TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC HUỲNH VĂN TIỀN MSHV: 62031104 ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƢỚC THẢI SAU BIOGAS CỦA TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH VI SINH VẬT HỌC 2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC HUỲNH VĂN TIỀN MSHV: 62031104 ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƢỚC THẢI SAU BIOGAS CỦA TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGS. TS. TRƢƠNG TRỌNG NGÔN PGS. TS. NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG 2015 i LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn: PGS.TS. Trương Trọng Ngôn, GS.TS. Cao Ngọc Điệp, PGS. TS. Hà Thanh Toàn và PGS. TS. Ngô Thị Phương Dung đã dành thời gian quý báu tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án Quý Thầy Cô giảng dạy chương trình nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi sinh vật học, trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập. Cán bộ phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật và Sinh học Phân tử của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án. Cám ơn gia đình và tất cả bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thời gian thực hiện đề tài! Tác giả HUỲNH VĂN TIỀN ii CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của NCS Huỳnh Văn Tiền với sự hướng dẫn của PGS. TS. Trương Trọng Ngôn và PGS. TS. Ngô Thị Phương Dung. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố riêng lẻ bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào trước đây. Người hướng dẫn khoa học PGS. TS. TRƢƠNG TRỌNG NGÔN PGS. TS. NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG Tác giả luận văn HUỲNH VĂN TIỀN iii MỤC LỤC Trang Lời cảm tạ i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh sách bảng vii Danh sách hình x Danh mục từ viết tắt xiii Tóm tắt xv Abstract xvii Chƣơng 1: Giới thiệu 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2 1.2.1 Mục tiêu đề tài 2 1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2 1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3 1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 3 1.5 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học 4 Chƣơng 2: Tổng quan tài liệu 5 2.1 Tổng quan về chất thải chăn nuôi heo 5 2.1.1 Đặc điểm của nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo 5 2.1.2 Quản lý chất thải chăn nuôi heo trên thế giới 5 2.1.3 Quản lý chất thải chăn nuôi heo tại Việt Nam 6 2.2 Xử lý nƣớc thải trong chăn nuôi 7 2.2.1 Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước 7 2.2.2 Biện pháp xử lý nước thải 8 2.3 Kết tụ sinh học trong nƣớc 9 2.3.1 Kết tụ sinh học (Bioflocculant) 9 2.3.2 Nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 18 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kết tụ của vi khuẩn 23 2.3.4 Ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nước thải 29 iv 2.3.5 Quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trong xử lý nước thải 31 Chƣơng 3: Phƣơng pháp nghiên cứu 33 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 33 3.1.1 Thời gian 33 3.1.2 Địa điểm 33 3.1.3 Vật liệu 33 3.1.4 Thiết bị 34 3.1.4 Hóa chất 34 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 35 3.2.1 Chuẩn bị mẫu 35 3.2.2 Phân lập và làm thuần 36 3.2.3 Phân tích và xử lý số liệu 38 3.3 Nội dung nghiên cứu 38 3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 38 3.3.2 Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kế tụ sinh học 40 3.3.3 Nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bằng sinh học phân tử 41 3.3.4 Phân tích các chỉ số đa dạng di truyền dựa trên trình tự 16S rRNA 46 3.3.5 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chất kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn được tuyển chọn 47 3.3.6 Ly trích chất kết tụ sinh học 53 3.3.7 Thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải chăn nuôi heo sau biogas của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 54 3.7.8 Ứng dụng các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nước thải sau biogas 55 Chƣơng 4: Kết quả và thảo luận 56 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học… 56 4.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 57 4.2.1 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein 57 4.2.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 58 v 4.3 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 59 4.3.1 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein 59 4.3.2 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 59 4.4 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cao ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long 61 4.4.1 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein 61 4.4.2 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 68 4.5 Phân tích đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 74 4.5.1 Đa dạng về chủng giữa của các loài vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa vào chỉ số Shannon 76 4.5.2 Đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 77 4.6 Xác định các điều kiện tối ƣu cho khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium LA51P (protein) và chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai KG12S (polysaccharide) 91 4.6.1 Mối tương quan giữa thời gian nuôi ủ, tỷ lệ kết tụ và mật độ vi khuẩn 91 4.6.2 Nhiệt độ nuôi ủ 93 4.6.3 Giá trị pH 94 4.6.4 Sự tương tác giữa các điều kiện nuôi sinh khối về thời gian, pH và nhiệt độ của hai chủng vi khuẩn 97 4.6.5 Nguồn carbon, nguồn nitrogen và khoáng vô cơ 101 4.6.6 Xác định ảnh hưởng tương tác của 3 yếu tố dinh dưỡng đến hiệu quả kết tụ sinh học 102 4.6.7 Ion kim loại bổ sung 106 4.6.8 Nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung 108 4.6.9 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số vi khuẩn và tỷ lệ kết tụ của 2 chủng vi khuẩn sau khi tối ưu 109 4.6.10 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn protein 110 vi 4.6.11 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn polysaccharide 111 4.6.12 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học cao được chọn thử nghiệm hiệu suất ứng dụng 112 4.7 Ly trích chất kết tụ sinh học đƣợc tổng hợp từ hai chủng vi khuẩn Bacillus megaterium LA51P và Bacillus aryabhattai KG12S và thử nghiệm hiệu quả kết tụ sinh học 113 4.7.1 Kết quả ly trích 113 4.7.2 Hiệu suất kết tụ sinh học 114 4.8 Thử nghiệm hiệu quả xử lý nƣớc thải sau biogas từ trại chăn nuôi heo 115 4.8.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ kết tụ (%) các chủng vi khuẩn khi thử nghiệm ở nước thải ngoài thực tế 115 4.8.2 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 10 lít 119 4.8.3 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của 2 chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 100 lít 121 4.9 Hiệu quả xử lý nƣớc thải chăn nuôi heo sau biogas của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 1 m 3 và 40 m 3 122 4.9.1 Hiệu suất xử lý ở thể tích 1 m 3 122 4.9.2 Hiệu suất xử lý ở thể tích 40 m 3 122 Chƣơng 5: Kết luận và đề xuất 125 5.1 Kết luận 125 5.2 Đề xuất 126 Tài liệu tham khảo 127 Phụ lục 145 vii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Chất kết tụ sinh học được tổng hợp từ các chủng vi khuẩn khác nhau từ năm 2007 – 2013 16 Bảng 2.2 Một số môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học 19 Bảng 2.3 Một số cặp mồi sử dụng để nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 20 Bảng 2.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen đến hiệu quả tổng hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Klebsiella sp. 26 Bảng 2.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến hiệu quả tổng hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Serratia fiacria 27 Bảng 2.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến sự kết tụ của các vi sinh vật tổng hợp chất kết tụ sinh học 27 Bảng 2.7 Liều lượng của các vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học khác nhau cho tỷ lệ kết tụ (%) ở dung dịch kaolin 29 Bảng 2.8 Ảnh hưởng của liều lượng, nhiệt độ và pH lên khả năng kết tụ của chất kết tụ M-1 29 Bảng 2.9 Kết quả xử lý nước thải tinh bột bởi các nhân tố kết tụ 30 Bảng 2.10 Hiệu quả xử lý các loại nước thải bởi chất kết tụ sinh học từ vi khuẩn Serratia ficaria 31 Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu của nước thải tại trại chăn nuôi heo (sau biogas) ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long 34 Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 35 Bảng 3.3 Thành phần cho 1 mẫu DNA thực hiện phản ứng PCR 42 Bảng 3.4 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí nghiệm 1 47 Bảng 3.5 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí nghiệm 2a 49 Bảng 3.6 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí nghiệm 2b 49 Bảng 3.7 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí nghiệm 3 50 Bảng 3.8 Nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát sự tương tác 3 yếu tố thời gian, pH và nhiệt độ ủ đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi khuẩn 50 Bảng 3.9 Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 yếu tố nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ 51 viii Bảng 3.10 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ carbon, nitrogen và khoáng vô cơ 51 Bảng 3.11 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải ở điều kiện phòng thí nghiệm 54 Bảng 4.1 Số mẫu phân lập và số dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học 56 Bảng 4.2 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein có tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL 59 Bảng 4.3 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide có tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL 60 Bảng 4.4 Đặc điểm sinh học của 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein 62 Bảng 4.5 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 18 dòng vi khuẩn với các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene 64 Bảng 4.6 Kết quả định danh 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein 67 Bảng 4.7 Đặc điểm sinh học của 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 69 Bảng 4.8 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 16 dòng vi khuẩn so với các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene 71 Bảng 4.9 Kết quả định danh 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 73 Bảng 4.10 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa trên cây phả hệ mối quan hệ di truyền 75 Bảng 4.11 Chỉ số đa dạng giữa các loài trong quần thể vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 76 Bảng 4.12 Chỉ số đa dạng giữa các chủng trong quần thể vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 77 Bảng 4.13 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 83 Bảng 4.14 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn 85 Bảng 4.15 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học Bacillus megaterium và Bacillus aryabhattai 87 Bảng 4.16 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học Bacillus megaterium và Bacillus aryabhattai 88 Bảng 4.17 Các dạng haplotype của các chủng vi khuẩn Bacillus megaterium 88 Bảng 4.18 Các dạng haplotype của các chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai 88 [...]... suất xử lý nước thải chăn nuôi heo biogas ở thể tích 1 m3 122 Hình 4.30 Mô hình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nước thải sau biogas trại chăn nuôi heo 124 Hình 4.31 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể tích 40 m3 124 Hình 4.32 Sơ đồ quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas. .. chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học trong nước thải sau hệ thống biogas của chuồng trại chăn nuôi heo Phạm vi nghiên cứu: Các dòng vi khuẩn tổng tổng hợp chất kết tụ sinh học bản địa được phân lập từ nước thải chăn nuôi heo sau hệ thống biogas ở 13 tỉnh thành thuộc ĐBSCL và ứng dụng xử lý nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo 1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực... học và ứng dụng trong xử lý nước thải sau hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài làm nguồn tư liệu cho vi c nghiên cứu và giảng dạy về vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bản địa phân lập từ hệ thống nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL 3 Sử dụng các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ vào thử nghiệm ở thể tích nước thải sau biogas. .. (2003) Nhận di n vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa vào nghiên cứu của Deng et al (2003); Lu et al (2005) và Lixi et al (2006) Quá trình tuyển chọn vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa vào tỷ lệ kết tụ (%) được tính theo công thức tính tỷ lệ kết tụ của Deng et al (2003) Nhận di n vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa trên sự kết hợp phương pháp truyền thống và kỹ thuật sinh học phân... của chuồng trại chăn nuôi heo ở các tỉnh ĐBSCL; (2) Xác định được mối quan hệ di truyền giữa các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cao dựa trên trình tự 16S rRNA và xác định được các điều kiện tối ưu cho sự tổng hợp chất kết tụ sinh học của dòng vi khuẩn được tuyển chọn để ứng dụng xử lý nước thải sau hệ thống biogas; (3) Đánh giá được hiệu suất xử lý nước thải sau biogas từ chuồng trại chăn. .. tiễn của luận án Luận án đã nghiên cứu có tính hệ thống vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bao gồm các khâu phân lập, tuyển chọn, xác định mối quan hệ di truyền giữa các dòng, tối ưu khả năng tổng hợp chất kết tụ, ly trích chất kết tụ sinh học, thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng xử lý thực tế Những kết quả có ý nghĩa khoa học Nghiên... dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học có nguồn gốc từ chất thải sau hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo trên 2 môi trường chọn lọc Sử dụng kết hợp phương pháp truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử xác định được 34 chủng vi khuẩn phân lập trên 2 môi trường tổng hợp chất kết tụ sinh học protein và polysaccharide Xác định được các điều kiện tối ưu cho vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học. .. trại chăn nuôi heo của các chủng vi khuẩn ở điều kiện phòng thí nghiệm và điều kiện thực tế 1.2.2 Nội dung nghiên cứu Phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở ĐBSCL dựa trên hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học có tỷ lệ kết tụ cao ở các tỉnh ĐBSCL, đồng thời nhận di n vi khuẩn dựa trên sự kết hợp phương pháp sinh hóa và phương pháp sinh học phân... dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 117 Hình 4.25 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh học của các chủng vi khuẩn 118 Hình 4.26 Nghiệm thức phối hợp chất trợ lắng với dịch vi khuẩn 118 Hình 4.27 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể tích 8 lít 119 Hình 4.28 Thử nghiệm xử lý nước thải sau hệ thống biogas của trại chăn nuôi heo. .. dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học với tỷ lệ kết tụ cao, đánh giá được mức độ đa dạng di truyền giữa các dòng vi khuẩn tuyển chọn dựa trên trình tự nucleotide 16S rRNA và đánh giá được hiệu suất xử lý nước thải sau biogas từ chuồng trại chăn nuôi heo Mục tiêu cụ thể: (1) Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trong nước thải sau hệ thống biogas . HUỲNH VĂN TIỀN iii MỤC LỤC Trang Lời cảm tạ i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh sách bảng vii Danh sách hình x Danh mục từ viết tắt xiii Tóm tắt xv Abstract xvii. biogas 126 xiii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ANOVA Analysis Of Variance BLAST Basic Local Alignment Search Tool BOD Biochemical Oxygen Demand Bp Base pair BTNMT Bộ Tài Nguyên. Fourier Transform Infrared GDP Gross Domestic Product HPAM Anionic Polyacrylamide ITS Internal Transcribed Spacer LSD Least Significant Difference MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis