BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: SO SÁNH TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ ENZYME THUỶ PHÂN ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B 1 TRONG GẠO Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hồng Hảo DS. Trần Cao Sơn Sinh viên thực hiện: Lê Thị Khánh Loan Lớp: CNSH 06-04 Hà Nội 2010 LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành khó luận tốt nghiệp cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành tới: TS. Lê Thị Hồng Hảo -Viện phó Viện Kiểm Nghiệm Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm Quốc Ga , DS. Trần Cao Sơnv à KS. Lê Thị Thý , h ững g ười đã r ực i ếph ướngd n , i úp đỡtĩ i. Đồng h i ,tơ i xin hõ n h ànhc ảmơ n banl ãnh đạo i ện i ểm Ngi ệmV ệ Sinh An o àn h ực h ẩm u ốc Giac ùng o àn h ểc ác anh h ịc ánb ộ iâ n trong i ện đã i úp đỡv àt ạođi ều i ện chotơ i trong u á r ình ngiâ nc ứuv à h ực i ện ko á u ậnn y Tĩi cũng xin chõn thành cảm ơn các thầy cụ, cán bộ cuả khoa Cụng Nghệ Sinh Học - Viện Đại Học Mở Hà Nội đã dạy dỗ, chỉ bảo, tạo điều kiện tốt cho tĩi học tập, tạo cơ hội cho tĩi đi thực tập và làm khoá luận tốt nghiệp. Cuối cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bố đã động viân,giúp đỡ tĩi trong thời gian qua. Hà Nội, tháng 5 năm 2010 Sinh viân Lờ Thị Khánh Loan DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AOAC (Association Official Analytical Chemists): Hiệp hội các nhà hoá học phân tích ACN: Acetonitril DDT: Dichlor-Diphenyl-Trichloroethane HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao MeOH: Methanol NXB: Nhà xuất bản PDA: Photo Diode Array ppm (part per million): nồng độ phần triệu STT: Số thứ tự TTHD: Trung tâm hoạt động UV-VIS: Ultra Violet-Visible: Tử ngoại khả biến VTM B 1 : Vitamin B 1 DANH MỤC BẢNG Bảng1.2.1: Nguồn vitamin B1 trong một số thực phẩm [23] 7 Bảng 3.1.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha động 35 Bảng 3.1.3: Khảo sát tốc độ pha động 36 Bảng 3.1.4: Các điều kiện chạy HPLC phân tích hàm lượng vitamin B1 trong gạo 37 Bảng 3.2.5: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme tới quá trình chiết vitamin B1 trong gạo 38 Bảng 3.2.6: Ảnh hưởng của enzyme tới hiệu suất thu hồi 39 Bảng 3.2.7: Sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ vitamin B1 41 Bảng 3.3.8: Kết quả độ lặp lại của phương pháp 44 Bảng 3.3.9. Hiệu suất thu hồi của vitamin B1 ở các nồng độ khác nhau. 45 Bảng 3.3.10: Kết quả phân tích mẫu thực tế 46 DANH MỤC HÌN Hình 2.3.3: Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC 27 Hình 3.1.4: Sắc đồ Vitamin B1 sử dụng cột Symmestry Water C18 34 (250mm × 4,6mm × 5µm) 34 Hình 3.1.5: Sắc đồ chạy chuẩn 0,50 ppm tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút 37 Hình 3.3.6: Sắc đồ chạy chuẩn vitamin B1 0,025ppm 43 Hình 3.4.8: Sắc đồ chạy mẫu gạo RN64 47 Hình3.4.9: Sắc đồ chạy mẫu gạo Nàng Xuân 48 Hình3.4.10: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp Ốc 48 Hình 3.4.11: Sắc đồ chạy mẫu gạo Tám 48 Hình 3.4.12: Sắc đồ chạy mẫu gạo tẻ thường 49 Hình3.4.13: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp nương Điện Biên 49 Hình3.4.14: Sắc đồ chạy mẫu gạo Tài Nguyên 49 Hình 3.4.15: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp Cái Hoa Vàng 50 Hình 3.4.16: Sắc đồ chạy mẫu gạo lứt 50 Hình 3. : Sắc đồ chạy chuẩn vitamin ại ồng độ 0, pp 57 Hình 4. : Sắc đồ chạy mẫu dựng Clara –diastase 5 59 Hình 4. : Sắc đồ chạy mẫu dựng Clara –diastase 10 60 ình 4.5: ắc đồ c ạy ẫu ùng C a a- ia tase15 60 Hình 5. : Sắc đồ chạy mẫu với enzyme α-amylas 60 Hình 5. : Sắc đồ chạy mẫu với Taka diastase 61 ìn 5.4: ắc đồ ẫu ùng Taka ia tase t m 34,6µg ch ẩ 61 MỤC LỤ MỞ ĐẦU 1 PHẦN I 3 TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu chung về vitamin [5], [11] 3 1.1.1. Định nghiã[11] 3 1.1.2. Phân loại 3 1.1.3. Vai trò của vitamin 3 1. 2. Vài nét về vitamin B1 [5], [11] 4 1.2.1. Lịch sử 4 1.2.2. Cấu tạo và tính chất 4 1.2.3. Vai trò của vitamin B1 đối với sức khoẻ con người 6 1.2.4. Nhu cầu [5] 7 1.2.5. Nguồn thực phẩm chính cung cấp vitamin B1 7 1.3. Tổng quan về enzyme 8 1.3.1. Khái niệm 8 1.3.2. Vai trò[5] 8 1.3.3. Cấu tạo hoá học của enzyme[5],[26] 8 1.3.4. Cơ chế hoạt động[5] 10 1.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính của enzyme 11 1.3.6. Đặc tính một số enzyme được sử dụng 13 1.4. Các phương pháp xác định thiamin 15 1.4.1. Định lượng thiamin bằng phương pháp khối lượng 16 1.4.2. Phương pháp sinh vật học và vi trùng học [12] 16 1.4.3. Phương pháp chuẩn độ điện thế 17 1.4.4. Phương pháp sắc ký điện di mao quản thế cao 17 1.4.5. Phương pháp phổ huỳnh quang [3,12] 18 1.4.6. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 19 PHẦN II 21 ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP 21 NGHIÊN CỨU 21 2.1. Đối tượng, thiết bị, hóa chất 22 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và thuốc thử 22 2.2. Nội dung nghiên cứu 24 2.2.1. Khảo sát xây dựng phương pháp xác định vitamin B1 trong gạo 25 2.2.2. Đánh giỏ phương pháp đã xây dựng 25 2.2.3. Ứng dụng phương pháp xác định vitamin B1 trong một số loại gạo 25 2.3. Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 25 2.3.2. Phương pháp phân tích vitamin B1 25 2.3.3. Phương pháp xử lý kết quả 32 PHẦN III 33 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Tối ưu hoá các điều kiện để tách và xác định vitamin B1 bằng HPLC 33 3.1.1. Lựa chọn detector và bước sóng phát hiện 33 3.1.2. Lựa chọn cột tách 33 3.1.3. Lựa chọn pha động 34 3.1.4. Khảo sát tốc độ dòng 36 3.2. So sánh một số enzyme thủy phân để tối ưu hoá quy trình xử lý mẫu 38 3.2.1. Khảo sát hàm lượng enzyme tối ưu cho quá trình xử lý mẫu 38 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của enzyme tới hiệu suất thu hồi 39 3.3. Đánh giá phương pháp phân tích 40 3.3.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 41 3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) 43 3.3.3. Giới hạn định lượng (LOQ) 44 3.3.4. Xác định độ lặp lại 44 3.3.5. Xác định độ thu hồi 45 3.4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 45 PHẦN IV 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 4.1. Kết luận 51 4.2. Đề nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PỤ Ụ 56 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Sự khám phá ra vitamin là một trong những thành tựu lớn của hoá sinh. Vitamin là một nhóm các hợp chất hoá học có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm, được phân loại làm hai nhóm chính: vitamin tan trong dầu và vitamin tan trong nước. Mặc dù, các vitamin không cung cấp năng lượng nhưng chúng rất cần thiết cho các hoạt động sống của con người. Trong các loại vitamin thì vitamin B 1 (thiamin) giữ vai trò quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể. Thiamin có mặt trong nhiều loại thực phẩm, trong đó các loại ngũ cốc mà đặc biệt là gạo có hàm lượng thiamin cao. Gạo là loại lương thực không thể thiếu đối với cuộc sống hàng ngày của mỗi người, nhất là ở Việt Nam. Xác định hàm lượng vitamin B 1 chính là một trong các yêu cầu kiểm nghiệm về hoá sinh của gạo. Để xác định hàm lượng vitamin B 1 trong thực phẩm có hàm lượng tinh bột cao như gạo thì quá trình phân tích thường phải sử dụng enzyme, vì các enzyme có khả năng phá vỡ liên kết polysaccarid tạo dịch đường hồ tan, và phá vỡ liên kiết giữa vitamin B 1 và protein. Bên cạnh đó, các enzyme còn xúc tác phản ứng dephosphoryl để tách dạng thiamin phosphate ester thành thiamin tự do[22],[27]. Điều này là quan trọng do trong thực phẩm vitamin B 1 tồn tại ở dạng tự do (thiamin) B 1 , dạng phosphate ester, hơn nữa chúng còn có sự ràng buộc với protein. Sau đó, thiamin tự do được oxy hóa thành thiochrom và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detectơ huỳnh quang RF. Hiện nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về hàm lượng vitamin B 1 trong ngũ cốc nói chung và gạo nói riêng. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để xác định hàm lượng vitamin B 1 trong gạo” với các mục tiêu: - Khảo sát điều kiện chạy máy sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích vitamin B 1 . Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa CNSH 1 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội - So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để khảo sát quá trình tách chiết vitamin B 1 trong gạo. - Đánh giá phương pháp xác định hàm lượng vitamin B 1 . - Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng vitamin B 1 trong một số loại gạo trên thị trường Hà Nội. Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa CNSH 2 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN I TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về vitamin [5], [11] 1.1.1. Định nghiã[11] Vitamin là những hợp chất hữu cơ, được cung cấp cho cơ thể với số lượng nhỏ từ thức ăn, là những chất không thể thiếu được với cơ thể người cũng như động vật để tạo ra các coenzyme cần thiết cho phản ứng chuyển hóa khác nhau. 1.1.2. Phân loại Dựa vào độ tan của vitamin, người ta chia thành 2 nhóm: - Vitamin hòa tan trong nước: Các vitamin nhóm B, vitamin C - Vitamin hòa tan trong dầu: vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K 1.1.3. Vai trò của vitamin Tất cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất xảy ra trong cơ thể đều có sự tham gia trực tiếp của vitamin. Các động vật cũng như con người không có khả năng tự tổng hợp được các vitamin bằng quá trình đồng hóa. Nguồn cung cấp vitamin chủ yếu là thức ăn. Do vậy, cơ thể có thể thừa hay thiếu vitamin. Khi cơ thể bị thiếu hay không có một vitamin nào đó thì sẽ mắc một số bệnh như quáng gà, còi xương, viêm đa dây thần kinh… Ngược lại khi thừa vitamin nói chung, các vitamin không gây độc và bị đào thải ra ngoài. Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa CNSH 3 [...]... Đại Học Mở Hà Nội 2.2.1 Khảo sát xây dựng phương pháp xác định vitamin B1 trong gạo 2.2.2 Đánh giỏ phương pháp đã xây dựng - Xác định khoảng tuyến tính Lập đường chuẩn - Xác định giới hạn phát hiện (LOD) - Xác định giới hạn định lượng (LOQ) - Xác định độ lặp lại (SD) - Xác định độ đúng của phương pháp thông qua hiệu suất thu hồi R% 2.2.3 Ứng dụng phương pháp xác định vitamin B1 trong một số loại gạo. .. Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 2.3.2.3 Phân tích định tính và phân tích định lượng bằng HPLC [8]  Phân tích định tính Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ pha đã chọn là thời gian lưu của các chất Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích có thời gian lưu khác nhau và cố định Chính đại lượng này là một. .. hoá trực tiếp: Tác dụng vào TTHĐ hoặc làm biến đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme theo hướng có lợi cho hoạt độ xúc tác của enzyme Vì vậy khi hàm lượng chất hoạt hoá tăng trong mức độ cho phép thì hoạt động của enzyme cũng tăng theo 1.3.6 Đặc tính một số enzyme được sử dụng Việc xác định hàm lượng vitamin B trong các mẫu thực phẩm (rau, ngũ cốc, thịt cá, nấm men) không bổ sung vitamin B, người... Khoa học thực phẩm, Đại học College Dublin đã ứng dụng phương pháp HPLC để xác định vitamin B1 trong thịt, các sản phẩm từ thịt Vitamin B1 được tách từ các loại thịt bởi quá trình thuỷ phân với HCl 0,1N, sau đó là quá trình thuỷ phân bằng enzyme, giúp phosphoryl hoá các dạng phosphate ester của vitamin B1 Các enzyme sử dụng cú hoạt động phosphatase, cú nguồn gốc từ lúa mỡ Tác giả đã lựa chọn enzyme. .. hay thông số để định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu Vì vậy, sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ Sau đó so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào  Phân tích định lượng Các... (TTP), một phần vitamin B1 còn có sự liên kết với protein [18], [24],[27] Bảng1.2.1: Nguồn vitamin B1 trong một số thực phẩm [23] Thực phẩm Hàm lượng Vitamin B1 (mg/100g) Gạo đồ Gạo nếp cái 0,13 Gạo tẻ máy 0,10 Thịt gà 0,15 Cải xong 0,07 Dưa hấu Lê Thị Khánh Loan CNSH 0,19 0,03 7 06-04 K13 Khoa Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 1.3 Tổng quan về enzyme 1.3.1 Khái niệm Enzyme là chất xúc tác sinh. .. rằng nếu chỉ thuỷ phân bằng acid thì chỉ thực hiện được một phân phản ứng dephosphoryl dạng phosphoryl của vitamin B và việc kết hợp giữa thuỷ phân bằng acid với enzyme diastase thì quá trình chiết sẽ tối ưu hơn .Trong tiến trình xây dựng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng vitamin B 1 trong thực phẩm, xuyên suốt quá trình thử nghiệm, việc đưa ra lựa chọn loại enzyme sử dụng để giải phóng vitamin B... việc dựng thuốc thử này để định tính, người ta còn dựng nó để định lượng thiamin  Trong môi trường kiềm, vitamin B1 tác dụng với kali fericyanid tạo thiocrom màu vàng và có huỳnh quang màu xanh da trời  Vitamin B1 được tổng hợp chủ yếu ở thực vật và một số vi sinh vật Lê Thị Khánh Loan CNSH 5 06-04 K13 Khoa Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 1.2.3 Vai trò của vitamin B1 đối với sức khoẻ con... quan trọng trong công nghiệp thực phẩm và y học 1.3.3 Cấu tạo hoá học của enzyme[ 5],[26] 1.3.3.1 Bản chất protein của enzyme Bản chất hoá học của enzyme là protein Enzyme được cấu tạo từ các L- αaxitamin kết hợp với nhau qua liên kết peptit Enzyme chia ra làm hai dạng cấu tạo: - Enzyme một cấu tử (là một protein đơn giản) như pepsin, amylase - Enzyme hai cấu tử (là một protein phức tạp, trong phân tử... nhất và phân tích Mỗi mẫu sau khi đã trộn, được phân tích lặp lại 3 lần và cú kèm một mẫu thờm chuẩn để xác định độ lặp lại và hiệu suất thu hồi trờn từng đối tượng mẫu Phần mẫu lưu cho vào trong túi đựng mẫu và bảo quản trong tủ mẫu 2.3.2 Phương pháp phân tích vitamin B1 Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định hàm lượng vitamin B1, chúng tôi đã lựa chọn phương HPLC với detector huỳnh quang để phát . TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: SO SÁNH TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ ENZYME THUỶ PHÂN ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B 1 TRONG GẠO Người hướng. CNSH 1 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội - So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để khảo sát quá trình tách chiết vitamin B 1 trong gạo. - Đánh giá phương pháp xác định hàm lượng vitamin. tài: So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để xác định hàm lượng vitamin B 1 trong gạo với các mục tiêu: - Khảo sát điều kiện chạy máy sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích vitamin