Đang tải... (xem toàn văn)
Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp hormone IAA là những chủng vi khuẩn đem lại sự tương tác tốt với thực vật giúp cái thiện sự sinh trưởng phát triển thực vật hướng tới một tiềm năng lớn cho phát triển các dòng kích thích sinh trưởng sinh học an toàn cho cây trồng và môi trường
LỜI CẢM ƠN Sau 4 năm học tập tại Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, trong quá trình thực tập tốt nghiệp tại Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, nhờ sự giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của bộ môn, cùng với sự nỗ lực, học tập của bản thân, em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình. Em xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, và những người thân của em đã nuôi nấng, động viên và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Đặng Thị Thanh Tâm, giảng viên bộ môn Công nghệ sinh học thực vật đã tận tình hướng dẫn và dạy dỗ em trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới ThS. Nguyễn Thị Thủy, ThS. Phạm Thị Thu Hằng cán bộ tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài, em xin gửi lời cảm ơn đến sinh viên Nguyễn Thị Hiền đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện các thí nghiệm lây nhiễm, em xin cảm ơn đến nhóm sinh viên nghiên cứu khoa học do giảng viên Đặng Thị Thanh Tâm hướng dẫn đã giúp đỡ em các thí nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, và em xin cảm ơn toàn thể bạn bè và các anh, chị đang thực tập tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực tập. Hà Nội, ngày 01 tháng 01 năm 2014 Sinh viên thực hiện Hoàng Mạnh Hùng MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Chữ đầy đủ Nghĩa tiếng việt 1 AMF Arbuscular mycorrhiza fungi Nấm vùng rễ Arbuscular 2 Cs Cộng sự 3 CT Công thức Công thức 4 ĐC Đối chứng Đối chứng 5 FLPs Fluorescent Pseudomonas Chủng vi khuẩn Fluorescent Pseudomonas 6 IAA Indol - 3 - acetic acid 7 PGPR Plant growth promoting rhizobacteria Vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật 8 PSB Phosphate solution bacteria Vi khuẩn phân giải phốt pho 9 PSF Phosphate solution fungi Nấm phân giải phốt pho 10 PSM Phosphate solution microorganism Vi sinh vật phân giải phốt pho 11 PGP Plant growth promoting Thúc đẩy tăng trưởng thực vật DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH TÓM TẮT PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) được gọi là những chủng vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật. Nhóm vi khuẩn tổng hợp IAA là nhóm vi khuẩn vùng rễ đang được nghiên cứu hiện nay nhằm cải thiện tỉ lệ nảy mầm hạt giống, chất lượng cây trồng thông qua sự thúc đẩy nảy mầm, tăng chiều cao của cây, tăng chiều dài và diện tích bề mặt rễ, do đó cho phép các loài thực vật dễ hấp thu chất dinh dưỡng và nước từ đất. Đề tài này nhằm phân lập, sàng lọc, tuyển chọn, đánh giá được các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA đối với sự nảy mầm của hạt cũng như sự phát triển của cây con. Từ hai vị trí địa lý khác nhau (Thị trấn Trâu Quỳ, Hà Nội; Huyện Nam Sách, Hải Dương) chúng tôi tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn trên bề mặt rễ và cộng sinh cùng với rễ lúa và tuyển chọn được 4 chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA cao nhất so với một số chủng phân lập từ sản phẩm thương mại là: RHT1 (857,8 µg/ml); RHT2 (855,85 µg/ml); RĐ15 (621,75 µg/ml); RA22 (781,3 µg/ml). Bốn chủng vi khuẩn sau khi đã tuyển chọn được tiếp tục nghiên cứu môi trường thích hợp cho khả năng tổng hợp IAA được tốt nhất thông qua việc xác định các nhân tố ảnh hưởng như pH, thời gian, các nguồn cacbon, nguồn nitơ, nồng độ của tiền chất, Kết quả của nghiên cứu này đã tìm ra được một môi trường tối ưu nhất cho khả năng tổng hợp IAA đối với từng chủng vi khuẩn là khác nhau. Đối với chủng RHT1 thì môi trường tối ưu là môi trường: King’B + 3g/l L-Tryptophan + 1% Saccarose + 1,5% KNO 3 và môi trường có pH = 6. Môi trường thích hợp với chủng RHT2 là môi trường King’B + 3g/l L- Tryptophan + 1% Manitol với pH = 8. Môi trường King’B + 3g/l L-Tryptophan + 1% Glucose + 0,5% KNO 3 với pH = 5 là môi trường tối ưu nhất cho chủng vi khuẩn RĐ15. Còn chủng RA22 đạt được nồng độ IAA cao nhất khi được nuôi cấy trong môi trường King’B + 3g/l L-Tryptophan + 1% Saccarose + 0,5% KNO 3 với giá trị pH = 5. Đề tài này mở ra một giải pháp mới cho việc thay thế các chất kích thích tăng trưởng hóa học bằng các chất kích thích tăng trưởng nội sinh được sinh ra trong các chủng vi khuẩn có lợi PGPR giúp kích thích sự nảy mầm của hạt cũng như sự phát triển của cây trổng. Các chủng vi khuẩn này với có những kết quả tác động khác nhau khi lây nhiễm trên hạt giống của 8 giống lúa khác nhau. Các chủng vi khuẩn đều được lây nhiễm với hạt lúa ở giá trị OD 600 = 0,1 ở hai trường hợp là độc lập và kết hợp. Trong 8 giống lúa được lây nhiễm với các công thức vi khuẩn khác nhau thì có 6 giống lúa cho kết quả về khả năng sinh trưởng của cây nảy mầm từ hạt tốt hơn với công thức đối chứng. Cụ thể giống BC15 đạt được khả năng sinh trưởng cao nhất là 1297,52 khi lây nhiễm với công thức RĐ15.RA22; giống Nv1 có khả năng sinh trưởng tốt nhất là 640,42 với công thức vi khuẩn RHT2; giống BT7 có khả năng sinh trưởng tốt nhất là 838,70 khi lây nhiễm với công thức RHT2; giống KD18 có khả năng sinh trưởng tốt nhất là 670,00 khi lây nhiễm với công thức RHT1.RA22; giống N46 có khả năng sinh trưởng tốt nhất là 1046,00 khi lây nhiễm với công thức RĐ15.RA22; giống T23 có khả năng sinh trưởng tốt nhất là 924,30 khi lây nhiễm với công thức RA22. Còn 2 giống lúa còn lại N91, T65 cũng được lây nhiễm với các công thức vi khuẩn tương tự như các giống lúa còn lại nhưng khả năng sinh trưởng thấp hơn công thức đối chứng có thể được giải thích về khả năng tổng hợp IAA quá cao của các chủng vi khuẩn dẫn đến tác động vào sự cân bằng của nồng độ auxin nôi sinh, auxin ngoại sinh của mô tế bào thực vật và sự mất cân bằng giữa tỷ lệ giữa auxin và cytokinin nên đã dẫn đến kết quả thấp hơn các công thức đối chứng. Như vậy có thể thấy rằng tùy thuộc vào từng giống lúa khác nhau, vào nồng độ của hormone nội sinh, sự tương tác của các đơn chủng hay đa chủng vi khuẩn có sự ảnh hưởng nhất định đến khả năng sinh trưởng của từng giống. PHẦN I. MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Theo nghiên cứu và số liệu thống kê của Godfray và cộng sự (2010), dân số thế giới được giả định tăng từ 7 tỷ ở hiện tại lên 8,3 tỷ USD trong năm 2025 và như vậy thế giới sẽ cần nhiều thức ăn hơn 70 đến 100 % vào năm 2050. Chính vì thế, việc sản xuất các loại ngũ cốc, đặc biệt là lúa mì, gạo và ngô, chiếm một nửa lượng calo của con người, cũng phải được tăng lên để đáp ứng nhu cầu. Hiện nay, sự tăng trưởng sinh khối thực vật được tăng cường bởi các nguồn bổ sung của hóa chất mà hoạt động như chất điều hòa sinh trưởng thực vật (sử dụng một cơ chế kích thích tố) và các chất dinh dưỡng. Các chất dinh dưỡng được bổ sung vào đất thành phần chủ yếu lànitơ, phốt pho và kali. Theo Roberts (2009) việc sử dụng toàn cầu hàng năm của nitơ hóa học, phốt pho và phân bón kali là 130, 40, và 35 triệu tấn. Tương ứng với việc sử dụng nhiều của hóa chất trong trồng trọt dẫn đến một số vấn đề như ô nhiễm nước, suy thoái đất, mất đa dạng sinh học và tăng nguy cơ ảnh hưởng có hại đến sức khỏe cho con người. Hiện nay một hướng nghiên cứu đang rất được các nhà khoa học quan tâm đó là sử dụng các vi khuẩn vùng rễ có khả năng kích thích sinh trưởng của thực vật (plant growth-promoting rhizobacteria - PGPR). Vi khuẩn thúc đẩy sinh trưởng thực vật là các loài vi khuẩn có thể được tìm thấy trong các vùng rễ, bề mặt rễ và có thể cải thiện mức độ hay chất lượng sự phát triển của thực vật một cách trực tiếp và hoặc gián tiếp. Một trong những cơ chế trực tiếp mà nhóm vi khuẩn PGPR giúp tăng trưởng thực vật đáng quan tâm là các chủng PGPR có khả năng sản xuất và điều chỉnh sự tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng hay phytohormone trong cá thể thực vật (Glick năm 1995). Đặc biệt các chủng có khả năng sản sinh chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin Indole-3-acetic acid (IAA) như Rhizobium, Microbacterium, Sphingomonas, Mycobacterium, Bacillus, Pseudomonas và Azotobacter (Choi và cs, 2008) được đánh giá là có ý nghĩa to lớn đối với nền sản xuất nông nghiệp khi các báo cáo ở các tài liệu trên thế giới đã chỉ ra rằng PGPR có thể kiểm soát các tác nhân từ nguồn bệnh và sâu bệnh, kích thích tăng trưởng thực vật, tăng năng suất cây trồng và cải thiện chất lượng các sản phẩm nông nghiệp, chúng có thể có những tác động diễn ra đồng thời ở thực vật hay theo một tuần tự (Lugtenberg và cs, 2013). Từ những cơ sở thực tiễn nói trên chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu: “Đánh giá tác động của một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh IAA đến sự nảy mầm, và sinh trưởng của cây con nảy mầm từ hạt trên cây lúa”. Hướng nghiên cứu tập trung chủ yếu phân lập, đánh giá, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA cao và tác động tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của cây con nảy mầm từ các loại hạt giống khác nhau 2. Mục đích và yêu cầu 2.1. Mục đích Đánh giá sự tương tác của một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh IAA đến sự nảy mầm và sự sinh trưởng của cây con nảy mầm từ hạt lúa. 2.2. Yêu cầu - Phân lập được các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA từ rễ cây lúa. - Đánh giá được các đặc điểm sinh học và các điều kiện tối ưu tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn phân lập được. - Đánh giá được khả năng tương tác của các chủng vi khuẩn phân lập được đến sự nảy mầm của hạt lúa trong điều kiện invitro. - Đánh giá được khả năng tương tác của các chủng vi khuẩn phân lập được đến sự sinh trưởng của cây con nảy mầm từ hạt lúa trong điều kiện invitro. PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR) 1.1. Khái niệm Sự phát triển của thực vật trên nền đất nông nghiệp chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố vô sinh và hữu sinh. Khái niệm vùng rễ lần đầu tiên được giới thiệu bởi Hiltner để mô tả các vùng hẹp của đất xung quanh rễ, nơi dân số vi khuẩn được kích thích phát triển bởi sự hoạt động của rễ (Hiltner, 1904). Theo McCully (2005), vùng rễ bao gồm đất xung quanh rễ cũng như các nhân tố vật lý, hóa học, sinh học ở trong đấy đã được thay đổi bởi hoạt động của rễ. Ngoài một số lượng lớn các vi khuẩn còn có các vi sinh vật khác như nấm, động vật nguyên sinh và tảo cùng tồn tại trong vùng rễ. Để hỗ trợ cho các hoạt động của những vi khuẩn có lợi cho vùng rễ của mình, thực vật sẽ giải phóng các hợp chất hữu cơ thông qua dịch tiết (Lynch, 1990) tạo ra một môi trường sống rất chọn lọc (García và cs, 2001). Tầm quan trọng của vi khuẩn vùng rễ từ lâu đã được công nhận, tuy nhiên, vi khuẩn vùng rễ chỉ là một phần nhỏ trong tổng số đa dạng sinh học đất. Có một nhóm vi khuẩn đất trong các thập niên gần đây đang được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu là nhóm vi khuẩn được gọi là vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPR). Vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật là vi khuẩn cư ngụ ở rễ cây, chúng có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật, làm giảm bệnh hoặc các thiệt hại do côn trùng. PGPR đã và đang được quan tâm nghiên cứu rất nhiều và nhiều sinh phẩm của nó đã được thương mại hóa phục vụ cho sản xuất nông nghiệp (Antoun và Kloepper, 2001). Ví dụ, chi Rhizobium là nhóm vi khuẩn vùng rễ được biết đến rộng rãi nhất và nó đã được thương mại hóa thành công với nhiều ứng dụng thực tế trong nông nghiệp theo nguyên lý phát triển cộng sinh với thực vật (Saharan và cs, 2011). Vào đầu những thế kỉ này, mặc dù có rất nhiều loài vi khuẩn liên kết hay cộng sinh với thực vật từ đó kiểm soát sự sinh trưởng của thực vật nhưng chúng lại chưa được nghiên cứu rộng rãi cho đến khi các công bố mang tính đột phá về sự tương tác của vi khuẩn đến thực vật từ những nghiên cứu của Bashan và Holguin (1998), sự phát hiện vi khuẩn Pseudomonads có khả năng kiểm soát các mầm bệnh và gián tiếp điều khiển sự phát triển thực vật của Kloepper và cs(1980), hay việc tìm thấy Azosprillum sp., a [...]... Patten, 2008) Có rất nhiều loài vi khuẩn có khả năng tạo ra IAA - hoóc môn thực vật nhóm auxin Con đường sinh tổng hợp tạo ra IAA đã được xác định, lượng IAA dư thừa từ sinh tổng hợp đã tạo nên sự tương tác giữa thực vật và vi khuẩn Tương tác giữa vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA và thực vật dẫn đến sự thay đổi về bệnh lý trong miễn dịch thực vật Xem xét vai trò của vi khuẩn có khả năng sinh IAA trong... của gen sinh tổng hợp IAA trong hệ gen không có nghĩa là vi khuẩn có khả năng sản xuất IAA: chức năng phân tích các gen vẫn còn cần thiết để xác nhận khả năng tổng hợp IAA Sự tách cặp giữa biểu hiện của gen sinh tổng hợp IAA và khả năng sinh tổng hợp IAA được minh họa bằng vi khuẩn kỵ khí phân hủy Nitơ ở dạng khử là Azoarcus chủng EbN1 Hệ gen mã hóa cho phenylpyruvate decarboxylase và các gen khác là... với các chủng PGPR sản xuất IAA, có một sự gia tăng đáng kể trong sự phát triển của các loại thực vật này (Kidoglu và cs, 2007) Vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA đóng một vai trò quan trọng trong thúc đẩy nảy mầm hoa lan, ít nhất là khi các chủng vi khuẩn đã được gắn chặt chẽ với các hạt giống Chủng Azospirillum brasilense Az39 và Brayrhizobium japonicum dòng E109 cả hai đều có khả năng bài tiết IAA vào... loài vi khuẩn khác nhau thì có các con đường tổng hợp IAA khác nhau đã được xác định Tìm thấy sự tương đồng giữa con đường sinh tổng hợp IAA ở thực vật và vi khuẩn Tổng quan về con đường sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn được mô tả bởi Spaepen và cộng sự (2007) (Hình 3), và tình trạng hiện tại của các gen liên quan, protein và các trung gian chất chuyển hóa được thảo luận Nếu có thể, so sánh với cây sinh tổng. .. vi khuẩn vùng rễ với khả năng gây nên sự tích tụ IAA dưới các áp lực chất dinh dưỡng, biến động môi trường, nuôi cấy hàng loạt dài hạn và có ảnh hưởng tích cực đến sự phát triển của lúa miến Hơn nữa, nó cũng có khả năng thúc đẩy sự phát triển của một số loại cây trồng khác như đậu xanh, ngô, và lúa mỳ (Malhotra và Srivastava, 2008) Một số vi khuẩn hòa tan P và hoạt động của một số loài nấm có khả năng. .. hơn về con đường sinh tổng hợp IAA khác nhau hiện diện trong vi khuẩn 3.2 Sàng lọc các gen quy định cho khả năng tổng hợp IAA ở vi khuẩn Có ý kiến cho rằng 80% các vi khuẩn vùng rễ sản xuất IAA (Patten và Glick, 1996; Khalid và cs, 2004) Tuy nhiên, nghiên cứu về xác định và mô tả đặc điểm các gen chủ chốt hoặc protein liên quan đến sinh tổng hợp IAA là ít và hầu như đã được hướng dẫn đến một gen cụ thể... những phân tích tỉ mỉ hơn về các loài vi khuẩn, vai trò của IAA tổng hợp từ vi khuẩn trong các tương tác với thực vật thì các đặc điểm vi sinh vật xuất hiện được đa dạng hơn Sự phân bố rộng của gen sinh tổng hợp IAA trên vi khuẩn, sự tồn tại của con đường trao đổi chất khác nhau và sự đa dạng trong kết quả về phía thực vật khi vi khuẩn tổng hợp IAA tương tác với thực vật, gợi lên câu hỏi là tại sao vi khuẩn. .. của rễ cây để hấp thụ nước và chất dinh dưỡng Vi khuẩn vùng rễ là nhóm vi khuẩn đầu tiên có khả năng của PGPR để tổng hợp IAA thúc đẩy sự tăng trưởng và kháng bệnh trong các loài thực vật (Mandal và cs, 2007) Tổng hợp IAA được nghiên cứu trong các chủng Rhizobium liên kết với một vài vật chủ như trong cây họ đậu (Roy và Basu, 2004) Tuy nhiên, Sridevi và Mallaiah (2007) cho thấy rằng tất cả các chủng. .. trong vi c lựa chọn và làm phong phú thêm các loại vi khuẩn Vì vậy, cộng đồng vi khuẩn trong vùng rễ phát triển tuỳ theo tính chất và nồng độ các hợp chất hữu cơ của dịch tiết cũng như khả năng tương ứng của vi khuẩn để sử dụng như các nguồn năng lượng đó (Curl và Truelove, 1986) Theo Hallmann và cộng sự (1997) liên tục thấy sự tồn tại của vi khuẩn trong đất vùng rễ, bề mặt rễ và nội bào của các mô... dinh dưỡng của phân bón và cho phép áp dụng tỉ lệ giảm phân bón hóa học (Adesemoye và cs, 2009) Vi c sử dụng PGPR phân lập được như những chế phẩm phân bón sinh học có lợi cho canh tác lúa giúp tăng cường sự phát triển của lúa bằng cách thúc đẩy tăng trưởng những chỉ tiêu sinh lý khác Ứng dụng sự tương tác kết hợp của PGPR như phân sinh học ảnh hưởng đến năng suất và có lợi cho tăng trưởng của đậu . cây trồng bị hạn chế do độ mặn của nước trong hệ thống thủy lợi cũng như độ mặn đất quá cao. Khi độ mặn cao, thực vật giảm tốc độ tăng trưởng lá do giảm sự hấp thu nước, trong đó hạn chế khả năng. tính độc hại. Xyanua hoạt động như một chất ức chế chuyển hóa chung, nó được tổng hợp, bài tiết và chuyển hóa bởi hàng trăm sinh vật, bao gồm vi khuẩn, tảo, nấm, thực vật và côn trùng, nó được sử. với pH = 5 là môi trường tối ưu nhất cho chủng vi khuẩn RĐ15. Còn chủng RA22 đạt được nồng độ IAA cao nhất khi được nuôi cấy trong môi trường King’B + 3g/l L-Tryptophan + 1% Saccarose + 0,5% KNO 3