Đang tải... (xem toàn văn)
Ứng dụng kĩ thuật RT-PCR để phát hiện Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***00*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 - 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***00*** ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI PGS.TS TRẦN THỊ DÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 - 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Các Thầy Cô và anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Cô Bích Liên, Thầy Ngọc, chị Trang và các Thầy Cô khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp Các bạn lớp Công Nghệ Sinh học 27 đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS.TS Trần Thị Dân đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận. Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ và luôn bên con trong mọi thời điểm. Thủ Đức, ngày 25 tháng 08 năm 2005 Nguyễn Nhất Bảo Quốc i TÓM TẮT NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Đề tài: “ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN”. Đề tài được thực hiện từ ngày 10/03/2005 đến ngày 15/08/2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Hội đồng hướng dẫn: TS. Nguyễn Ngọc Hải PGS.TS. Trần Thị Dân Mục tiêu của đề tài là thăm dò khả năng sử dụng quy trình RT-PCR để phát hiện virus gây bệnh PRRS trên lợn. Nội dung nghiên cứu bao gồm: - Xây dựng quy trình RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn của virus gây bệnh PRRS đồng thời kiểm tra khả năng của ba loại Taq dự kiến sử dụng (Taq Beat Hot Start của công ty Promega, Taq polymerase của công ty Biorad, Taq polymersa của công ty ABgene). - Ly trích RNA trên các mẫu phổi bằng quy trình dùng TRIzol và điện di RNA tổng số nhằm kiểm tra khả năng sử dụng quy trình này trong việc ly trích RNA của virus. - Ly trích RNA từ các mẫu huyết thanh và dịch nuôi cấy tế bào từ những lợn nghi ngờ bị nhiễm bệnh PRRS dựa vào kết quả ELISA. Sau đó thực hiện phản ứng RT-PCR để kiểm tra sự hiện diện RNA của virus gây bệnh PRRS trong các mẫu này. Kết quả, đã thành công trong việc xây dựng quy trình phát hiện RNA chuẩn của virus gây bệnh PRRS và đã áp dụng thành công trong việc sử dụng TRIzol để ly trích RNA. Tiến hành RT-PCR với sản phẩm ly trích RNA từ các mẫu thu nhận bằng cả hai quy trình sử dụng bộ kit và sử dụng TRIzol, kết quả thu nhận là tất cả các mẫu xét nghiệm đều không có sự hiện diện của virus tại thời điểm xét nghiệm. ii MỤC LỤC Tên mục Trang LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT . iv MỤC LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ix Phần I: MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích và yêu cầu 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 3 2.1.1 Giới thiệu . 3 2.1.2 Lịch sử bệnh 3 2.1.3 Dịch tễ học 4 2.1.4 Các con đường lây nhiễm . 5 2.1.4.1 Sự lây truyền dọc . 5 2.1.4.2 Sự lây truyền ngang . 6 2.1.5 Triệu chứng lâm sàng 7 2.1.6 Bệnh tích . 8 2.2 Các phương pháp dùng trong chẩn đóan bệnh do virus PRRS gây ra . 8 2.2.1. Phân lập virus sống . 8 2.2.2. Phân lập virus hoặc kháng nguyên virus . 9 2.2.3. Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh 10 2.2.4. Phương pháp RT- PCR để phát hiện virus gây bệnh PRRS . 12 2.3. Phương pháp PCR 13 2.3.1. Nguyên tắc 13 2.3.2. Các thành phần tham gia phản ứng PCR 13 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR 14 2.3.4. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR 15 iii 2.4 Phương pháp RT-PCR . 16 2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR . 16 2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược 16 2.4.3. Các primer trong phiên mã ngược 18 PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP . 20 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20 3.2. Nội dung nghiên cứu 20 3.3. Vật liệu và hóa chất 20 3.3.1. Mẫu xét nghiệm 20 3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR 20 3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA 21 3.3.4. Vật liệu và hóa chất cho điện di RNA 21 3.3.5. Vật liệu và hóa chất cho RT-PCR . 21 3.3.6. Vật liệu và hóa chất cho điện di sản phẩm RT-PCR . 22 3.4. Thiết bị và dụng cụ . 22 3.5. Các phương pháp . 22 3.5.1. Bảo quản dịch nuôi cấy tế bào 22 3.5.2. Chẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh 23 3.5.3. Tách chiết RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh theo quy trình sử dụng TRIzol . 23 3.5.4. Phương pháp điện di RNA trên gel biến tính 24 3.5.5. Phương pháp RT-PCR trên RNA virus . 25 3.5.6. Điện di sản phẩm RT-PCR 27 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 28 4.1. Kết quả RT-PCR trên mẫu chuẩn của PRRSV 28 4.1.1. RT-PCR với Taq beat hot start (Promega) 28 4.1.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene 29 4.2. Kết quả RT-PCR trên mẫu RNA ly trích . 30 4.2.1. RT-PCR với Taq beat hot start trên RNA ly trích từ huyết thanh bằng phương pháp sử dụng TRIzol 30 4.2.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene trên các mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào sử dụng quy trình ly trích theo bộ kit 31 iv 4.3. Điện di RNA trên mẫu ly trích 32 4.4. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer 33 4.5. RT-PCR sử dụng cặp primer P1, P2 33 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 35 5.1. Kết luận 35 5.2. Đề nghị . 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC x v DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT - AMV: Avian myeloblastosis virus - DEPC: Diethyl pyrocarbonate - dNTP: Deoxynucleotide triphosphate - EAV: Equine arteritis virus - EDTA: Ethylene diamine tetra acetid acide - ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay - FAb: Fluorescent antibody - FA: Formaldehyde agarose - IHC: Immunohistochemistry staining - IMPA: Immunoperoxidase monolayer assay - LDV: Lactase dehydrogenase elevating virus - MDS: Mystery swine disease - MOPS: 3- morpholine propane sulphonate - ORF: Open reading fraction - PAMs: Pulmonary alveolar macrophage - PRRSV: Porcine reproduction and respiratory syndrome virus - RT-PCR: Reverse transcriptase polymerase chain reaction - SHFV: Simian hemorrhagic fewer virus - SNV: Serum neutralization virus - TBE: Tris borate EDTA - TE: Tris EDTA - μl: Micro lit vi DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Tên mục Trang Sơ đồ 2.1. Quá trình hoặt động của các primer trong phiên mã ngược 19 Bảng 3.1. Cặp primer sử dụng trong phản ứng 21 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT-PCR . 25 Bảng 3.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR . 26 Hình 4.1. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng với Taq Beat Hot Start 28 Hình 4.2. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng Taq polymerase của công ty Biorad và Abgene. 29 Hình 4.3. Sản phẩm RT-PCR với Taq Beat trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo TRIzol 30 Hình 4.4. Sản phẩm RT-PCR dùng Taq ABgene trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo bộ kit 31 Hình 4.5. Sản phẩm điện di RNA sau ly trích 32 Hình 4.6. Sản phẩm RT-PCR dùng cặp primer P1, P2 trên một mẫu RNA chuẩn và 5 mẫu huyết thanh ly trích theo quy trình dùng TRIzol . 34 vii Phần I. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) là tác nhân chính gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRS (porcine reproductive and respiratory syndrome). Đây là một bệnh mới, phức tạp. Đặc trưng của bệnh là gây sẩy thai ở giai đoạn cuối, chết thai và thai khô hoặc lợn con sinh ra yếu, bệnh biểu hiện ở hệ hô hấp của lợn con theo mẹ và lợn cai sữa, bệnh còn làm trì hoãn sự động dục và những khó khăn về hô hấp ở lợn. Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các kiểu chăn nuôi: nuôi nhốt hay thả rong; tập trung hay phân tán, qui mô đàn lớn hay nhỏ và tình trạng sức khoẻ tốt hay xấu. Nguyên nhân lây bệnh phổ biến là do thiếu cách ly hoặc kiểm dịch đối với lợn mua, ở gần đàn mắc bệnh và qui mô đàn lớn. Do tính chất nghiêm trọng và khả năng lây lan rộng của bệnh, việc chẩn đoán và phát hiện bệnh sớm là rất quan trọng. Tuy nhiên việc phát hiện theo phương pháp nuôi cấy truyền thống thì lại rất khó khăn và mất nhiều thời gian. Cho đến những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đã phát triển một cách mạnh mẽ và chứng minh được vai trò ưu việt, trong đó kỹ thuật PCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi hơn. Đây là một kỹ thuật có độ chính xác cao, ít tiêu tốn thời gian và về mặt chi phí thì có thể chấp nhận được. Nhằm mục đích ứng dụng rộng rãi kỹ thuật sinh học phân tử vào công tác chẩn đoán, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS.TS Trần Thị Dân, chúng tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”. 1 [...]... c s v hỡnh thỏi hc, t chc gene, s sao chộp, dch mó v v trớ protein ging nhau, PRRSV ó c nh danh cựng nhúm vi virus gõy viờm ng mch nga (EAV: equine arteritis virus) , virus LDV (lactate dehydrogenase elevating virus) v virus gõy st xut huyt kh (SHFV: simian hemorrhagic fewer virus) Nhng h virus ny cú kh nng sao chộp trong i thc bo v nhim bnh lõu di trờn vt ch t nhiờn ca chỳng (dn liu t ti liu tham... thut RT-PCR trc tip phỏt hin s tn ti ca virus PRRS trong xỏc heo thng phm v trong tinh dch con c Trong thớ nghim ny vi t l huyt thanh dng tớnh l 85,4 % (205/240), nhng ch cú 11/140 mu mỏu cha lng virus cú th phỏt hin c bng RT-PCR ễng kt lun kt qu phn ng RT-PCR ph thuc rt nhiu vo mu phõn tớch (7).Wagstrom v cng s trong nghiờn cu ca mỡnh ó chng minh k thut RT-PCR trc tip cú kh nng phỏt hin RNA virus. .. Cỏc phng phỏp dựng trong chn oỏn bnh do virus PRRS gõy ra 2.2.1 Phõn lp virus sng Virus PRRS ch cú th nhõn lờn trờn hai loi t bo ú l: i thc bo tỳi phụi ca heo (PAMs: pulmonary alveolar macrophage) v dũng t bo thn kh chõu Phi iu ny cho thy rng cú ớt nht hai dng t bo cú th c s dng cho vic phõn lp virus Khi phõn lp virus PRRS dũng chõu u thng ũi hi phi s dng PAMs Virus PRRS c phõn lp t nhiu mu bnh lõm... mystery swine disease) 4 u tiờn cú rt nhiu ý kin v nguyờn nhõn gõy ra trn i dch, bao gm, nguyờn nhõn do virus viờm nóo v c tim (Encephalomyocarditis), hog cholera virus, porcine enterovirus, porcine parvovirus, pseudorabies virus, v c nguyờn nhõn do thc n b nhim c t nm (mycotoxins) Canada, mt dng virus gõy bnh cỳm type A c phõn lp heo con bnh v hụ hp v cng c a vo danh sỏch nghi ng nguyờn nhõn gõy... khỏng th ca m i vi virus PRRS cú th gõy khú khn cho vic phõn lp virus Kh nng sng ca virus trong cỏc mu bnh phm i vi nhng iu kin nhit mụi trng khỏc nhau tựy thuc vo mu bnh lõm sng (phi, lỏch, tuyn c v huyt thanh) Khuyn cỏo rng nhng mu mụ v nhng mu bnh phm s dng cho vic phõn lp virus cn c gi 40C hay thp hn trong quỏ trỡnh vn chuyn mu n phũng thớ nghim nhm lm gia tng kh nng phõn lp virus Nu nh nhng mu... hin bi phn ng SNV) khỏng virus PRRS phỏt trin chm trong 1 n 2 thỏng sau khi nhim (19) 11 Khỏng th c hiu i vi virus PRRS thng khụng kộo di trong thi gian sng ca thỳ i vi nhng thỳ gõy nhim virus PRRS thc nghim, khỏng th c hiu i vi virus u tiờn c phỏt hin bi IgG-IFA, IPMA, ELISA v SNV trong thi gian t 5 n 9 ngy, 9 n 11 ngy, 9 n 13 ngy, v 9 n 28 ngy sau nhim Khỏng th IgM c hiu i vi virus PRRS c phỏt hin... truyn ca virus PRRS thụng qua nhiu con ng khỏc nhau (4) 2.1.4.1 S lõy truyn dc S lan truyn ca virus PRRS qua nhau thai c bỏo cỏo u tiờn bi Christianson v cng s (1992) Cho n ngy nay, ó cú nhng chng c chc chn rng virus xut hin thỏng th ba trong quỏ trỡnh mang thai Tuy nhiờn, Molitor v 6 cng s (2001) khỏm phỏ ra rng trong mt vi trng hp virus cú th phõn lp vo ngy th 30 trong thi k mang thai (4) Virus PRRS... phõn lp virus khi cú s bựng phỏt nghiờm trng virus PRRS, khụng ph thuc vo tui ca thỳ nhim PRRSV trong huyt thanh n nh hn trong mụ i vi nhng thỳ gi, virus PRRS cú th mụ nhiu hn mỏu Nu s dng cỏc mu mụ, cú th s dng cỏc loi mu mụ phi, hch hnh nhõn v nt bch huyt S la chn mu cng ph thuc vo giai on nhim bnh (cp tớnh, hi phc, bnh kộo di) Huyt thanh, phi v dch ph nang l nhng 9 mu c chn phõn lp virus i vi...2 1.2 Mc tiờu yờu cu Mc tiờu Thm dũ kh nng ng dng k thut RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) trong chn oỏn virus PRRS Yờu cu - Thit lp quy trỡnh phỏt hin s hin din RNA ca virus PRRS trong mu RNA chun - Ly trớch RNA v in di RNA t mt s mu bnh phm - S dng quy trỡnh RT - PCR va thit lp kim tra s hin din RNA virus trong huyt thanh v trong dch nuụi cy t bo 3 Phn II TNG QUAN... Nụng Lõm Thnh Ph H Chớ Minh 3.2 Ni dung nghiờn cu Xõy dng quy trỡnh RT-PCR phỏt hin virus PRRS t ba ngun Taq khỏc nhau Xõy dng quy trỡnh in di phỏt hin RNA tng s Ly trớch RNA t dch nuụi cy t bo v huyt thanh ca heo nghi nhim PRRSV bng cỏch s dng hai phng phỏp ly trớch theo b kit v s dng TRIzol Chn oỏn virus PRRS t mu thu nhn bng quy trỡnh RT-PCR ó thit lp 3.3 Vt liu v hoỏ cht 3.3.1 Mu xột nghim Mu RNA . tra để phát hiện tình trạng nhiễm virus PRRS của đàn. 2.2.4. Kỹ thuật PCR để phát hiện PRRSV Kỹ thuật PCR được phát triển để phát hiện RNA của virus. Minh. Đề tài: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN”. Đề tài được thực hiện từ ngày
