CHƯƠNG 4: SẮC KÝ CỘT Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh. Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hay chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong 1 ống hình trụ được gọi là “cột”. Tùy theo tính chất của chất được được sử dụng làm cột mà quá trình tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế phân bố (cột phân bố) hay cơ chế trao đổi ion (cột trao đổi ion) Ở đây chỉ trình bày sắc ký cột hấp phụ. I. NGUYÊN TẮC Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ. Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau. Chất hấp phụ trong sắc ký cột thừơng dùng là oxid nhôm, silicagel, CaCO 3 , than hoạt tính, polyamid, …Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa. - Oxid nhôm trung tính (Merck), cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70-200 mesh) o Độ hoạt hóa số I 0,5 % H 2 O II 2,4 % H 2 O III 4,3% H 2 O IV 6,6% H 2 O V 15% H 2 O - Oxid nhôm baz (Merck), cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70-200 mesh) o Độ hoạt hóa số I 1,2 % H 2 O II 3,5 % H 2 O III 5,8% H 2 O IV 8,1% H 2 O V 10% H 2 O - Silicagel 60 cỡ hạt 0,063-0,200 mm. - Polyamid M-K cỡ hạt < 0,07 mm Silicagel là pha tĩnh được dùng rộng rãi nhất để tách các hợp chất thiên nhiên. Dung môi dùng trong sắc ký cột có thể là từng loại riêng biệt hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp. Với các chất hấp phụ cổ điển, dung môi sử dụng có độ phân cực tăng dần. Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên có nút mài để nối với một phễu chứa dung môi, loại này thường được bán sẵn trên thị trường với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ. Hoặc cột cũng có thể tự lắp bằng một ống thủy tinh thường, đầu dưới nhỏ nối với một ống cao su, dùng khóa kim loại để điều chỉnh tốc độ chảy của dung môi Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng. Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt. Một vài cột bán sẵn trên thị trường có kích thước tương ứng với chiều dài và kích thước cột: Đường kính (cm) Chiều dài (cm) 1 15 2 25 3 40 4 60 II. KỸ THUẬT NHỒI CỘT VÀ TRIỂN KHAI SẮC KÝ II.1 Chuẩn bị cột - Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô. - Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch). - Kẹp cột thẳng đứng trên giá. Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều ở mỗi điểm trong cột và tạo thành một khối đồng nhất. Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột. Trọng lượng chất phân tích Tỷ lệ = Trọng lượng chất hấp phụ Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay đổi, thông thường từ 1/20, 1/30, 1/50, 1/100,… Có 2 cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô. Nhồi cột ướt: Dùng cho các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silicagel, Sephadex … thì phải ngâm trong dung môi trước một thời gian trước khi cho vào cột để tránh làm nứt cột. Lắc, trộn đều bột hấp phụ với dung môi thành một hỗn hợp dịch, rót vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột. Hỗn dịch dung môi và chất hấp phụ không nên quá sệt để tránh bọt khí bị giữ trong cột và cũng không nên quá lỏng để rót nhiều lần vào cột. Chú ý trong quá trình nhồi cột, dung môi vẫn liên tục chảy đều ra bình hứng, và không được để khô dung môi trong cột. Sau khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, dung môi vẫn tiếp tục được rót và hứng thêm một khoảng thời gian nữa để cột hoàn tòan ổn định. Mặt thoáng trên cột phải phẳng, người ta có thể cho thêm một lớp cát hoặc bông để tránh làm xáo trộn lớp Silicagel khi rót dung môi. Nhồi cột khô: Dùng cho các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như Al 2 O 3 , CaCO 3 . Chất hấp phụ được nhồi từ từ vào cột ở dạng khô bởi một phểu có cuống dài. Dùng một que bằng gỗ hoặc cao su gõ nhẹ và đều xung quanh cột theo chiều từ dưới lên để bột xuống được đều. Khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, rót dung môi vào và cho chảy liên tục một thời gian để cột được ổn định và không được để khô dung môi trong cột. II.2. Đưa chất phân tích vào cột Yêu cầu khi đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt thoáng phẳng. Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột: Phương pháp dùng đĩa giấy: Dùng giấy lọc cắt 1 hình tròn có đường kính nhỏ hơn đường kính cột 0,5mm. Dùng kim châm những lỗ thủng cách đều nhau. Chất cần phân tích được hòa tan trong một lượng dung môi vừa đủ, cho giấy thấm đều dung dịch đậm đặc này. Lấy giấy ra, cho bốc hơi dung môi bằng cách sấy rồi tiếp tục tẩm dung dịch thử. Nếu cột lớn, lượng mẫu nhiều thì có thể dùng nhiều đĩa giấy. Sau khi cột đã ổn định với dung môi, tháo dung môi cho đến khi bề mặt dung môi ngang với mặt lớp chất hấp phụ trong cột thì khóa van lại. Đặt cẩn thận các đĩa giấy vào cột, dùng ống hút cho dung môi cho tẩm ướt đĩa giấy. Cho một lớp cát mịn lên trên đĩa giấy và bắt đầu cho dung môi chảy. Cho thẳng dung dịch thử lên cột: Hòa tan chất cần phân tích vào một lượng vừa đủ dung môi (càng ít càng tốt nhưng phải đảm bảo hòa tan hoàn toàn. Dung dịch thử có nồng độ đậm đặc mới nằm thành một lớp mỏng trên đầu cột. Cột đã ổn định được tháo dung môi cho đến khi mặt thoáng gần sát bề mặt chất hấp phụ thì khóa vòi lại. Dùng ống hút hút dung dịch đậm đặc chất cần phân tích chảy dọc thành cột. Mở khóa bên dưới cho dịch thử ngấm vào cột (không được để chất hấp phụ ở đầu cột bị khô). Khi toàn bộ lớp dung dịch thử đã ngấm hết vào cột, dùng ống hút lấy một ít dung môi rửa thành cột, cho dung môi ngấm hết vào cột. Tiếp đến là cho dung môi để bắt đầu tiến hành quá trình giải ly. [...]... đỉnh cột bị khô Cho chất phân tích vào cột cũng giống như sắc ký cột thường nghĩa là chất cần sắc ký cũng hòa tan vào dung môi rửa cột, điều chỉnh dòng chảy để nén tất cả dung dịch mẫu vào lớp silicagel, sau đó dùng vài ml dung môi tinh chế để rửa quanh thành cột Rót dung môi đầy cột, mở van điều chỉnh áp và bắt đầu hứng các phân đoạn Lượng dung môi rửa cột và thể tích các phân đoạn hứng tùy thuộc vào... hiện sắc ký cột mà phải thực hiện nhiều lần Ưu điểm của sắc ký cột nhanh và sắc ký cột nhanh khô là: - Tiết kiệm: so với sắc ký cột cổ điển, kỹ thuật này dùng ít chất hấp phụ và ít dung môi hơn Thời gian tiến hành cũng nhanh hơn - Đơn giản, dễ thực hiện, các dụng cụ thường có sẵn trong phòng thí nghiệm Giới thiệu một số dụng cụ dùng trong sắc ký cột: ... ly từ cột qua một bình khác Lần lượt triển khai từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực Theo dõi quá trình giải ly và thay đổi hệ dung môi thích hợp bằng sắc ký lớp mỏng như sắc ký cột cổ điển Với những cao trích từ cây cỏ, thường chứa rất nhiều thành phần khác nhau nên thường không có phương pháp sắc ký cột nào hiệu quả để thu được cấu tử sạch mong muốn bằng một lần thực hiện sắc ký cột mà... Dùng SKLM để tiến hành thử hợp chất cần sắc ký để tìm hệ dung môi thích hợp sao cho các thành phần trong hỗn hợp có giá trị Rf ≥ 0,35 Như vậy nếu trong hỗn hợp gồm nhiều chất thì chất phân cực nhất phải có giá trị Rf tối thiểu là 0,35 Việc tách đạt hiệu quả tốt nếu sự khác biệt về hằng số R f của các chất trong hỗn hợp đạt điều kiện Rf >0,15 Tuy nhiê,n trong một số trường hợp nếu ∆Rf không đạt yêu cầu... (Phillipsburg, NJ) Si 60 40 -63 48 0 63-200 100 -42 5 EM.Science / Merck Si 40 25 -40 675 (40 Ǻ) Gibbstonin, NJ Si 60 63-200 550 (60 Ǻ) Si 100 40 -63 42 0 (100 Ǻ)) 63-100 15 -40 ICN (Woelm) Si 60 (Cleveland, OH) 10-18 500-600 10-35 18-32 32-63 32-100 63-100 63-200 Universal absorbents Si 60 (Atlanta , GA) 18-32 500-600 32-63 63-100 53-200 100-200 Whatman (Clifton NJ) Si 40 13- 24 37-53 75 -40 Dung môi rửa cột: Dung môi... vào lượng mẫu tương ứng V SẮC KÝ CỘT NHANH KHÔ (Dry-column flash chromatography) Sắc ký cột nhanh khô là một cải biên của sắc ký cột nhanh, dùng áp suất kém để gia tăng tốc độ giải ly của pha động Kỹ thuật này khác với FC là cột sắc ký được rút khô sau mỗi phân đoạn thu được Dụng cụ gồm phễu lọc xốp bằng thủy tinh Phễu này có bán sẵn trên thị trường với đủ loại kích thước thích hợp Một hệ thống tạo áp... dài cột và giảm lượng mẫu phân tích và điều chỉnh hệ dung môi Bằng những biện pháp trên, Still và cộng sự đã tách ra được những chất có ∆Rf >0,1 và ∆Rf >0,05 Hệ dung môi dùng cho pha thường là các dung môi có độ phân cực thấp như ether dầu hỏa, hexan, ethyl acetat Hệ dung môi dùng cho pha đảo thường là các dung môi có độ phân cực cao như MeOH, H2O, MeOH-H2O Bảng 10: Áp dụng FC để tách các hợp chất tự. .. to Chất cần sắc ký được hòa tan vào một dung môi kém phân cực, nạp vào cột, gắn áp suất kém, dung dịch mẫu sẽ được hút vào phần silicagel ở đầu cột thành một lớp mỏng đều Cũng có thể nạp mẫu ở dạng khô, dung dịch cao mềm của mẫu thử được trộn với một lượng vừa đủ chất hấp phụ, tạo thành bột rắn khô (có thể đuổi dung môi bằng cô quay chân không), sau đó cho lớp bột này lên đầu cột để có một lớp mỏng và. .. vừa phải Chất hấp phụ thường dùng là silicagel dùng cho SKLM tức loại có độ mịn hạt 40 -15 µm) hoặc Al2O3 dùng cho SKLM Nạp chất hấp phụ vào phễu lọc ở trạng thái khô, gắn phễu vào hệ thống tạo áp suất kém, vừa gõ nhẹ vào thành phễu để chất hấp phụ được nén đều, tạo thành một khối cứng, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt phẳng… Chiều cao của chất hấp phụ không được quá cao, nếu muốn tách một lượng chất nhiều... silicagel khô 40 -63 µm vào cột, sau đó cho một lớp cát biển lên trên bề mặt lớp silicagel Đổ dung môi giải ly lên trên bề mặt của lớp các biển đến đầy cột, gắn bộ phận điều chỉnh tốc độ chảy lên đỉnh cột Van kim luôn được mở, mở nhẹ nhàng cho dòng khí chảy qua, tay bịt air gió Áp suất trong cột sẽ gia tăng, nén lớp dung môi chảy qua cột nhanh Áp suất được duy trì như vậy đến khi tất cả không khí trong cột bị . 100 2 0-3 0 5 0-1 05 500 (60 Ǻ) 300 (100 Ǻ) J.T.Baker (Phillipsburg, NJ) Si 60 40 -6 3 6 3-2 00 100 -4 2 5 48 0 EM.Science / Merck Gibbstonin, NJ Si 40 Si 60 Si 100 25 -4 0 6 3-2 00 40 -6 3 6 3-1 00 15 -4 0 675 (40 Ǻ) 550. hỏa - cyclohexan - carbon tetraclorur - tricloroetylene - toluen - benzen - methylclorur - chloroform - ether ethylic - ethylacetat - pyridin- aceton - n-propanol - ethanol - methanol - nước Trên. CHƯƠNG 4: SẮC KÝ CỘT Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh. Trong sắc ký cột, chất