Đang tải... (xem toàn văn)
PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn ADN đặc trưng mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men.bài cáo được làm bằng file powerpoint thuyết trình về kỹ thuật PCR hoàn chỉnh đầy đủ mà chi tiết, súc tích
1. Lịch sử. 2. Phương pháp PCR. 3. PCR cải tiến. 4. Ứng dụng PCR. PCR oligonucleotide Taq polymerase Thermus aquaticus Primer: mồi DNA polymerase Nested PCR: PCR tổ Wobble position: vị trí không bền. RT-PCR DNA duplex: DNA mạch đôi recombinant Taq polymerase:Taq polymerase tái tổ hợp Processivity: AP-PCR inverse PCR: PCR đảo inosine primer design: thiết kế mồi. Sequence: trình tự RAPD-PCR DNA templates: DNA mẫu. rate of synthesis: tốc độ tổng hợp Amplicon: đoạn DNA đôi primer length: chiều dài của mồi. nhiệt độ nóng chảy (Tm) Competitor RT-PCR sốc nhiệt biến tính thermostable chu trình nhiệt PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn ADN đặc trưng mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men. Kỹ thuật này do KARL MULLIS phát minh vào năm 1985. Ông đạt giải nobel hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này. Mullis đã phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA Polymerase. 28/12/1944 Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp ADN. Là phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước: Target Sequence Target Sequence T a r g e t S e q u e n c e T a r g e t S e q u e n c e P r i m e r 1 P r i m e r 2 5 ’ 3 ’ 5 ’ 5 ’ 3 ’ 5 ’ 3 ’ 3 ’ T a r g e t S e q u e n c e T a r g e t S e q u e n c e P r i m e r 1 P r i m e r 2 5 ’ 3 ’ 5 ’ 5 ’ 3 ’ 5 ’ 3 ’ 3 ’ T a q D N A P o l y m e r a s e T a r g e t S e q u e n c e T a r g e t S e q u e n c e No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon [...]... RAPD -PCR →nhiều đoạn DNA: A và B Nếu bị đột biến làm xuất hiện hay mất đi vị trí bắt cặp ngẫu nhiên: B Điện di phát hiện sản phẩm Mồi của RAPD -PCR: • Phải có sự định hướng chuyên biệt • Phải có khoảng cách hợp lý giữa các mồi với nhau Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công, Thao tác đơn giản Thời gian thực hiện nhanh Khả năng nhân bản cao Những hạn chế của kỹ thuật. .. Polymerase cDNA cDNA Tăng độ nhạy và độ chính xác của phản ứng PCR Sử dụng 02 cặp mồi Cặp mồi ngoài ⇒ Sản phẩm PCR lần 1 Cặp mồi trong ⇒ sản phẩm PCR lần 2 ngắn hơn Khuếch đại trình tự kế cận với trình tự DNA đã biết trước Thiết kế mồi dựa trên trình tự DNA đã biết trước Dùng RE cắt và DNA ligase nối lại Dựa trên kỹ thuật PCR nhằm đánh giá tính đa hình của các đoạn DNA được nhân bản ngẫu... lượng thấp RT -PCR bao gồm hai bước chính: Phiên mã ngược(RT), trong đó RNA được phiên mã ngược →cDNA bằng cách sử dụng reverse transcriptase (hoạt tính polymerase 5’→3’) Phản ứng PCR lần hai khuếch đại cDNA ence Target Sequ 3’ 5’ 5’ 3’ Primer Seque Target RNA n ce 3’ 5’ 5’ 3’ Primer lymera rTth DNA Po se q u en ce rget RNA Se Ta cDNA PCR Step 1 PCR Step 2 PCR Step 3 End of 1st PCR Cycle Target... RAPD dễ thực hiện và dễ thành công, Thao tác đơn giản Thời gian thực hiện nhanh Khả năng nhân bản cao Những hạn chế của kỹ thuật RAPD : - Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao không ổn định PCR có thể được sử dụng để nhân dòng vô tính các trình tự đã biết PCR dùng để nhân dòng gen vô tính từ một sinh vật bằng cách sử dụng đoạn mồi nếu có vài dữ kiện có sẵn mà đoạn gen yêu cầu Sử dụng trong... Enzyme chịu nhiệt: phản ứng PCR đặc hiệu hơn Tùy mục đích sử dụng: Enzyme chịu nhiệt : Thermus thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu) Enzyme có hoạt tính sửa sai (proofreading): Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu, Nhờ vậy mà người dùng có rất nhiều chọn lựa Taq polymerase từ Thermus aquaticus được dùng nhiều RT -PCR (reverse transcription -PCR) là một phương pháp nhạy... là vấn đề đặt ra lớn nhất đối với PCR Sự sai sót do Taq Polymerase gây ra Mồi: một trình tự DNA hay RNA ngắn, bắt cặp với một mạch khuôn DNA và có mang một đầu 3’OH tự do giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới Mồi là một đoạn Oligonucleotide được thiết kế theo yêu cầu từ nhiều nguồn thương mại khác nhau Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất trong phương pháp PCR Cách xác định trình tự mồi:... Kết thúc quá trình PCR, các đoạn DNA được nhân bản lên nhiều lần (gọi là các đơn vị khuếch đại theo hàm mũ) Dùng phương pháp điện di để kiểm tra kích thước cũng như độ tinh sạch, đồng nhất của DNA đã khuếch đại Sản phẩm của PCR có thể dùng để tạo dòng và biểu hiện vào trong vector DNA polymerase: Taq polymerase . Phương pháp PCR. 3. PCR cải tiến. 4. Ứng dụng PCR. PCR oligonucleotide Taq polymerase Thermus aquaticus Primer: mồi DNA polymerase Nested PCR: PCR tổ Wobble position: vị trí không bền. RT -PCR DNA. polymerase:Taq polymerase tái tổ hợp Processivity: AP -PCR inverse PCR: PCR đảo inosine primer design: thiết kế mồi. Sequence: trình tự RAPD -PCR DNA templates: DNA mẫu. rate of synthesis: tốc. đôi primer length: chiều dài của mồi. nhiệt độ nóng chảy (Tm) Competitor RT -PCR sốc nhiệt biến tính thermostable chu trình nhiệt PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh