BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ  MAI BÍCH THOA TỔNG HỢP PAMAM LAI HÓA PEG MANG THUỐC 5-FLUOROURACIL VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ IN VIVO TRÊN CHUỘT LUẬN VĂN THẠC SĨ 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ  MAI BÍCH THOA TỔNG HỢP PAMAM LAI HÓA PEG MANG THUỐC 5-FLUOROURACIL VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ IN VIVO TRÊN CHUỘT LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên Ngành: HÓA HỮU CƠ Mã ngành: 60 44 27 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS NGUYỄN CỬU KHOA 2011 Luận văn thạc sĩ LỜI CẢM ƠN  Sau gần năm nghiên cứu làm việc với cố gắng nỗ lực thân cộng với giúp đỡ tất người, luận văn thạc sĩ hồn thành Tơi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa, Viện Trưởng Viện Cơng Nghệ Hóa Học -Viện Khoa Học Công nghệ Việt Nam, Người dành bao tâm huyết hết lòng tận tụy truyền đạt cho nhiều kiến thức chuyên môn kinh nghiệm nghiên cứu khoa học Quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ tận tình giảng dạy suốt thời gian tơi theo học Ts Hồng Thị Kim Dung, Ts Trần Ngọc Quyển, Kỹ sư Lý Tú Uyên, Kỹ sư Nguyễn Hồng cơng tác phịng Hóa hữu polymer - Viện Cơng Nghệ Hóa học Viện Khoa Học Cơng Nghệ Việt Nam, nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt thời gian thực đề tài Cuối tơi xin cám ơn đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, ủng hộ, giúp đỡ cho vật chất lẫn tinh thần để an tâm học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin chân thành cám ơn! Cần Thơ, tháng 10 năm 2011 Mai Bích Thoa Mai Bích Thoa Trang i Luận văn thạc sĩ MỤC LỤC  MỤC LỤC .ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC .ix MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN .2 1.1 MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ THUỐC 5-FLUOROURACIL3, 51 .2 1.1.1 Dược lý chế tác dụng 1.1.2 Chỉ định 1.1.3 Chống định .3 1.1.4 Liều lượng cách dùng 1.2 BỆNH UNG THƯ50, 53 .5 1.2.1 Nguyên nhân ung thư 1.2.2 Các loại ung thư 1.2.3 Điều trị ung thư 1.2.4 Những khó khăn hóa trị liệu điều trị ung thư1, 25, 36, 46 1.2.5 Chất mang polymer - liệu pháp điều trị ung thư 1.2.6 Một số polymer dùng làm chất mang vận chuyển phân phối thuốc 5-fluorouracil4, 5, 9, 10, 15, 16, 18, 19, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 35, 48, 49 .10 1.3 DENDRIMER - NANOCARRIER CHO ĐIỀU TRỊ BỆNH UNG THƯ .14 1.3.1 Giới thiệu dendrimer .14 1.3.1.1 Khái niệm34, 42 14 1.3.1.2 Cấu trúc phân tử45 14 1.3.1.3 Tính chất8, 27, 30, 41 15 1.3.2 Giới thiệu dendrimer PAMAM42, 43 17 1.3.3 Tương tác dendrimer PAMAM - thuốc6, 13, 11, 17, 23, 33, 47 18 Mai Bích Thoa Trang ii Luận văn thạc sĩ 1.3.3.1 Thuốc tương tác với thành phần core nhánh bên dendrimer13, 17, 23, 33 19 1.3.1.2 Thuốc tương tác với nhóm bề mặt dendrimer6, 11, 47 .19 1.3.4 Tính tương hợp sinh học dendrimer PAMAM12, 20, 22, 27, 37 .20 1.3.5 Sự tăng cường hiệu mang nhả thuốc lại hóa PEG7, 14, 21, 25, 36, 38, 40 .22 1.3.6 Sự định hướng chất mang PAMAM - MPEG đến tế bào ung thư30, 39, 46, 51 26 Chương NGHIÊN CỨU 31 2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .31 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .31 2.2.1 Lai hóa MPEG 5000 với PAMAM G3.0 31 2.2.2 Nang hóa thuốc chống ung thư 5-fluorouracil cấu trúc PAMAM G3.0-MPEG 34 2.2.3 Thử nghiệm hiệu in vivo 5-fluorouracil nang hóa PAMAM G3.0-MPEG chuột mang khối u vú người 34 2.2.4 Các phương pháp phân tích để xác định cấu trúc sản phẩm .34 Chương THỰC NGHIỆM 36 3.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 36 3.1.1 Hóa chất 36 3.1.2 Dụng cụ thiết bị .36 3.2 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 38 3.2.1 Tổng hợp MPEG 5000 – p-nitrophenyl carbonate 38 3.2.2 Tổng hợp PAMAM G3.0 - MPEG 5000 40 3.2.3 Nang hóa thuốc chống ung thư 5-fluorouracil cấu trúc PAMAM G3.0-MPEG 41 3.2.4 Khảo sát nhả thuốc in vitro môi trường nước 43 3.2.5 Thử nghiệm hiệu in vivo 5-fluorouracil nang hóa PAMAM G3.0-MPEG chuột nang khối u vú người .43 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45 4.1 Tổng hợp MPEG 5000 –p-nitrophenyl carbonate 45 4.2 Tổng hợp PAMAM G3.0-MPEG 5000 47 Mai Bích Thoa Trang iii Luận văn thạc sĩ 4.3 Nang hóa thuốc chống ung thư 5-fluorouracil cấu trúc PAMAM G3.0MPEG 49 4.4 Khảo sát nhả thuốc in vitro môi trường nước .55 4.5 Kết thử nghiệm hiệu in vivo 5-fluorouracil nang hóa PAMAM G3.0-MPEG chuột mang khối u vú người 56 Chương KẾT LUẬN 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC Mai Bích Thoa Trang iv Luận văn thạc sĩ DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT  ADR Adriamycin DMF Dimethylformamide DNA Deoxyribonucleic acid DPD Dihydropyrimidine dehydrogenase EDA Ethylenediamine FA Folic acid 5-FU 5-Fluorouracil EPR Enhanced Permeability and Rentention Effect 1H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance IR Infrared LMWH Low molecular weight heparin MPEG Monomethoxy polyethylene glycol MTX Methotrexate NPC p-Nitrophenyl chloroformate PACA Alkylcyanoacrylate PAMAM Polyamidoamine PEG Polyethylene glycol PGL Poly(glutaraldehyde) PMMA Polymethylmethacrylate RNA Ribonucleic acid TEA Triethylamine THF Tetrahydrofuran Mai Bích Thoa Trang v Luận văn thạc sĩ DANH MỤC CÁC BẢNG  Bảng Tính chất vật lý hóa chất 36 Bảng Độ dịch chuyển hóa học 1H NMR MPEG p - nitrophenyl carbonate 46 Bảng Độ dịch chuyển hóa học 1H NMR PAMAM G3.0-MPEG 49 Bảng Trung bình phần trăm giảm thể tích khối u lơ thí nghiệm theo thời gian .57 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ  Mai Bích Thoa Trang vi Luận văn thạc sĩ DANH MỤC CÁC HÌNH  Hình Mơ hình polymer dẫn thuốc Ringsdorf36 10 Hình Cấu trúc dendrimer 15 Hình Sự thay đổi hình dạng độ chặt theo hệ dendrimer PAMAM core ammonia 17 Hình Phản ứng tạo hệ lẻ PAMAM 17 Hình Phản ứng tạo hệ chẵn PAMAM 18 Hình Cấu trúc PAMAM 18 Hình Một số hình thức vận chuyển thuốc PAMAM8 .20 Hình Độ độc dendrimer theo nhóm chức bề mặt8 21 Hình Những thuận lợi PEG hóa protein44 22 Hình 10 Sự kết hợp PEG - PAMAM với adriamycin, methotrexate 23 Hình 11 Mơ hình PAMAM-MPEG mang thuốc 5-fluorouracil7 .25 Hình 12 Định hướng thụ động dựa theo chế EPR 27 Hình 13 Quá trình nhập bào chất mang - thuốc vào tế bào 29 Hình 14 Sơ đồ phản ứng tổng hợp MPEG p – nitrophenyl carbonate .31 Hình 15 Phản ứng MPEG tác dụng với NPC .32 Hình 16 Sơ đồ phản ứng tạo thành sản phẩm phụ .33 Hình 17 Sơ đồ phản ứng tổng hợp MPEG – PAMAM 33 Hình 18 Máy cô quay chân không 37 Hình 19 Tủ hút chân không 38 Hình 20 Máy đo phổ IR 38 Hình 21 Sản phẩm MPEG – p-nitrophenyl carbonate 45 Hình 22 Phổ 1H NMR MPEG p - nitrophenyl carbonate 46 Hình 23 Sản phẩm PAMAM G3.0-MPEG 5000 47 Hình 24 Cơng thức PAMAM G3.0-MPEG 48 Hình 25 Phổ 1H NMR PAMAM G3.0–MPEG 48 Hình 26 Sản phẩm PAMAM G3.0 - MPEG-5-FU .50 Hình 27 Phổ IR 5-FU (A), PAMAM G3.0-MPEG (B), PAMAM G3.0-MPEG-5FU (C) 51 Mai Bích Thoa Trang vii Luận văn thạc sĩ Hình 28 Phổ 1H NMR PAMAM G3.0-MPEG (A) PAMAM G3.0–MPEG-5-FU (B) 52 Hình 29 Ảnh chụp TEM PAMAM G3.0-MPEG 53 Hình 30 Ảnh TEM 5-FU nang hóa PAMAM G3.0-MPEG .53 Hình 31 Phần trăm lượng thuốc phóng thích theo thời gian 55 Hình 32 Kết phân tích khối u phương pháp Flow cytometry với kháng thể kháng HLA 56 Hình 33 Chuột mang khối u tế bào ung thư người MCF7 57 Hình 34 Biểu đồ so sánh phần trăm giảm thể tích khối u lơ thí nghiệm 58 Hình 35 Chuột mang khối u vào ngày (a) sau 15 ngày điều trị thuốc (b) 58 Mai Bích Thoa Trang viii Luận văn thạc sĩ PHỤ LỤC  Phụ lục Phổ 1H NMR MPEG p – nitrophenyl carbonate (dung môi CDCl3) theo tài liệu tham khảo Mai Bích Thoa PL Luận văn thạc sĩ Phụ lục Phổ 1H NMR MPEG p – nitrophenyl carbonate (dung mơi CDCl3) Mai Bích Thoa PL Luận văn thạc sĩ Phụ lục Phổ 1H NMR PAMAM G3.0 - MPEG (dung mơi CDCl3) Mai Bích Thoa PL Luận văn thạc sĩ Phụ lục Phổ 1H NMR PAMAM G3.0 - MPEG (dung môi D2O) Mai Bích Thoa PL Luận văn thạc sĩ Phụ lục Phổ IR 5-fluorouracil D:\KETQUA10\P49\111010\UYEN.0 5FU SOLID 2010/11/10 Page 1/1 Phụ lục Phổ IR PAMAM G3.0 - MPEG Mai Bích Thoa PL Luận văn thạc sĩ Phụ lục Phổ IR PAMAM G3.0-MPEG-5-FU D:\KETQUA10\P49\110910\SV.0 G3-MPEG-5-FU SOLID 2010/11/09 Page 1/1 Phụ lục Phổ 1H NMR PAMAM G3.0-MPEG-5-FU (dung mơi D2O) Mai Bích Thoa PL Luận văn thạc sĩ Mai Bích Thoa PL Luận văn thạc sĩ Phụ lục Phổ 1H NMR 5-fluorouracil (dung môi D2O) Phụ lục 10 Ảnh TEM PAMAM G3.0-MPEG-5-FU Mai Bích Thoa PL Luận văn thạc sĩ Mai Bích Thoa PL Luận văn thạc sĩ Phụ lục 11 Ảnh TEM PAMAM G3.0-MPEG Phụ lục 12 Phổ 1H NMR PAMAM G3.0-MPEG sau nhả thuốc 5-FU hồn tồn (dung mơi D2O) Mai Bích Thoa PL 10 Luận văn thạc sĩ Phụ lục 13 Xây dựng phương trình đường chuẩn độ hấp thu A 265,5 theo nồng độ 5-fluorouracil C5-FU Pha dãy dung dịch 5-fluorouracil có nồng độ từ khoảng 0,7 đến 15,0 µg/ml Tiến hành đo độ hấp thu A dung dịch bước sóng 265,5 nm, thu bảng số liệu: STT Nồng độ µg/ml 0,662 1,325 2,981 5,962 8,942 11,923 14,904 A265.5 0,033 0,08 0,175 0,353 0,501 0,663 0,841 Từ xây dựng phương trình đường chuẩn A265,5 theo C5-FU phương pháp bình phương cực tiểu, thu phương trình: A265,5 = 0,0559.C5-FU + 0,0052 với R2= 0,99 Mai Bích Thoa PL 11 Luận văn thạc sĩ Phụ lục 14 Khảo sát nhả thuốc in vitro môi trường nước PAMAM G3.0-MPEG-5-FU Từ giá trị A265,5 dựa vào phương trình đường chuẩn A265,5 theo C5-FU, tính nồng độ 5-FU khuếch tán khỏi chất mang bên túi thẩm tách Phần trăm 5-FU nhả khỏi chất mang tính theo công thức: % 5-FU = C 5− FU x100% C 5− FUo C5-FU: nồng độ 5-FU thời điểm t C5-FUo: nồng độ 5-FU 5-FU giải phóng hết khỏi chất mang C5-FUo = Mai Bích Thoa 0,0164 x1000 = 16,263(µg/ml) 1010 PL 12 Luận văn thạc sĩ Khảo sát nhả thuốc in vitro môi trường nước PAMAM G3.0-MPEG-5-FU Thời gian A265,5 Nồng độ 5-FU (µg/ml) % 5-FU nhả 1h 2h 3h 4h 5h 6h 24 h 48 h ngày ngày 21 ngày 0,371 0,543 0,618 0,662 0,701 0,69 0,694 0,715 0,703 0,69 0,702 0,68 0,652 6,546 9,721 11,189 12,113 12,962 12,886 13,225 13,766 13,670 13,550 13,927 13,624 13,731 40,25 59,78 68,80 74,48 79,70 79,24 81,32 84,64 84,05 83,32 85,64 83,77 84,43 Khảo sát nhả thuốc in vitro mơi trường nước 5-FU Vì hàm lượng 5-FU khuếch tán vượt đường chuẩn nên mẫu đo pha loãng lần Thời gian A265,5 Nồng độ 5-FU (µg/ml) % 5-FU nhả 1h 2h 3h 4h 5h 6h 24 h 48 h ngày 0.260 0.370 0.387 0.410 0.417 0.419 0.419 0.421 0.424 9.146 13.083 13.687 14.503 14.751 14.822 14.822 14.893 14.999 56.24 80.45 84.16 89.18 90.71 91.14 91.14 91.58 92.23 Phụ lục 15 Kết thử nghiệm hiệu in vivo 5-fluorouracil nang hóa PAMAM G3.0-MPEG chuột mang khối u vú người Lơ Ngày Thể tích Mai Bích Thoa Ngày Ngày 10 Thể tích % Giảm Thể tích % Giảm Ngày 15 Thể tích % Giảm PL 13 Luận văn thạc sĩ 5-FU nang hóa chất mang 5-FU Đối chứng 106,25 126,00 126,00 100,00 87,50 56,00 48,00 101,25 44,00 125,00 80,00 169,00 48,00 169,00 81,25 21,88 64,00 44,00 68,75 147,88 Mai Bích Thoa 68,00 105,88 64,00 81,00 75,00 18,00 62,50 100,00 44,00 272,00 100,00 144,00 48,00 169,00 98,31 29,25 64,00 55,69 68,75 144,00 36,00 15,97 49,21 19,00 14,29 67,86 -30,21 1,23 0,00 -117,60 -25,00 14,79 0,00 0,00 -21,00 -33,71 0,00 -26,56 0,00 2,62 56,00 90,75 44,00 60,75 40,00 24,50 62,50 Chết 44,00 126,00 100,00 90,75 48,00 147,88 75,00 24,75 56,00 75,00 68,75 171,50 47,29 27,98 65,08 39,25 54,29 56,25 -30,21 0,00 53,68 0,00 36,98 0,00 12,50 7,69 -13,14 12,50 -70,45 0,00 -19,10 31,50 40,00 4,00 36,75 0,50 0,50 Chết 70,35 68,25 96,83 63,25 99,43 99,11 40,00 137,31 93,75 75,00 36,75 55,69 62,50 4,00 44,00 75,00 75,00 126,00 9,09 -9,85 -17,19 55,62 23,44 67,05 23,08 81,71 31,25 -70,45 -9,09 14,79 PL 14 ... ? ?Tổng hợp PAMAM lai hóa PEG mang thuốc 5- fluorouracil khảo sát hoạt tính chống ung thư in vivo chuột? ?? nhằm đánh giá sơ khả mang thuốc polymer hoạt tính chống ung thư thể sống 5- fluorouracil mang. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ  MAI BÍCH THOA TỔNG HỢP PAMAM LAI HÓA PEG MANG THUỐC 5- FLUOROURACIL VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ IN VIVO TRÊN CHUỘT LUẬN VĂN THẠC... Lai hóa PAMAM G3.0 với MPEG 50 00  Nang hóa thuốc chống ung thư 5- fluorouracil cấu trúc PAMAM G3.0-MPEG  Khảo sát nhả thuốc in vitro môi trường nước PAMAM G3.0-MPEG5-FU  Thử nghiệm hiệu in vivo