BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HĨA HỌC BÁO CÁO CƠNG NGHỆ LÊN MEN ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC (BACILLUS THURINGIENSIS) GVHD: ThS VƯƠNG THỊ VIỆT HOA THỰC HIỆN: Trần Cao Hiếu Nguyễn Văn Giàu Nguyễn Văn Phước Trần Nguyễn Thanh Tâm Lê Thị Hồng Thy Phạm Thị Thu Hiền 10139061 10139048 10139179 10139199 10139235 10139059 TP Hồ Chí Minh, tháng 10/2013 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Trong sản xuất nông nghiệp, bên cạnh yếu tố “nước, phân, cần, giống”, sinh vật hại trồng vấn đề lớn mà người phải đối mặt Có nhiều loại sinh vật khác sử dụng trồng làm thức ăn, ký sinh trồng Do đó, chúng nghững nguyên nhân lớn gây thiệt hại nặng nề cho suất trồng Trong chiến cam go người với sâu hại, dấu mốc đánh dấu thắng lợi người, việc sản xuất thuốc hóa học Thuốc hóa học bảo vệ thực vật chất độc có nguồn gốc hóa học, có tác dụng phịng trừ loại dịch hại trồng bao gồm sâu hại, bệnh hại, cỏ dại, nhện hại… Chất độc chất xâm nhập vào thể sinh vật với lượng nhỏ phá hủy chức tế bào thể, dẫn đến làm chết sinh vật hại Thuốc bảo vệ thực vật hóa học có nhiều ưu điểm trội: thuốc có hiệu nhanh thể sinh vật hại, có hiệu tác dụng phạm vi rộng, với nhiều loại dịch hại loại trồng Tuy nhiên, với ưu điểm trội đó, thuốc trừ sâu hóa học có nhiều nhược điểm, gây tác hại không nhỏ cho môi trường sức khỏe người Nếu sử dụng thuốc nhiều lần với nồng độ cao làm cho sâu hại nhờn thuốc, tạo nên tính kháng thuốc quần thể sâu hại sau vài hệ chọn lọc Do khả tiêu diệt sâu cao, lại có phổ tác dụng rộng, thuốc trừ sâu hóa học làm giảm sút rõ rệt tính đa dạng quần thể có ích, mặt tiêu diệt sinh vật có ích, mặt khác làm cân sinh thái Đã dẫn đến hậu làm xuất loại dịch hai (do quần thể ban đầu đột biến chống chịu với thuốc) làm tái phát dịch hại (quần thể sâu hại phát triển kháng thuốc không bị khống chế thiên địch, đồng thời có cạnh tranh quần thể) Khơng vậy, thuốc trừ sâu học có thời gian tồn lâu dài mơi trường nên gây ô nhiễm đến môi trường đất, nước khơng khí Và quan trọng cả, sử dụng liên tục, thuốc trừ sâu tích lũy đất, vào chuỗi thức ăn đạt đến nồng độ sinh học gây hại cho sức khỏe người, chí nhiều trường hợp dẫn đến tử vong Chính hậu nên đặt nhu cầu thiết việc phát triển loại thuốc bảo vệ thực vật mới, đảm bảo phải có tác dụng diệt sâu cao, hiệu lực nhanh chóng, phổ tác dụng rộng, có hiệu nhiều loại sâu, không ảnh hưởng đến chất lượng nông sản, không ảnh hưởng đến đất trồng trọt mơi trường khơng khí, khơng tạo nên tính kháng thuốc sâu hại, không làm sinh vật có ích, lồi thiên địch vi sinh vật có lợi cho người, lại có hiệu kéo dài Đó chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật Việt Nam nước nông nghiệp với 75% dân số sống nông thôn với 10 triệu canh tác, nơng nghiệp ngành sản xuất chính, chiếm vị trí quan trọng kinh tế quốc dân Mặc dù điều kiện khí hậu, đất đai, sơng ngịi thuận tiện cho phát triển nơng nghiệp, khí hậu nóng, ẩm lại tạo điều kiện thuận lợi co phất triển loài sâu bệnh, gây tổn thất hàng năm khoảng 13-20% mùa màng Hơn với thói quen người dân Việt Nam thường lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật, việc sử dụng không quy định thời gian liều lượng, chí dùng thuốc bị cấm nên để lại nhiều hậu đáng tiếc Do cơng nghệ sản xuất chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật quan tâm phát triển ngày phổ biến mạnh mẽ nhằm giải vấn đề môi trường, người, cân hệ sinh thái Vì lý nên chọn đề tài: “Công nghệ sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học” để làm tiểu luận CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cùng với đa dạng trồng đa dạng sâu hại Việt Nam lớn Hàng năm, thiệt hại sâu hại khoảng 25-30% chí có lên đến 40-50% Thành phần sâu hại khoảng 753 loài thuộc 99 họ 10 Để khắc phục tình trạng này, năm nước ta phải nhập 25.000 thuốc bảo vệ thực vật Năm 2004 nước ta có đến 436 loại hóa chất với 1231 tên thương phẩm khác nhau, trị giá khoảng 170 triệu USD Do sâu hại có khả kháng thuốc nên người trồng trọt thường tăng nồng độ sử dụng dẫn đến dư lượng thuốc trừ sâu sản phẩm nơng nghiệp tăng cao gây an tồn cho người sử dụng, ảnh hưởng bất lợi môi trường, sức khỏe cộng đồng người trồng trọt Ngồi ra, sản phẩm khơng thể xuất nên ảnh hưởng lớn đến thu nhập nông dân Đây thách thức lớn cho nông dân Việt Nam nhập WTO Chính mà phát triển nghành sản xuất thuốc bảo vệ thực vât vi sinh vật ngày manh giới nước ta 1.1 Lịch sử phát triển nghành sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Trên giới, việc sử dụng vi sinh vật bảo vệ thực vật ngày phát triển mạnh mẽ, tìm nhiều chủng vi sinh vật có khả gây bệnh cho trùng Chủng vi sinh vật phát sử dụng để diệt sâu hại côn trùng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) Ishwatari tìm thấy đầu tiên, ơng đặt tên Bacillus sotto năm 1901 Đến năm 1911, loài vi khuẩn Ernst Berlinner phát đặt tên Bacillus thuringiensis ông nghiên cứu tác nhân gây bệnh loài sâu xám tỉnh Thuringia, Đức Đến năm 1938, lần Bacillus thuringiensis sử dụng làm thuốc trừ sâu Pháp đến thập niên năm 1950, Bt sử dụng rộng rãi Mỹ Bt nghiên cứu ứng dụng rộng rãi nhiều quốc gia đem lại hiệu đáng kể ở: Hoa Kỳ, Liên Xô Cũ, Pháp, Đức, Trung Quốc, Nhật Bản…Ở nước ta, từ cuối thập kỷ 80 đầu thập kỷ 90 số quan nghiên cứu khoa học bắt đầu sản xuất chế phẩm diệt sâu từ Bt Hiệu lực chế phẩm Bt sản xuất Trang nước sâu tơ, sâu xanh, sâu loại nhỏ tương ứng đạt : 60% – 100% , 12% – 32%, 28% – 100% Việc ứng dụng chủng vi sinh vật có khả gây độc với côn trùng sâu hại vào công tác bảo vệ thực vật giới nước ta phát triển ngày mạnh mẽ dần thay cho loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học gây ô nhiễm môi trường gây độc cho động vật người 1.2 Tổng quan thuốc trừ sâu sinh học 1.2.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh hoc Thuốc trừ sâu vi sinh chế phẩm sinh học sản xuất từ chủng vi sinh vật nuôi cấy môi trường dinh dưỡng khác theo phương pháp thủ công, bán thủ công phương pháp lên men công nghiệp để tạo chết phẩm có chất lượng cao có khả phòng trừ loại sâu hại trồng nông, lâm nghiệp 1.2.2 Thành phần thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học sản xuất ứng dụng dựa vào khả gây bệnh, độc cho thể côn trùng, sâu hại thành phần thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật chủng vi sinh vật có khả gây bệnh cho côn trùng, sâu hại dạng bào tử chúng 1.3 Đặc điểm thuốc trừ sâu sinh học 1.3.1 Đặc điểm chế tác dụng thuốc trừ sâu sinh học + Ưu điểm − So với thuốc bảo vệ thực vật hóa học thuốc trừ sâu sinh học có nhiều đặc điểm tốt là: − Khơng gây độc hại cho người, động vật, trồng, có khả tiêu diệt cách chọn lọc loại sâu bệnh Người ta nói chúng có tính đặc hiệu cao việc tiêu diệt trùng Trong đó, thuốc trừ sâu hóa học gây độc hại người, gia súc, tiếp xúc lâu dài số tác nhân gây ung thư Do Trang không gây độc hại người, lại không ảnh hưởng xấu phát triển khu hệ vi sinh vật quanh hệ rễ cuả trồng, nên chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật không phá vỡ cân hệ sinh thái, không gây ô nhiễm môi trường sống − Việc sử dụng chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học bảo vệ thực vật chưa phát thấy tượng lờn thuốc lồi trùng Đó điều đáng quan tâm, loại thuốc hố học trừ sâu bệnh sử dụng lâu dài từ trước đến việc sử dụng tuỳ tiện nên tính lờn thuốc xuất loài sâu bệnh, bắt buộc người ta phải nâng dần nồng độ sử dụng lên mà hiệu lại giảm dần − Có thể chuyển gen chi phối việc tạo tính độc trùng gây hại sang cho nhiều loại trồng tạo nên trồng tự có khả kháng lồi sâu hại Đây tác dụng mà chế phẩm thuốc trừ sâu hố học khơng thể có − Các chế phẩm bảo vệ thực vật vi sinh vật khác với hợp chất hoá học trừ sâu hại chất sống nó, tức chứa nhân tố gây bệnh, làm chết côn trùng vi sinh vật sống Do việc bảo quản xử lý chế phẩm ngồi đồng ruộng có yêu cầu khác so với hợp chất hoá học trừ sâu hại Một tượng tự nhiên tạo thuận lợi lớn cho người sử dụng chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật phun thiên nhiên, vi sinh vật chế phẩm đề có khả thích nghi cao, hội nhập vào tự nhiên cách thuận lợi để tham gia vào hoạt động đấu tranh sinh học cách tích cực Cụ thể ta phun chế phẩm (ví dụ vi khuẩn…) có khả trở thành thành viên sinh quần nơi đó, chúng tự sinh sơi nảy nở tăng số lượng − Các vi sinh vật diệt trùng tồn điều kiện môi trường không thuận lợi (không vật chủ, điều kiện khí hậu khắc nghiệt…) nhiều dạng khác nhau: dạng bào tử (vi khuẩn Bacillus) Trang − Khả phát tán rộng tự nhiên giống vi sinh vật có ý nghĩa lớn việc tăng cường lây lan tạo thành dịch côn trùng, ưu điểm lớn thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật + Nhược điểm: Bên cạnh ưu điểm thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật số hạn chế như: − Thuốc trừ sâu vi sinh có tính đặc hiệu cao nên phổ tác động hẹp Do để tiêu diệt nhiều loại trùng phải sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu virus, điều không mang lại hiệu kinh tế − Diễn biến chậm, gặp điều kiện thời tiết bất thuận khó đạt kết tốt − Chịu tác động môi trường lớn ánh sáng, lượng nước tưới, nước mưa, nhiệt độ v.v − Khó cân đong ngồi đồng ruộng, thời gian bảo quản ngắn, thường - năm, điều kiện lạnh, khô − Giá thành cao Tuy nhiên với hạn chế nhỏ hạn chế nhiều biện pháp khác 1.3.2 Cơ chế gây độc thuốc trừ sâu sinh học Các vi sinh vật diệt trùng nhiễm lên trùng nhiều cách khác : bàng đường tiêu hoá (ở vi khuẩn), sâu ăn phải có vi khuẩn, tinh thể độc với bào tử xâm nhập vào thể sâu qua đường tiêu hóa Khi vào ruột giữa, tinh thể độc hòa tan protease ruột hoạt hóa thành dạng có hoạt tính độc Độc tố liên kết với tế bào biểu mô thành ruột , đâm qua màng tạo thành lỗ xuyên màng, làm cân ion nội bào tế bào biểu mô làm cho chúng bị phân giải, ruột bị phá hoại, sâu chết Trang 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới chế gây độc thuốc trừ sâu sinh học 1.4.1 Ảnh hưởng yếu tố vật lý Nhiệt độ: Các chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học tương đối bền với nhiệt, gới hạn nhiệt độ mà chúng tồn tương đối rộng Chúng chịu nhiệt độ lên tới 90oC Độ ẩm: Khi dạng bào tử độ ẩm mơi trường khơng ảnh hưởng nhiều tới chúng Khi dạng sinh trưởng độ ẩm có tác động lớn tới tác dụng gây độc thể trùng chúng Độ ẩm thích hợp cho chúng phát triển thể côn trùng sâu hại tùy thuộc vào chế phẩm, thường độ ẩm tốt nằm khoảng 70-85% Các yếu tố khác: Bên cạnh yếu tố nhiệt độ, độ ẩm ánh sáng, gió, mưa ảnh hưởng không nhở tới tác dụng chế phẩm số loại chế phẩm thường bị phân hủy tác dụng ánh sáng mặt trời với cường độ chiếu sáng cao Mưa tác dụng lớn tới phạm vi gây bệnh chế phẩm, phun chế phẩm gặp trời mưa dẽ bị rửa trơi hiệu khơng cao 1.4.2 Ảnh hưởng yếu tố hóa học pH: pH môi trường mà chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh vật tồn tai phát triển tốt môi trường kiềm bên thể côn trùng, sâu hại khoảng pH tối thích tùy thuộc vào loại chế phẩm khác nhau, thông thường nằm khoảng pH=6,5-7,5 tốt Các yếu tố khác: Ngồi pH mơi trường chế phẩm chịu tác động số chất có thuốc bảo vệ thực vật hóa học dùng số chất kích thích sinh trưởng khác 1.5 Các chủng VSV sử dụng để sản xuất thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật 1.5.1 Một số vi khuẩn sinh bào tử điển hình diệt sâu hại Clostridium brevifaciens Clostridium malacosomae Bacillus cereus Trang Bac thuringiensis Bac thuringiensis var entomocidus Bac thuringiensis var galleriae Bac thuringiensis var isralensis Bac sphaericus Bac sopilliae 1.5.2 Một số vi khuẩn không sinh bào tử điển hình diệt sâu hại • Serratia marcesecens • Pseudomonas aeruginosa • P putida • Proteus vulgaris • Proteus mirabilis • Nhiều lồi chi Acrobacter • Nhiều lồi chi Cloaca 1.6 Các lọai thuốc trừ sâu sinh học phổ biến thị trường 1.6.1 Các lọai thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc vi khuẩn Chế phẩm Bt (Bacciluss thuringiensis) Ở Việt Nam, chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) nghiên cứu từ năm 1971 Hơn 20 chế phẩm Bt nhập nội địa cho kết tốt phịng thí nghiệm ngồi đồng số sâu hại đồng ruộng sâu xanh bướm trắng, sâu xám, sâu tơ, sâu hại bông, sâu đo Các lọai sản phẩm thương mại có thị trường nhiều Vi-Bt 32000WP, 16000WP; Bt Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột; Firibiotox C dạng dịch cô đặc Khoa Nông nghiệp sinh học ứng dụng (Đại học Cần Thơ) nghiên cứu đưa chế phẩm sinh học Biobac Biosar có khả phòng trừ bệnh thường gặp lúa đốm vằn cháy Chế phẩm Biobac sản xuất từ chủng vi khuẩn có sẵn địa phương, có khả tiêu diệt ức chế phát triển sợi nấm gây bệnh đốm vằn Còn chế phẩm Biosar sản phẩm chiết xuất từ số lồi thực vật, có khả kích thích tính kháng bệnh cháy lúa (đạo ơn) nấm Pyricularia gây Trang 10 loại hình trịn, hình bầu dục tùy theo lồi loại mơi trường Tinh thể loại protein (chất diệt sâu) có hiệu chủ yếu Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (crystal) bào tử (spore) Hình Nang bào tử vỡ giải phóng bào tử tinh thể độc 2.1.4 Độc tố chế lây nhiễm độc Bt 2.1.4.1 Các loại độc tố Bt Vi khuẩn Bt gây bệnh cho côn trùng qua đường tiêu hoá Bào tử nảy nầm đẫn đến sinh sản vi khuẩn thể vật chủ làm côn trùng chết, song yếu tố làm trùng chết nhanh chóng lại chất độc vi khuẩn sinh ra, chất độc tinh thể (Cry) mã hoá gen Cry khác (đây dấu hiệu dùng để phân loại nhóm Bt chất độc phân giải tế bào (Cry) có tác động riêng rẽ tổ hợp Cry làm tăng tác dụng tinh thể độc Nhóm chất độc Cry bao gồm ngoại độc tố (sản phẩm tiết vi khuẩn) α, β, γ - Ngoại độc tố α loại enzyme phospholipase tiết trước bào tử tinh thể độc hình thành, chúng có tác dụng gây nên phân huỷ mô thể côn trùng bị tác động Trang 14 - Ngoại độc tố β loại độc tố Bt nghiên cứu kỹ thuật Độc tố có tính bền nhiệt, tạo trước tinh thể độc hình thành Ngoại độc tố β có cấu trúc tương tự ATP, có tác dụng canh tranh với ATP, làm ức chế hoạt động ARN_polymerase Cùng với tinh thể độc, ngoại độc tố xâm nhập vào huyết tương côn trùng, đến quan làm tăng tính độc vi khuẩn vào thể côn trùng Hiệu ngoại độc tố β thể rõ đối tượng sâu non côn trùng chịu tác động, làm ngăn cản trình lột xác, gây dị thường trình phát triển sâu Tác dụng độc tố phụ thuộc vào liều lượng cách thức sử dụng để gây độc, thường gây độc qua tiêm cho hiệu mạnh qua đường tiêu hoá - Ngoại độc tố γ; độc tố loại phosphlipase tác động lên phostpholipid, làm phá huỷ mô tế bào sâu hại bị nhiễm Bt So với nhóm độc tố trên, tinh thể độc Cry tạo với lượng lớn có hiệu gây độc cho trùng Tinh thể Cry gọi nội độc tố δ Tinh thể độc protein kết tinh có kích thước khác biệt tuỳ nhóm Ngồi thành phàn protein, tinh thể nhiều nguyên tố khác Ca, Mg, Fe, Si, Zn hay Al… Tinh thể độc bắt đầu tạo khởi đầu trình hình thành bào tử, dần tích luỹ từ protein tế bào có liên hệ mật thiết với màng bào tử kết tinh thành tinh tghể có nhiều dạng khác nhau, chủ yếu hình thoi Tinh thể khơng hồ tan nước, chất hữu (chloroform, ethanol, ester), tan dung dịch kiềm tinh thể ổn định dung dịch có phạm vi pH rộng (4-12), bị biến tính acid trichoaxetic, chlorua thuỷ ngân.Tuy nhạy cảm với nhiệt độ cao song có tính chịu nhiệt nhhất định (ở 65oC giữ 1h, 80oc giữ phút) Độc tố δ gồm có vùng chức là: - Vùng I bó gồm chuỗi xoắn α Một vài tất chuỗi cài vào màng tế bào ruột, tạo lỗ, từ ion qua lại tự - Vùng II chứa dải β không song tương tự vùng gắn kháng nguyên globulin miễn dịch Vùng có vai trị gắn với thụ thể bề mặt tế bào biểu mơ ruột - Vùng III có nhiệm vụ bảo vệ độc tố hoạt hố khơng bị phân huỷ protease ruột Trang 15 Hình Bào tử nội độc tố δ Bacillus thurigiensis Với cấu trúc phức tạp vậy, nội độc tố δ liên kết đặc hiệu với thụ thể màng tế bào biểu mô ruột sâu, gây rác động dây chuyền nêu Chính điều làm nên tính đặc hiệu cao hiệu tác động Bt lên sâu hại Do phổ tác dụng Bt tương đối hẹp, tuỳ loại tinh thể độc mà chủng Bt có tác dụng với loại sâu nhóm trùng chủ yếu thuộc Lepidoptera Đã có 50 gen mã hoá cho protein tinh thể độc giải mã cho phép phân loại chất độc vào thành phần 15 nhóm dựa giống trình tự gen, nêu bảng sau: Bảng 2: Các nhóm tinh thể diệt trùng Khối Gen Hình dạng tinh protein thể CryI ( nhiều nhóm phụ: A(a),A(b), Hình thoi A(c), B, C, D, E, F, G) Cry II (nhóm phụ : A, B, C) Cry III (nhóm phụ : A, B, C) lượng Hình khối Hình phẳng Trang 16 thể(kDa) 130-138 tinh Đối tượng diệt Các ấu trùng 69-71 cánh vảy Côn trùng cánh 73-74 vảy, hai cánh Côn trùng cánh Cry III (nhóm phụ : A, B, C) Cry V- IX vơ định hình Hình thoi Đa dạng 73-134 35-129 cứng trùng hai cánh Nhiều lồi 2.1.4.2 Cơ chế gây độc Bt Cơ chế gây độc tinh thể độc với bào tử xâm nhập vào thể sâu đường tiêu hoá sâu ăn phải có vi khuẩn Trong điều kiện bình thường, tinh thể độc khơng hồ tan Khi vào ruột sâu, nơi có pH kiềm cao (>9,5) làm cho tinh thể độc tan Tuy nhiên dạng hoà tan chưa phải dạng hoạt động Dạng tiền độc tố (có kích thước từ 135-140 kDa) protease ruột sâu hoạt hoá thành dạng hoạt tính (60-66 kDa) độc tố δ Độc tố liên kết với tế bào mô thành ruột, đâm qua màng tạo thành lỗ xuyên màng, làm cân ion nột bào tế bào biểu mô làm chúng bị phân giải, sâu ngừng ăn bị chết đói pH ruột bị giảm xuống với pH nội môi huyết tương Độ pH thấp cho phép bào tử nảy mầm, xâm nhập vật chủ cuối gây chết Trang 17 Hình 5: Cơ chế tác động tinh thể độc sâu - A: Sâu ăn có vi khuẩn  tinh thể độc bào tử xâm nhập vào thể sâu Trong điều kiện bình thường, tinh thể độc khơng hịa tan - B Q trình hịa tan tinh thể hoạt hóa chất độc: xảy ruột nơi có pH kiềm cao (> 9,5), pH tinh thể độc tan  tiền độc tố có kích thước 135- 140 kDa  protease ruột sâu hoạt hóa thành dạng hoạt động độc tố δ (kích thước 60- 66 kDa) - C Độc tố liên kết với thụ thể (receptor) biểu bì ruột  đâm qua màng tạo thành lỗ xuyên màng  cân ion nội bào tế bào biểu mô  tế bào nội mô bị phân giải  sâu ngừng ăn  chết đói - D Lỗ xuyên màng xuất thành ruột  pH ruột giảm xuống pH nội môi huyết tương  cho phép bào tử nảy mầm, xâm chiếm vật chủ gâychết 2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới chế gây độc Bt Vi khuẩn Bt nhu cầu dinh dưỡng không cao Chất dinh dưỡng chủ yếu protein động thực vật, phát triển bình thường nhiều nguồn nitơ, nguồn cacbon muối vô Thông thường dùng nguồn cacbon tinh bột, maltose, glucose Nguồn nitơ Trang 18 N hữu thịt bò pepton, bột men, bột bánh lạc, bột bánh đậu, bột cá… Muối vô thường dùng K2HPO4, MgSO4, CaCO3 Vi khuẩn Bt sinh trưởng từ 12-400C, nhiệt dộ thích hợp 27-32oC, 35-40oC chúng sinh trưởng nhanh chóng bão hòa, nhiệt độ thấp chúng sinh trưởng chậm Vi khuẩn Bt thích hợp mơi trường kiềm pH=7.5, điều kiện 8,5 hình thành bào tử, pH =5 khơng hình thành bào tử Vi khuẩn loại hiếu khí, phải có đủ oxi sinh trưởng tốt, hình thành bào tử Nếu thiếu oxi khơng hình thành bào tử hình thành chậm Phản ứng sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Bt: làm ngưng kết sữa, hình thành acid, khơng hình thành indo đường glucose, maltose, tinh bột,…có phản ứng dương với methyl đỏ, phản ứng VP dương (etheryl methylmethanol), có tác dụng hịa tan mơi trường huyết ngựa agar, mọc mơi trường muối xianat, khử muối nitrat thành nitric, không khử muối sunphat, sản sinh enzyme 1.5.phospholipase, không xuất hạt màu đỏ Trang 19 2.2 Quy trình sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu Bt 2.2.1 Quy trình công nghệ sản xuất Giống Gốc Chuẩn bị môi trường Khử trùng môi trường Sản xuất giống cấp Thổi khí Sản xuất giống cấp Lên men khoảng thời gian 48-72h, pH=7, nhiệt độ 30oC Lọc ly tâm Thu sinh khối Hoàn thiện chế phẩm - Nghiền lọc bổ sung phụ gia - Sấy khơ - Đóng gói bảo quản Hình Quy trình sản xuất chế phẩm Bt 2.2.2 Thuyết minh quy trình  Giống: thường sử dụng chủng Bacillus thurgiensis, chúng phải có đặc điểm sau đây: - Có độc tính diệt sâu cao tác dụng tinh thể độc rộng thời gian tồn lâu Trang 20 - Tốc độ sinh trưởng mạnh có khả tạo nhiều tinh thể độc - Lên men nguồn cacbon khác đạt tốc độ lên men nhanh - Thích nghi tốt với điều kiện khơng thuận lợi mơi trường, đặc biệt có tác dụng gây độc côn trùng sâu hại nhanh mạnh Giống sử dụng để sản xuất Bt vi khuẩn Bacillus thurigiensis Giống nhân lên sau cấp gấp khoảng 10-15 lần giống cũ  Chuẩn bị môi trường: Môi trường thường sử dụng để nuôi cấy Bt bao gồm thành phần sau: - Nguồn cacbon tinh bột, maltose, glucose Nếu tinh bột thường dùng gạo, ngô, sắn ,….Tinh bột qua giai đoạn thủy phân tạo đường đơn đường đôi sử dụng amylase H2SO4 điều kiện nhiệt độ cao để thủy phân - Nguồn N: thường sử dụng bột cá, bột ngô, bột banh lạc, bột bánh đậu, cao thịt bị, peptone, bột men,… - Muối vơ thương bổ sung vào muối sau: K2HPO4, MgSO4,,CaCO3 Môi trường sau trộn lẫn thành phần trải qua giai đoạn dịch hóa Sau bảng số thành phần môi trường dùng nuôi cấy Bt thường dùng: Bảng : Một số môi trường thường sử dụng để nuôi cấy Bt Tên nước Thành phần môi trường Tên tác giả Mehico Rỉ đường, bột đậu tương, bột ngô, Roldan Cs, 1998 Hàn Quốc CaCO3 + nước Bột cá, đậu tương, cám đổ, bã vừng, Yoon Cs, 1987 Trung Quôc gạo, cám Cám lúa mì, chấu, bột chanh, bánh đậu Hussey, 1981 – Wang Tao, tương, loại dầu bánh hạt 1998 Nigieria Brazil loại dầu, cám lúa mì bột ngơ Bột sắn lên men, ngô, đậu đũa Ejiofar & Okager, 1989 Phụ phẩm công nghiệp giấy gỗ, Moscardi, 1988 Trang 21 thêm tinh bột tan Bột chanh bột đậu tương thêm Mummgatti Ấn Độ tinh bột tan rỉ đường Raghunathan, 1990  Khử trùng: Sau chuẩn bị môi trường xong nên khử trùng với chế độ khử trùng sau: - Khử trùng phương pháp gián đoạn: tiến hành áp suất dư 0.05-0.1Mpa với nhiệt độ từ 110-1200C vòng – 1,5 - Hoặc khử trùng liên tục: tiến hành nhiệt độ cao 140-145 thời gian ngắn 5- 15 phút  Lên men: Tiến hành nồi lên men có dung tich 500l, 1000l, 2000l , điều kiện nhiệt độ từ 27-320C điều chỉnh pH =7,5 khoảng thời gian từ 48-72h Trong trình lên men tiến hành thổi khí  Chế độ thổi khí: Đây tiêu cho trình hình thành bào tử tinh thể độc Ngưỡng thổi khí tốt q trình lên men 0,5-0,6m mơi trường/m3 khơng khí Nếu chế độ thổi khí mức thấp bào tử phát triển yếu, mật độ thưa, chế độ thổi khí mức cao bào tử phát triển nhanh thời gian lên men ngắn, tinh thể độc tố nhỏ, hiệu diệt sâu không cao, nên chế độ thổi khí hợp lý Sau lên men 48-72h ta tiến hành tách sản phẩm cách lọc ly tâm lạnh 4000 vòng/phút, thu kết tủa sau dó bổ sung thêm số chất định hình bảo quan đem sấy khô điều kiện thường chân không nhiệt độ 50-65 oC 1h, 70-80oC vòng 20 phút, độ ảm giảm xuống từ 3-5% đạt Ở bước hồn thiện sản phẩm, sản phẩm đóng gói, chế thành dạng chế phẩm khác Hiệu phịng trừ chế phẩm Bt khơng hồn tồn định thành phần hoạt tính chế phẩm mà dạng chế phẩm nhân tố quan trọng dạng chế phẩm Bt bao gồm dạng nước, dạng bột, dạng bột thấm nước, dạng nang keo Mỗi dạng chế phẩm có hiệu diệt sâu khác tùy thời điểm đối tượng diệt  Các điều kiện ảnh hưởng tới hiệu suất trình lên men Trang 22 -Ảnh hưởng nhiệt độ: nhiệt độ có ảnh hưởng tới trình hình thành bào tử Nếu nhiệt độ cao thấp kéo dài rút ngắn q trình lên men, trình lên men phải điều chỉnh nhiệt độ ( nhiệt độ thích hợp 30oC) -Các chế độ luân chuyển giống: tiêu làm ảnh hưởng tới hh nh thành bào tử tinh thể độc Nếu sử dụng giống liên tục, sảy tượng nhiễm thực khuẩn thể Cho nên, bình thường lên men khoảng 10- 15 lần giống cũ cần phải thay đổi gống Như khắc phục tượng phân đốt, tượng tạo bào tử, tinh thể độc -Ảnh hưởng độ pH: vi khuẩn Bt thích hợp mơi trường kiềm pH=7.5, điều kiện 8,5 hình thành bào tử, pH =5 khơng hình thành bào tử -Ảnh hưởng oxi: vi khuẩn loại hiếu khí, phải có đủ oxi sinh trưởng tốt, hình thành bào tử Nếu thiếu oxi khơng hình thành bào tử hình thành chậm Lượng oxi thường cung cấp cho trình lên men 0,5-0,6m mơi trường/m3 khơng khí tốt 2.3 Ưu, nhược điểm cách khắc phục thuốc trừ sâu Bt 2.3.1 Ưu điểm: Không gây ô nhiễm môi trường Bt có hiệu lực cao sâu kháng loại thuốc gốc lân, carbamat,… Tinh thể độc Bt tạo khơng thể hồ tan dịch dày người nên thuốc trừ sâu sinh học Bt hoàn tồn vơ hại người, sinh vật khác Không độc với cá, ong mật loài thiên địch Thời gian cách ly ngắn 2.3.2.Hạn chế Chỉ diệt sâu non chúng ăn lá, không diệt trứng, nhộng bướm Dễ bị phân huỷ tia cực tím có ánh mặt trời Có tác động vi độc, không nội hấp, không tiếp xúc Trang 23 Hạn chế lớn thuốc trừ sâu Bt phát tác chậm, 48 tiếng sau ăn độc tố sâu chết 2.3.3 Khắc phục Nên ý phun sớm trồng bị sâu phá hại, thích hợp sâu cịn non từ đến ngày tuổi Do sâu thường gối lứa nên sau phun 5-7 ngày, cần thiết phải phun lại lần để diệt sâu non nở Nên phun thuốc vào lúc chiều mát, lúc sâu dễ dàng trúng độc thường bò lên ăn vào ban đêm Tránh phun thuốc trời nắng gắt mưa Sau tưới phun thuốc ngày sau tưới trở lại Không sử dụng thuốc trừ sâu Bt dâu dùng nuôi tằm Cần phun ướt hai mặt mặt phận mà sâu thích ăn; thêm mật rỉ đường để tăng bám dính hiệu diệt sâu cao 2.4 Công nghệ Bt đại Theo dòng thời gian phát triển khoa học kỹ thuật, đặc biệt khoa học sinh học phân tử, Bt phát triển theo chiều hướng đại Từ năm 1996, giống trồng cấy gen Bt tổng hợp phân tử protein đặc hiệu đưa vào gieo trồng Xuất phát từ thực trạng có số loại sâu hại hại bên thân cây, hay rễ đất, vị trí loại chế phẩm truyền thống Bt diệt với hiệu cao Hình 7: Qui trình cấy gen Bt vào trồng (cây ngô Bt) Trang 24 Khi sinh học phân tử đời, nhà khoa học giới đề cập đến biện pháp cấy ghép gen điều khiển tổng hợp loại protein đặc hiệu Bt vào gen di truyền giống trồng Bằng biện pháp này, trồng tự sản sinh độc tố kháng lại sâu hại, vị trí, trồng chống chịu lại phá hoại sâu Một mặt hữu ích khác loại protein gây độc này, tồn sản sinh bên thể trồng, khơng thể bị phân huỷ tác nhân ánh sáng mặt trời hay tia tử ngoại, bị rửa trôi nước mưa nước tưới cho Chính nhiều lồi trồng Bt đưa vào sử dụng Ngô, Lúa, hay Bông hay khoai tây, cà chua… số giống trồng khác Trang 25 KẾT LUẬN Hiện với xu phát triển bền vững vừa tạo suất hiệu cao vừa đảm bảo an tồn mơi trường, sản phẩm cơng nghệ ln ưu tiên phát triển Sản phẩm thuốc trừ sâu vi sinh đáp ứng yêu cầu trên, xem giải pháp cho phát triển bền vững Hơn Việt Nam có tiềm lớn nguồn tác nhân sinh học phòng trừ sinh học sâu hại ngồi thiên nhiên Chính việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật hướng đắn cho phất triển nông nghiệp Việt Nam bảo vệ môi trường Điều giúp làm giảm giá thành sản phẩm, để ứng dụng rộng rãi nhằm bảo vệ sức khỏe cho nhân dân, tăng thu nhập cho nông dân kinh tế hội nhập cải thiện chất lượng môi trường Trang 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO Sản xuất sử dụng chế phẩm sinh học nông nghiệp -Lương Đức Phẩm Phạm Văn Ty-Vũ Nguyên Thành, 2007.Công nghệ vi sinh môi trường NXB giáo dục http://vi.wikipedia.org/wiki/Bacillus_thuringiensis http://www.bergfiles.com/i/bf1a2bcec7h32i0 http://kiemtailieu.com/nong-lam-ngu/tai-lieu/bao-cao-chuyen-de-thuoc-tru-sau-vi-sinhbt/1.html www.khoahoc.com.vn/doisong/ung dung/9160_Dung www.landesbioscience.com/curie/chapter/4301 commons.wikimedia.org/wiki/File:Bacillus_thur http://creationwiki.org/Bacillus_thuringiensis 10 www.bio.ic.ac.uk/ /images/gif/fig2.gif 11 www.sipweb.org/Bacteria/toxin.gif Trang 27 ... khác Thuốc trừ sâu vi sinh Bt (Bacciluss thuringiensis) thuộc nhóm trừ sâu sinh học, có nguồn gốc vi khuẩn, phổ tác dụng diệt sâu rộng hữu hiệu lọai sâu sâu lá, sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu. .. thuốc trừ sâu sinh học phổ biến thị trường 1.6.1 Các lọai thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc vi khuẩn Chế phẩm Bt (Bacciluss thuringiensis) Ở Vi? ??t Nam, chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) ... từ vi khuẩn thị trường Trang 11 CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC 2.1 Chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học sản xuất từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis 2.1.1 Sơ lược chế phẩm Bt