Đang tải... (xem toàn văn)
LỜI NóI ĐẦU Salmonella là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm độc thức ăn trên toàn thế giới.
LỜI NóI ĐẦU Salmonella là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm độc thức ăn trên toàn thế giới. Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 1998, hàng năm trên thế giới có khoảng hơn 10 triệu trẻ em dưới 5 tuổi và người già chết do nhiễm độc thức ăn, trong đó 90% trẻ em sống ở các nước đang phát triển (bao gồm cả Việt Nam). Ngoài việc gây nhiễm độc thức ăn, Salmonella còn gây ra các chứng bệnh nguy hiểm khác như sốt thương hàn, nhiễm trùng máu cấp tính, sẩy thai, viêm khớp và các bệnh về đường hô hấp. Hai chủng chính gây nhiễm độc thức ăn cho người đó là S. typhimurium và S. enteritidis. Một vấn đề rất đáng lo ngại hiện nay là hầu hết các chủng Salmonella đặc biệt là S. typhimurium đã kháng được nhiều loại kháng sinh khác nhau. Chính vì vậy, việc điều trị các bệnh do Salmonella ngày càng gặp nhiều khó khăn, chi phí tốn kém và đòi hỏi phải tạo ra nhiều loại kháng sinh mới. Vấn đề khác không kém phần quan trọng đó là gia cầm khi bị nhiễm Salmonella không biểu hiện bất kỳ một triệu chứng bất thường nào, điều này đã gây khó khăn trong việc ngăn chặn vùng bị dịch. Xuất phát từ thực tế trên, một phương pháp được xem là hiệu quả nhất để ngăn chặn Salmonella nhiễm ở gà là tạo ra một loại vacxin cho gia cầm chống lại sự xâm nhiễm của Salmonella. Đây không chỉ là tính cấp thiết của ngành chăn nuôi mà còn là biện pháp chủ động trong công tác an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. Hiện nay trên thị trường có nhiều loại vacxin cho gà chống lại Salmonella như vacxin chết, vacxin sống giảm độc lực, nhưng mỗi loại vacxin lại có nhược điểm riêng. Vacxin sống giảm độc lực có hiệu quả cao nhưng lại không an toàn. Do đó, gần đây các nhà khoa học trên thế giới đang tập trung nghiên cứu tạo ra vacxin thành phần bằng kỹ thuật ADN tái tổ hợp và được gọi là vacxin tái tổ hợp. Vacxin tái tổ hợp ra đời khắc phục được những 1 nhược điểm trên do việc sử dụng nguồn kháng nguyên thành phần có nhiều ưu điểm vượt trội hơn về độ an toàn khi sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch một cách đặc hiệu. Đây còn là lựa chọn kinh tế so với các phương pháp cũ khi đưa vào ứng dụng, sản xuất vacxin thành phẩm. Từ yêu cầu cấp thiết về tăng cường sức khoẻ cộng đồng, an toàn thực phẩm, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân lập và biểu hiện gen fljB mã hoá kháng nguyên roi H: 1,2 của Salmonella typhimurium trong Escherichia coli BL21” nhằm thu được lượng lớn kháng nguyên tinh sạch, dùng cho việc nghiên cứu và sản xuất vacxin thế hệ mới là vacxin tái tổp hợp chống lại Salmonella. Công việc được tiến hành tại Phòng kỹ thuật Di truyền, Viện công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát chung về Salmonella 1.1.1. Tình hình dịch bệnh Vi khuẩn Salmonella đã được nghiên cứu từ hàng trăm năm nay, tuy nhiên trong mấy chục năm trở lại đây, chúng được các nhà nghiên cứu quan tâm bởi sự gia tăng các bệnh ngộ độc thực phẩm ở người do Salmonella gây ra. Vào năm 1980, khi tìm hiểu nguyên nhân của dịch tả, Daniel E. Salmon đã phát hiện trong ruột của lợn có một loại vi sinh vật gây sốt, tiêu chảy [61]. Sau đó, ông phát hiện chủng vi khuẩn này còn sinh sống trong ống tiêu hoá của các động vật có vú, bò sát, chim và cả côn trùng. Vi khuẩn này là vi khuẩn gram âm, hình que, di động được, thuộc họ Enterobacteriaceae và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn E. coli. Năm 1984, ông đã phân lập nuôi cấy và đặt tên chủng là Salmonella. Salmonella đã gây tác hại không nhỏ đối với người và động vật, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế. Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới [63], chỉ tính riêng ở Mỹ, năm 2004 có 1,4 triệu người nhiễm Salmonella. Trong số những trường hợp nhiễm có 183000 trường hợp phải điều trị tại bệnh viện, 580 trường hợp bị tử vong, tổng thiệt hại kinh tế lên tới 3 tỉ USD. Cũng tương tự, ở Đan Mạch, theo thống kê năm 2001, tổng chi phí để khắc phục hậu quả do Salmonella lên tới 25 triệu USD. Tại Việt Nam, mặc dù chưa có thống kê nào về thiệt hại do Salmonella gây ra, nhưng báo cáo mới nhất của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho thấy, độ nhiễm khuẩn trong các sản phẩm chăn nuôi như thịt lợn, thịt bò, thịt gà ở Hà Nội là 100%, trong đó 40% là nhiễm Salmonella [63]. Hơn nữa, cả trong những sản phẩm được coi là đảm bảo để xuất khẩu cũng chứa Salmonella. Chỉ trong 3 tháng cuối năm 2001, Cơ quan Lương thực và Dược liệu Hoa Kỳ (FDA) đã tịch thu và tiêu huỷ hàng trăm lô thực phẩm được nhập 3 khẩu từ Việt Nam, đặc biệt là mặt hàng hải sản bị nhiễm Salmonella. Thiệt hại kinh tế do vấn đề tiêu huỷ lên đến hàng trăm ngàn USD. Báo chí đã đưa tin, tại kho dự trữ lạnh của khu công nghiệp Sóng Thần Thành phố Hồ Chí Minh đã từng tồn tại 19 tấn gà nhiễm Salmonella [58]. Con số đó không những ảnh hưởng đến nền kinh tế mà còn thực sự là mối lo ngại cho an toàn sức khoẻ cộng đồng. 1.1.2.Một số đặc điểm vi sinh về Salmonella Salmonella là loại vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae, dạng hình que với chiều dài 2-5 ỡm, chiều rộng 0,5 -1,5 ỡm. Samonella có khả năng sinh trưởng cả trong môi trường hiếu khí và kỵ khí, không sinh bào tử [16]. Salmonella có thể nuôi cấy dễ dàng ở nhiệt độ 37 o C trong môi trường nuôi cấy thông thường. Khi sinh trưởng trên môi trường đặc, Salmonella phát triển thành các khuẩn lạc nhỏ, đường kính 2- 4 mm, mịn và đồng nhất. Cũng giống như hầu hết các vi khuẩn khác, điều kiện pH tối ưu cho vi khuẩn này hoạt động là pH trung tính 6-8. Tuy nhiên, trong cả môi trường kiềm và axít vi khuẩn này vẫn có khả năng tồn tại. Ngoài tính chất chung của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, vi khuẩn Salmonella còn có một số tính chất: không lên men đường Lactoza, Sacaroza, Ureaza(-), Indol(-), H 2 S(+). Salmonella có sức sống và sức đề kháng tốt, trong canh trùng, trong đất có thể sống được vài tháng, trong nước 2-3 tuần, trong nước đá sống từ 2- 3 tháng, trong phân sống khoảng vài tuần. Phần lớn Salmonella đều có khả năng di chuyển nhờ roi trừ S. gallinarum và S. pullorum. Khả năng này sẽ mất đi khi xử lý chúng với tác nhân vật lý gây sốc nhiệt cho tế bào như: nhiệt độ lạnh hoặc nhiệt độ cao [16] ở 50 o C khoảng 1giờ, ở 60 o C khoảng 10-20 phút, 100 o C khoảng 5 phút và các chất khử trùng như Chloramin 3%, vv… Thông thường, khi mất khả năng di chuyển, Salmonella cũng mất khả năng sinh trưởng. 1.1.3. Phân loại Salmonella 4 Theo hệ thống phân loại Kaufman-White, Salmonella khoảng hơn 2501 các typ huyết thanh (serotyp) khác nhau [16. 63] và số lượng này ngày một tăng lên. Trong đó, Salmonella được chia làm 2 loài chính là S. enterica và S. bongori, S. enterica lại được chia ra làm 6 dưới loài khác nhau là S. enterica, S. salamae, S. arizonae, S. diarizonae, S. indica và S. houtenae. Theo hệ thống phân loại này, S. typhimurium nằm trong dưới loài S. enterica [16, 21]. Sự phân loại các typ huyết thanh khác nhau của Salmonella được dựa vào kháng nguyên bề mặt tế bào vi khuẩn: kháng nguyên thân hay kháng nguyên O (somatic antigen), kháng nguyên roi hay kháng nguyên H (flagellar antigen) và kháng nguyên vi (vi antigen). Kháng nguyên O là chuỗi phức hợp lipopolisaccarit-protein nằm trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Kháng nguyên H được tạo thành bởi các tiểu phần protein là flagellin. Sự đa dạng về vùng giữa của flagellin là cơ sở cho sự đa dạng về kháng nguyên H. Một số typ huyết thanh như là S. typhimurium, S. dublin còn có thêm kháng nguyên vi. Đây là loại kháng nguyên định vị bên ngoài vỏ polisacarit của vi sinh vật, có liên quan đến tính độc riêng với tế bào chủ [16]. 1.1.4. Bệnh học của sự lây nhiễm Salmonella Salmonella là loại vi khuẩn có khả năng gây bệnh, lây nhiễm chủ yếu qua con đường ăn, uống. Chúng có khả năng sống trên nhiều động vật, trong trứng của gia cầm [2, 16, 19]. Vi khuẩn này liên quan đến một loại bệnh thường gặp ở người: như bệnh thương hàndo(S. typhi gây nên. Bệnh thương hàn là một trong những căn bệnh nguy hiểm và biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất gây tổn thương nhiều phủ tạng, đặc biệt là hệ tiêu hoá. Tuy nhiên mỗi cơ thể chủ khác nhau có sự thích ứng khác nhau với mỗi loại Salmonella: S.typhimurium và S. enteritidis là hai loài thường gây bệnh cho người và gia súc, gia cầm, và S. dublin gây bệnh tiêu chảy ở lợn [63]. Tuy có nhiều loại Salmonella, nhưng chỉ một số Salmonella gây bệnh cho người và động vật. 5 Hầu hết sự lây nhiễm Salmonella vào cơ thể người thường là do ăn phải thức ăn có nguồn gốc động vật và gia cầm bị nhiễm Samonella. Để có thể gây bệnh, Samonella phải có một loạt các nhân tố gây độc. Các nhân tố này bao gồm: khả năng xâm nhập vào tế bào, phức hệ vỏ lipopolysaccarit, khả năng phát triển trong nội bào và khả năng tạo độc tố. Sau khi xâm nhập vào bụng, Salmonella nhân lên trong ruột hồi và ruột kết xâm nhiễm vào biểu mô ruột, và tăng sinh nhanh trong biểu mô và nang lympho. Từ đây, Salmonella lan ra khắp cơ thể và cuối cùng bị chặn lại bởi các tế bào lưới nội mô. Dưới sự kiểm soát của hệ thống lưới nội mô, sự phát triển của Salmonella bị ức chế. Tuy nhiên với mỗi typ huyết thanh Salmonella khác nhau lại có khả năng gây độc khác nhau. Một số typ Salmonella có khả năng nhiễm vào gan, lá lách, xương, màng não và một số cơ quan khác trong cơ thể gây ra tác hại nghiêm trọng với cơ thể. Sau khi nhiễm Salmonella vào người, và triệu chứng sẽ xuất hiện sau 12 đến 72 giờ như đau bụng tiêu chảy, đau đầu, nôn mửa, sốt cao. Bệnh này có thể tự khỏi sau một vài ngày đến một tuần nhưng cũng gây tổn thương cơ thể người bệnh, đặc biệt những người già, các em nhỏ và những người có thể trạng yếu thì sự lây nhiễm có thể dẫn tới làm tăng khả năng mắc các chứng bệnh khác. Khi xâm nhập vào ruột, Salmonella kích thích sự đáp ứng viêm ác tính, gây loét ruột. Nội độc tố do Salmonella tiết ra có khả năng ức chế quá trình tổng hợp protein. Cho đến nay, độc tố gây viêm ác tính, sự lở loét vẫn chưa được biết rõ. Sự xâm nhiễm của Salmonella lên màng nhày gây kích thích các tế bào biểu mô giải phóng ra hàng loạt các cytokin như: IL-1, IL-6, IL-8, TNF-2, IFN-U, MCP-1 và GM-CSF [12]. Các nhân tố gây độc làm viêm đường ruột [59], một số khác đi vào hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng máu cấp tính có thể dẫn đến tử vong [31]. Có 30000 ca của người nhiễm vi khuẩn Salmonella đã gián tiếp được công bố ở Anh. Sự nhiễm bệnh này do lây lan từ gia cầm. Bởi vậy hạn chế sự lây nhiễm Salmonella trong những đàn gà sẽ đem lại kết quả quan trọng cho 6 sức khoẻ cộng đồng. Ngoài khả năng lây nhiễm trên người, Salmonella cũng nhiễm vào các động vật khác. S. typhimurium có thể nhiễm vào gà qua thức ăn hoặc nhiễm từ gà mẹ sang gà con [25]. Hậu quả của sự lây nhiễm này là gà con có thể bị chết [12]. 1.1.5. Sự đề kháng của Salmonella với các kháng sinh Cho đến nay, có nhiều báo cáo ghi nhận khả năng kháng lại kháng sinh của Salmonella [63]. Tính đề kháng này do sự truyền gen giữa các chủng vi khuẩn. Nguy hiểm hơn, thông qua sự chuyển đoạn ADN cộng gộp, Salmonella có khả năng kháng đồng loạt các chất kháng sinh khác nhau. Một minh chứng gần đây về tính kháng nhiều chất kháng sinh là chủng S. typhimurium DT104. Chủng vi khuẩn này có thể kháng lại một số chất kháng sinh thông thường nên khi động vật và người bị nhiễm việc điều trị bằng các loại kháng sinh thường không hiểu quả [62]. Mặt khác, S. typhimurium kháng chloramphenicol xảy ra ngày một nhiều ở các nước đang phát triển từ đầu năm 70 đến giữa năm 80. Cuối những năm 80 đến đầu những năm 90, người ta phát hiện thấy S. typhimurium có plasmit đề kháng với chloramphenicol, ampixillin, cotrimoxazol ở Châu á và Đông Bắc Phi. Vì vậy, việc tìm ra một loại vacxin để chống Salmonella là hết sức cần thiết. 1.2. Kháng nguyên của Salmonella 1.2.1. Đặc điểm chung về kháng nguyên của Salmonella 7 Salmonella có 3 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên thân (O); kháng nguyên roi (H); kháng nguyên vi có ở một số typ huyết thanh khác như: S. typhi, S. dublin và S. hirschfeldii. Kháng nguyên nằm trong lớp vỏ lypopolysaccharit gọi là nội độc tố tạo thành phần phía ngoài của thành vi khuẩn. Nội độc tố gồm 3 lớp: lớp ngoài (O), lớp giữa (R) và lớp nền (lớp lipit A). 1.2.1.1. Kháng nguyên thân O (lypopolysaccharit) Salmonella có tới hơn 60 kháng nguyên O khác nhau. Kháng nguyên thân có cấu trúc dạng sợi lypopolysaccharit-protein được bộc lộ trên bề mặt tế bào do đó khả năng gây đáp ứng miễn dịch rất mạnh. Kháng nguyên (O) gồm hai phần: phần nhân cơ bản và phần các chuỗi ngang. Phần nhân cơ bản giống nhau trong tất cả Salmonella. Phần các chuỗi ngang gồm có những tiểu đơn vị oligosidic có tính tái diễn, chính các chuỗi ngang quyết định tính đặc hiệu của mỗi nhóm Salmonella. Mặt khác kháng nguyên thân (O) rất khó biểu hiện trong những hệ biểu hiện thông thường. 1.2.1.2. Kháng nguyên tua riềm (vi) Kháng nguyên tua riềm là những sợi protein nhỏ nằm trên bề mặt của vi khuẩn, nó có thể do một hay một số tiểu phần protein cấu thành. Dạng điển hình cho tua riềm là cấu trúc hình xoắn ốc [37]. Tuỳ thuộc vào sự thích nghi Kháng nguyên H (Roi) Màng trong Lớp peptidoglycan Kháng nguyên Vi Kháng nguyên O (Chuỗi polisaccarit) Màng ngoài Tua riềm Nội bào Hình 1. 1: Khái quát cấu trúc kháng nguyên của Salmonella 8 về khả năng sống, khả năng gây bệnh, mỗi loài vi khuẩn có dạng tua riềm khác nhau. Chức năng chính của tua riềm là khả năng kết dính, tương tác với vi khuẩn và với các nhân tố khác. Đối với Salmonella, cấu trúc tua riềm thường có dạng dày và cứng nên giúp chúng gắn thụ động lên bề mặt tế bào biểu mô cơ thể chủ, nhờ sự nhận biết của thụ thể, các tín hiệu có bản chất ion Ca 2+ từ tế bào vi khuẩn được giải phóng tạo ra đáp ứng các nội bào của tế bào chủ, kích thích sự giải phóng ra các cytokin điều khiển đáp ứng miễn dịch có cho vi khuẩn [51]. 1.2.1.3. Kháng nguyên roi H Kháng nguyên roi H với bản chất là protein cấu trúc có mặt ở hầu hết các typ huyết thanh của Salmonella [34]. Do có thành phần đơn nhất là protein tham gia chức năng cấu trúc nên chúng ít hoặc không mang tính độc và dễ dàng được phân lập cũng như biểu hiện bằng công nghệ ADN tái tổ hợp. Ngoài ra protein này thường được tiết ngoại bào và có khả năng cho đáp ứng miễn dịch cao. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy kháng nguyên của các vi khuẩn thuộc nhóm gram âm ái lực mạnh với các chuỗi polypeptit bề mặt gây ra sự tổng hợp TNF-ỏ và Interleukin-1õ (IL- 1õ) từ tế bào monocyte ở người. Nhân tố này đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự xâm nhiễm của Salmonella và tạo khả năng đáp ứng miễn dịch ghi nhớ [18, 27]. Như vậy kháng nguyên H không chỉ đơn thuần là protein cấu trúc mà còn thể hiện rõ tính gây miễn dịch bảo hộ. Chính dựa vào đặc tính này mà kháng nguyên H được chọn làm đối tượng để nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp phục vụ cho việc tạo vacxin tái tổ hợp sau này. Trong nghiên cứu của chúng tôi gen fljB mã hoá cho kháng nguyên roi H: 1,2 của vi khuẩn Salmonella đã được sử dụng làm cơ sở nghiên cứu sản xuất vacxin tái tổ hợp. 1.2.1.3.1. Cấu trúc protein flagellin của Salmonella Roi của vi khuẩn Salmonella tồn tại ở dạng siêu xoắn và được cấu tạo từ một protein đơn nhất gọi là flagellin. Cấu trúc siêu xoắn này bao gồm 11 vi 9 sợi (protofilament), khi sử dụng phương pháp tia Rơngen (X-ray) để quan sát cấu trúc tinh thể của một đoạn flagellin thì người ta thấy rằng ẩn đi 100 gốc cấu trúc về vi sợi. Vì vậy, với phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử nhiệt độ thấp (eletron cryomicroscopy) người ta có thể quan sát một cách toàn diện hơn về cấu trúc xoắn. Đi sâu về mặt cấu trúc ta thấy rằng phân tử flagellin gồm bốn vùng (ký hiệu là D0, D1, D2, D3, D4) được nối với nhau bằng các cặp đoạn nối song song (gọi là vùng đệm). Mô hình khung cacbon ở vị trí ỏ (Cỏ) cho thấy sự tạo thành các nếp gấp và phần đầu của chuỗi xoắn ỏ được cuộn vào trong vùng D0. Đầu N của chuỗi (ND0) được bắt đầu từ axit amin Gln ở vị trí thứ 2 kéo dài tới Serin ở vị trí 32, trong khi đó ở đầu C của chuỗi xoắn (CD0) lại bắt đầu từ Alanin 459 và kéo dài tới Serin 491. Trong đó vùng đệm bao gồm hai chuỗi là NS và CS, một chuỗi bắt đầu từ ser 32 đến Ala 44 còn chuỗi khác bắt đầu từ Glu 454 tới Ala 459. Đầu N của vùng D1 (ND1a) bắt đầu Ala 44 và kéo dài tới Ala 99, đây chính là đoạn tiếp theo của đoạn ND1b. Sau đó, chuỗi tiếp tục kéo dài xuống phía dưới và quay ngược lại ở vị trí của hai chuỗi kẹp tóc õ và kết thúc ở trong domain D2. Đầu C của chuỗi xoắn ỏ trong vùng D1 (CD1) bắt đầu từ Asn 406 và kéo dài tới Glu 454. So với F41, quá trình kéo dài ND1a và CD1 lên phía trên của vùng D1 xuống phía dưới. Hai vùng D0, D1 có kích thước theo chiều dọc tương ứng khoảng 50 Å, 80 Å và vùng đệm có chiều dài khoảng 20 Å. 10 [...]... lập gen từ thư viện gen trong trường hợp gen quan tâm chưa biết trình tự và phân lập bằng kĩ thuật PCR khi đã biết trình tự của gen quan tâm 1.4.1.1 Phân lập gen từ ngân hàng gen Đặc trưng trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân sơ gồm các gen mã hoá liên tục không phân đoạn, còn ở sinh vật nhân chuẩn gen cấu trúc là những vùng mã hoá (exon) nằm xen kẽ với vùng không mã hoá (intron) Do đó để phân lập. .. việc biểu hiện gen ngoại lai mà còn thuận lợi cho việc tinh sạch trong quá trình thu nhận protein tái tổ hợp Do đó chúng tôi đã lựa chọn vector này để biểu hiện cho protein tái tổ hợp của gen ngoại lai fljB mã hoá cho kháng nguyên roi H: 1,2 của vi khuẩn S typhimurium 1.4.2.3 Chủng biểu hiện E coli BL21 Trong quá trình biểu hiện protein ngoại lai, người ta thường gặp phải một số vấn đề về chủng biểu hiện. .. Khi promoter của operon fljB- fljA nằm xuôi chiều, hai gen fljB và fljA sẽ được phiên mã Protein FljB sẽ tham gia vào cấu trúc roi Protein FljA có vai trò là một chất ức chế gen fliC Trong trường hợp này roi của vi khuẩn S typhimurium sẽ có pha H: 1,2, hay flagellin sẽ biểu hiện ở H: 1,2 Ngược lại, khi promoter của operon fljB- fljA đảo chiều theo cơ chế thắt thòng lọng (looping), gen fljB và fljA sẽ ngừng... khăn trong quá trình lựa chọn kháng nguyên để biểu hiện và sự hình thành đúng cấu trúc kháng nguyên sau khi biểu hiện Mặc dù vacxin nào cũng có ưu nhược điểm, nhưng riêng vacxin tái tổ hợp có nhiều ưu điểm hơn và ngày càng làm sáng tỏ hơn những vấn đề nảy sinh trong quá trình đáp ứng miễn dịch 1.4 Phân lập và biểu hiện gen 26 1.4.1 Phân lập gen Có hai cách chủ yếu được sử dụng để phân lập gen là: phân. .. biểu hiện các pha là khác nhau có thể một pha, hai pha thậm chí có thể nhiều hơn ba pha (ở S rubislaw) [47] Quá trình biểu hiện protein cấu trúc flagellin của Salmonella gồm hai pha do gen fliC và fljB quy định, được điều khiển biểu hiện không đồng thời 1.2.1.3 3 Cơ chế điều hoà biểu hiện protein roi H của Salmonella FliC, fljB quy định hai pha khác nhau của kháng nguyên H và được điều khiển biểu hiện. .. nhóm và được phân lập từ cùng một nguồn sinh vật thì việc phân lập gen trở nên đơn giản hơn rất nhiều Bằng kỹ thuật PCR, đoạn gen cần phân lập nằm trong trình tự đích được nhân lên một cách chính xác và thu được một số bản sao lớn với độ thuần khiết cao và dễ dàng được đưa vào vector tách dòng, phục vụ cho bước tiếp theo [1] 27 1.4.2 Biểu hiện gen 1.4.2.1 Hệ biểu hiện gen trong E coli E coli thuộc loại... epitop đặc trưng cho kháng nguyên H: i, vùng siêu biến của fljB (102 axit amin) mang epitop đặc trưng cho kháng nguyên H: 1,2 [17] Ngoài ra, tận cùng đầu N của protein còn có trình tự có vai trò quan trọng trong quá trình tiết và polyme hoá để cấu tạo nên trục roi [50] Bằng việc so sánh khả năng kết cặp đặc hiệu giữa kháng thể đơn dòng kháng fliC và kháng thể đơn dòng kháng fljB, Vries và cộng sự cho thấy,... Tế bào E coli BL21 chứa đột biến lon proteaza (một 29 proteaza nội bào) và ompT proteaza (một proteaza ngoại bào) không còn có khả năng thuỷ phân protein Như vậy, cả protein nội bào và ngoại bào ở E coli BL21 đều bất hoạt Ngoài những đặc điểm trên thì trong ADN hệ gen của E coli BL21 có chứa gen mã hoá cho T7 ARN polymeraza Đây là gen nguồn từ bacteriophage T7 được đưa vào hệ gen của E coli BL21 đặt... biểu hiện không đồng thời Gen fliC mã hoá cho kháng nguyên H: i (495 axit amin), gen fljB mã hóa cho kháng nguyên H: 1.2 (506 axit amin) Dựa vào trình tự axit amin của protein flagellin, người ta chia protein ra làm tám vùng khác nhau, trong đó vùng I, II, VIII là vùng bảo thủ, vùng IV, V, VI là những vùng siêu biến, xác định tính đặc hiệu cho kháng nguyên H Vùng 14 siêu biến của gen fliC (86 axit amin)... quá trình dịch mã của hai gen fliC và fljB nằm trong lớp gen muộn [22] Hoạt động tuần tự của các lớp gen sớm, trung gian có vai trò điều khiển sự biểu hiện của lớp gen muộn Quá trình sẽ kết thúc tại thời điểm protein flagellin được tạo ra và vận chuyển ra ngoài màng tế bào, tham gia lắp ghép để tạo nên phức hệ roi của vi khuẩn [46] hình 1.4 13 Hình 1.4 Cấu trúc phức hệ roi của vi khuẩn S typhimurium ở . cứu: Phân lập và biểu hiện gen fljB mã hoá kháng nguyên roi H: 1,2 của Salmonella typhimurium trong Escherichia coli BL21 nhằm thu được lượng lớn kháng. kháng nguyên bề mặt tế bào vi khuẩn: kháng nguyên thân hay kháng nguyên O (somatic antigen), kháng nguyên roi hay kháng nguyên H (flagellar antigen) và kháng
