TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT TỪ HESPERETIN VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CHÚNG Hoàng Thị Kim Dung 1 , Nguyễn Cửu Khoa 1 , Nguyễn Ngọc Hạnh 1 Nguyễn Thụy Vy 2 , Hồ Huỳnh Thùy Dương 2 1 Viện Công nghệ Hóa học, Viện KH & CN Việt Nam 2 Phòng Sinh học phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Summary Synthesized and determined antiproliferative activity of some hesperetin derivatives. We synthesized 4 hesperetin derivatives and determined their structure by using physical chemistry analyses (IR, LC-MS, 1H-NMR, 13 C-NMR, HSQC, HMBC). The result when we tested antiproliferative activity of these products showed that the synthetic compounds (at 100µg/ml) exhibited antiproliferative activity similar to hesperetin (63-86% compare with 63-78%) on HeLa, MCF-7, NCI-H460 tumor cells, however, the IC 50 values were higher. 1. Đặt vấn đề: Các nghiên cứu của một số nhà khoa học trên thế giới về tác động của flavonoids họ cam chanh lên các dòng tế bào ung thư ở người thấy rằng các hợp chất tổng hợp có khả năng ức chế sự tăng sinh mạnh tương tự như các hợp chất trong tự nhiên (nhiều hợp chất có IC < 10µM) [1]. Với trữ lượng vỏ quả họ cam chanh ở nước ta khá lớn, đủ điều kiện tạo nguồn dược liệu phong phú mà chưa được khai thác tốt cũng như chưa được nghiên cứu sâu hơn, đặc biệt trong phòng chống và chữa trị bệnh ung thư, chúng tôi tiến hành tổng hợp các dẫn xuất của hesperetin, nhận danh cấu trúc và xác định khả năng gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7, ung thư phổi NCI-H460 theo phương pháp SRB. 2. Nguyên liệu và phương pháp: 2.1. Nguyên liệu: - Hesperetin được thủy phân từ hesperidin và được làm sạch tại Phòng Hữu cơ – Viện Công nghệ Hóa học [2]. - (CH 3 ) 2 SO 4 , propyl bromide, KBr, KCl, oxone - Merck. - Acetone, K 2 CO 3 , CHCl 3 và các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích. 2.2. Phương pháp tổng hợp các dẫn xuất chalcone từ Hesperetin: (CH 3 ) 2 SO 4 K 2 CO 3 acetone, t o s CH 3 CH 2 CH 2 Br K 2 CO 3 acetone, t o s O OCH 2 CH 2 CH 3 OCH 3 OOH H 3 CH 2 CH 2 CO H 2 C CH 2 CH 3 OCH 3 OCH 3 OCH 3 OOH H 3 CO O OH OCH 3 OOH HO (72%) (68%) Hesperetin (1mmol) được ether hoá bằng dimethyl sulfat hoặc 1-bromopropane (4.5 mmol)với xúc tác K 2 CO 3 (3g) trong acetone (50ml), hỗn hợp được đun hồi lưu và theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng. Sản phẩm tạo thành được làm sạch bằng sắc ký cột và phân tích cấu trúc dựa trên các phổ IR, LC-MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR. 2.3. Phương pháp tổng hợp các dẫn xuất halogen của Hesperetin: [3] Oxone (KHSO 5 .KHSO 4 .K 2 SO 4 ) (2.2mmol) được cho vào một hỗn hợp gồm hesperetin (1mmol), KCl (hay KBr) (2.2mmol) trong acetone (15ml). Phản ứng được khuấy liên tục và duy trì ở nhiệt độ 20 o C, theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng. Sau phản ứng, hỗn hợp được qua lọc và bay hơi dung môi dưới áp suất kém. Sản phẩm tạo thành được làm sạch bằng sắc ký cột và phân tích cấu trúc dựa trên các phổ IR, LC-MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR. 2.3. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào: Phương pháp Sulforhodamine B (SRB) [4] (thực hiện tại Phòng Sinh học Phân tử – Bộ môn Di truyền – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM) 3. Kết quả và thảo luận: 3.1. Nhận dạng cấu trúc: 3.1.1. Nhận dạng 2’,3,4,4’-tetramethoxy-6’-hydroxychalcone: - Sản phẩm thu được có dạng tinh thể hình kim, màu đỏ, độ sạch > 99%. - Phổ IR (cm -1 ): 3057, 2989, 2922, 2948, 1618, 1549, 1544, 1261, 1217, 1151, 814, 610. - Khối phổ MS cho pick [M+H + ] = 345 tương ứng với trọng lượng phân tử là 344. - Phổ 1 H-NMR (DMSO, δ ppm), 13 C-NMR (DMSO, δ ppm) kết hợp với DEPT, HSQC, HMBC: Vị trí C/H 1 H-NMR δ ppm (số H; dạng mũi; J=Hz) 13 C-NMR δ ppm HMBC 1 H→ 13 C OCH 3 3,813 (3H, s) 55,480 H → C 4’ OCH 3 x 2 3,818 (3H, s) 3,830 (3H, s) 55,585 H → C 7 H → C 3’ OCH 3 3,888 (3H, s) 56,098 H → C 9 2 7,590 (1H, dd, J=15,5) 142,992 H 2 → C 3,1’,2’ 3 7,636 (1H, dd, J=15,5) 125,188 H 3 → C 2,1’,4 4 192,247 5 165,125 6 6,117 (1H, d, J=2,5) 93,862 H 6 → C 8, 10,5,7 7 165,181 8 6,152 (1H, d, J=2) 90,998 H 8 → C 6,10,9,7 9 161,679 10 106,450 1’ 127,558 2’ 7,280 (1H, d, J=2) 110,793 H 2’ → C 6’, 3’,2 3’ 148,950 4’ 151,087 5’ 7,012 (1H, d, J=8,5) 111,753 H 5’ → C 1’,3’,4’ 6’ 7,298 (1H, dd, J=2 và 8,5) 122,763 H 6’ → C 2’,2,4’ OH 13,393 H → C 6,10,5 3.1.2. Nhận dạng 2’,3,4’-tripropoxy-4-methoxy-6’-hydroxychalcone : - Sản phẩm thu được có dạng tinh thể hình kim, màu cam, độ sạch > 97%. - Phổ IR (cm -1 ): 2961, 2939, 2937, 2873, 1623, 1507, 1431, 1260, 1216, 1188, 1138, 1016, 841, 806, 764, 610. - Khối phổ MS cho pick [M+H + ] = 429 tương ứng với trọng lượng phân tử là 428. - Phổ 1 H-NMR (DMSO, δ ppm), 13 C-NMR (DMSO, δ ppm) kết hợp với DEPT, HSQC, HMBC: Vị trí C/H 1 H-NMR δ ppm (số H; dạng mũi; J=Hz) 13 C-NMR δ ppm HMBC 1 H→ 13 C CH 3 x 3 0,972-1,004 (9H) 10,235-10,496 H → C CH2, OCH2 CH 2 x 3 1,703-1,878 (6H) 21,807-22,070 H → C CH3, OCH2 OCH 3 3,816 (3H, s) 55,591 H → C 4’ OCH 2 x 3 3,939-4,042 (6H) 69,397-70,292 H → C CH3, CH2, 3(7) 2 7,632 (1H, d, J=16) 142,789 H 2 → C 3,2’,1’,4 3 7,782 (1H, d, J=16) 124,835 H 3 → C 2,4,1’ 4 192,025 5 166,417 6 6,070 (1H, d, J=2) 94,185 H 6 → C 8,10,5,7 7 165,080 8 6,082 (1H, d, J=2) 91,756 H 8 → C 6,10,9,7 9 161,477 10 105,803 1’ 127,574 2’ 7,247 (1H, d, J=2) 111,028 H 2’ → C 6’, 3’,2,1’ 3’ 148,337 4’ 151,351 5’ 7,011 (1H, d, J=8) 111,840 H 5’ → C 1’,3’,4’ 6’ 7,221 (1H, dd, J=2 và 8) 123,405 H 6’ → C 2,4’,5’ OH 13,969 H → C 6,10,5 3.1.3. Nhận dạng 6,8-chloro-3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone: - Sản phẩm thu được có dạng bột, màu vàng nhạt, độ sạch > 96%. - Phổ IR (cm -1 ): 3529, 3360, 2944, 2902, 2846, 1630, 1516, 1443, 1346, 1264, 1181, 1128, 1096, 883, 796, 552. - Khối phổ MS cho pick [M+H + ] = 370 tương ứng với trọng lượng phân tử là 369. - Phổ 1 H-NMR δ (ppm): 3.782 (3H, s, -CH 3 ), 2.865 (H 3 , dd, J=3Hz và J=17Hz), 3.310 (H 3 , dd, J=12Hz và J=17Hz), 5.603 (H 2 , dd, J=3Hz và J=12Hz), 6.882 (H 6’ , dd, J=2Hz và J=8Hz), 6.946 (H 2’ , d, J=2Hz), 6.966 (H 5’ , d, J=8Hz). - Phổ 13 C-NMR δ (ppm): 41.375 (C 3 ), 55.654 (-CH 3 ), 79.019 (C 2 ), 100.202 (C 8 ), 100.857 (C 6 ), 102.110 (C 10 ), 112.082 (C 2’ ), 114.005 (C 5’ ), 117.598 (C 6’ ), 130.355 (C 1’ ), 146.504 (C 3’ ), 148.032 (C 4’ ), 155.886 (C 9 ), 156.576 (C 5 ), 156.965 (C 7 ), 196.530 (C 4 ). 3.1.4. Nhận dạng 6,8-dibromo-3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone: - Sản phẩm thu được có dạng bột, màu vàng nhạt, độ sạch khoảng 93%. - Phổ IR (cm -1 ): 3542, 3387, 2973, 2937, 2841, 1635, 1560, 1516, 1442, 1401, 1347, 1298, 1258, 1179, 1130, 1103, 1074, 1020, 965, 869, 829, 789, 725, 688, 628, 591, 551. - Khối phổ MS cho pick [M+H + ] = 461 tương ứng với trọng lượng phân tử là 460. - Phổ 1 H-NMR (DMSO, δ ppm), 13 C-NMR (DMSO, δ ppm) kết hợp với DEPT, HSQC, HMBC: Vị trí C/H 1 H-NMR δ ppm (số H; dạng 13 C-NMR δ ppm HMBC 1 H→ 13 C mũi; J=Hz) OCH 3 3,781 (3H, s) 55,654 H → C 4’ 2 5,611 (1H, dd, J=3 và J=12) 78,953 H 2 → C 5’,6’,1’,4 3 2,888 (1H, dd, J=3 và J=17) 3,304 (1H, dd, J=12 và J=17) 41,190 H 3 → C 10,1’,4 H 3 → C 2,1’,4 4 196,623 5 158,394 6 90,675 7 159,029 8 89,801 9 157,648 10 102,788 1’ 130,398 2’ 6,947 (1H, d, J=2) 112,038 H 2’ → C 6’, 3’,2,1’ 3’ 146,504 4’ 148,004 5’ 6,964 (1H, d, J=8,5) 113,983 H 5’ → C 1’,4’,2,6’ 6’ 6,883 (1H, dd, J=2 và 8,5) 117,546 H 6’ → C 2,5’,4’ OH 9,104 OH 12,866 H → C 5,10,6 3.2. Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB: 3.2.1- Sàng lọc thô ở nồng độ 100µg/ml:  Dòng tế bào: Ung thư cổ tử cung HeLa STT Mẫu Tỉ lệ (%) gây độc tế bào Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC 1 2’,3,4,4’-tetramethoxy-6’- hydroxychalcone 73.75 74.34 57.60 68.56 ± 9.50 2 2’,3,4’-tripropoxy-4-methoxy- 6’-hydroxychalcone -9.87 -1.88 0.66 -3.7 ± 5.50 3 6,8-chloro-3’,5,7-trihydroxy-4’- methoxyflavanone 53.16 38.34 42.74 44.75 ± 7.61 4 6,8-dibromo-3’,5,7-trihydroxy- 4’-methoxyflavanone 87.20 84.89 87.05 86.38 ± 1.29 5 Hesperetin 63.55 66.95 70.29 66.93 ± 3.37 6 Chứng dương (CPT 0.01 µg/ml) 63.55 59.83 33.71 52.36 ± 16.26  Dòng tế bào: Ung thư vú MCF-7 STT Mẫu Tỉ lệ (%) gây độc tế bào Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC 1 2’,3,4,4’-tetramethoxy-6’- hydroxychalcone 77.01 61.17 64.07 67.42 ± 8.43 2 2’,3,4’-tripropoxy-4-methoxy- 6’-hydroxychalcone 32.77 21.88 38.78 31.14 ± 8.56 3 6,8-chloro-3’,5,7-trihydroxy- 4’-methoxyflavanone 63.70 65.19 62.61 63.83 ± 1.30 4 6,8-dibromo-3’,5,7-trihydroxy- 4’-methoxyflavanone 68.65 69.34 70.92 69.63 ± 1.17 5 Hesperetin 79.85 76.05 78.43 78.11 ± 1.92 6 Chứng dương (camptothecin 0.01 µg/ml) 48.67 53.89 48.37 50.31 ± 3.11  Dòng tế bào: Ung thư phổi NCI-H460 STT Mẫu Tỉ lệ (%) gây độc tế bào Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC 1 2’,3,4,4’-tetramethoxy-6’- hydroxychalcone 77.01 61.17 64.07 67.42 ± 8.43 2 2’,3,4’-tripropoxy-4-methoxy- 6’-hydroxychalcone 6.71 5.03 6.97 6.24 ± 1.05 3 6,8-chloro-3’,5,7-trihydroxy- 4’-methoxyflavanone 79.21 70.30 72.47 74.00 ± 4.65 4 6,8-dibromo-3’,5,7-trihydroxy- 4’-methoxyflavanone 73.82 76.17 76.31 75.43 ± 1.40 5 Hesperetin 71.30 52.35 67.68 63.78 ± 10.06 6 Chứng dương (camptothecin 0.01 µg/ml) 75.93 82.55 78.05 78.84 ± 3.38 3.2.2- Xác định giá trị IC 50 trên dòng tế bào MCF-7: STT Mẫu IC 50 (µg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC 1 6,8-chloro-3’,5,7-trihydroxy- 4’-methoxyflavanone 73.23 72.95 73.00 73.06 ± 0.15 2 6,8-dibromo-3’,5,7-trihydroxy- 4’-methoxyflavanone 70.52 69.32 72.05 70.63 ± 1.37 3 Hesperetin 34.19 39.43 39.34 37.65 ± 3.00 TB, ĐLC: trung bình, độ lệch chuẩn Kết luận: chúng tôi đã tồng hợp thành công các dẫn xuất của Hesperetin và kết quả thử nghiệm sàng lọc thô ở nồng độ 100(µg/ml) trên 3 dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi NCI-H460 cho thấy ngoại trừ 2’,3,4’-tripropoxy-4-methoxy-6’- hydroxychalcone có khả năng gây độc tế bào yếu thì các chất còn lại đều có khả năng gây độc tế bào (63-86%) tương tự như Hesperetin (63-78%), khả năng gây độc chêch lệch ít giữa các dòng tế bào. Tuy nhiên giá trị IC 50 trên dòng MCF-7 của hai dẫn xuất halogen lại cao hơn hesperetin cho thấy khả năng gây độc của các hợp chất này vẫn còn thấp, cần có nhiều nghiên cứu tổng hợp thêm các hợp chất khác. Tài liệu tham khảo 1. Yanling Li, Hao Fang, Wenfang Xu, Recent advance in the research of flavonoids as anticancer agents, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2007, 7, 663-678. 2. Hoàng Thị Kim Dung, Nguyễn Cửu Khoa, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Thị Thu Hương, Hồ Việt Anh, So sánh hoạt tính chống oxy hóa của một số flavonoid (dạng glucosid và dạng genin) chiết từ hoa hòe và vỏ quýt, Tạp chí Dược liệu, Tập 11, số 5, trang 185-188 (2006). 3. Regioselective bromination of aromatics using KBr/oxone, Synth. Comm., 2002, 32 (15), 2313-18. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dương, Báo cáo tổng kết đề tài Xây dựng và hoàn chỉnh các quy trình dùng trong sàng lọc tính kháng phân bào của cây thuốc ở mức độ tế bào và phân tử, Chương trình Nghiên cứu cơ bản, Sở Khoa học và Công nghệ Tp.HCM 2007. . TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT TỪ HESPERETIN VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CHÚNG Hoàng Thị Kim Dung 1 , Nguyễn Cửu Khoa 1 , Nguyễn. trong phòng chống và chữa trị bệnh ung thư, chúng tôi tiến hành tổng hợp các dẫn xuất của hesperetin, nhận danh cấu trúc và xác định khả năng gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư cổ tử cung. lại đều có khả năng gây độc tế bào (63-86%) tương tự như Hesperetin (63-78%), khả năng gây độc chêch lệch ít giữa các dòng tế bào. Tuy nhiên giá trị IC 50 trên dòng MCF-7 của hai dẫn xuất halogen