinogenesis, 30(12), p. 20232030. 7. Leight ER., Sugden B. -1: a protein pivotal to latent infection by Epstein- Rev Med Virol, 10, p.83-100. TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 75 8.   World J Gastroenterol., 17(44), p.4917-4921. 9.  Springer, ISBN-10 1- 4020-3641-8. 10. Matthew PT., Razelle K. -Clin Cancer Res, 10, p.803-821. 11. © Humana Press, 132, p.365-386. 12. Niklinska W., Naumnik W., Sulewska A., Kozlowski M., Pankiewicz., Milewski R.    Non-Folia histochem cytobiol., 47, p.275-280. 13. Saeid G., Ali MA-Invasive Detection of Esophageal Cancer using Genetic Changes in Circulating Cell-Avicenna J Med Biotechnol., 4(1), p.3-13. 14. Sivachandran N., Wang X., Frappier L  s of the Epstein-Barr virus J Virol., 86(11), p.6146-6158. 15. Susanna HH., Sagung RI., Luh PLI., Ahma H., Sylvia D., Sofia MH., Renske DMS.,  Molecular Cancer, 10, p.48. 16. Wong TS, Chang HW, Tang KC, Wei WI, Kwong DL, Sham JS, Yuen AP, Kwong YL.      ethylation of the death-associated protein- kinase gene in nasopharyngeal carcinoma and its detection in the peripheral blood of Clin Cancer Res., 8(2), p.433-437. 17. World Health Oragnization (2012). Estimated cancer incidence, Mortality and prevalence International agency for research on cancer. 18. Wu LM., Zhang F., Zhou L., Yang Z., Xie HY., Zheng SS. (2010).  CpG island methylator phenotype for tumor recurrence in hepatitis B virus-associated BMC Cancer, 10, p.1471-2407. 19. Young LS., Dawson CW., Clark D., Rupani H., Busson P., Tursz T., Johnson A., Rickinson AB-Barr virus gene ex J Gen Virol., 69(5), p.1051-1065. 20. Zhang Z., Sun D., Hutajulu SH., Nawaz I., Nguyen Van D., Huang G., Haryana SM., Middeldorp JM., Ernberg I., Hu LF     -Invasive Method, Multiplex Methylation Specific PCR (MMSP), for Early Diagnosis of Nasopharyngeal PLoS ONE, 7(11), p.1-6. . TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 67 KHẢO SÁT IN SILICO, XÂY DỰNG CƠ SỞ KHOA HỌC CHO VIỆC PHÁT HIỆN KẾT HỢP YẾU TỐ NHIỄM VÀ BẤT ỔN DI TRUYỀN TRONG UNG THƯ VÒM HỌNG Ngày. TÓM TẮT Ung thư vòm họng là một dạng ung thư phổ biến ở Việt Nam với tỷ lệ tử vong khá cao lên đến 3,3% dân số vào năm 2012. Do vậy, việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư vòm họng là một. tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh ung thư vòm họng và khảo sát các bước in silico cần thiết. Từ khóa: ung thư vòm họng, EBV, EBNA-1, DAPK, methyl hóa. ABSTRACT Nasopharyngeal carcinoma is the