Đang tải... (xem toàn văn)
luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm: nghiên cứu vai trò của một số polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm: nghiên cứu vai trò của một số polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm: nghiên cứu vai trò của một số polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm: nghiên cứu vai trò của một số polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro
MỤC LỤC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. DƯƠNG TẤN NHỰT 2. PGS. TS. BÙI VĂN LỆ Học viên thực hiện: VŨ THỊ THỦY MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình và đồ thị Mở đầu 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SƠ LƯỢC VỀ PHÔI VÔ TÍNH 3 1.1.1. Quá trình phát sinh phôi ở thực vật 3 1.1.2. Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng 4 1.1.3. Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính 8 1.1.4. Trạng thái của các tế bào phát sinh phôi vô tính 9 1.1.5. Sự phát sinh phôi vô tính 11 1.1.6. Ứng dụng của quá trình tạo phôi vô tính 13 1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH 13 1.2.1. Chất điều hòa sinh trưởng 13 1.2.2. Nguồn Nitơ 15 1.2.3. Ánh sáng 16 1.2.4. Đường 16 1.2.5. Độ pH 17 1.3. VAI TRÒ CỦA POLYAMINE 17 1.3.1. Giới thiệu 17 1.3.2. Con đường trao đổi chất của Polyamine 18 1.3.2.1. Sinh tổng hợp Polyamine 18 1.3.2.2. Sự vận chuyển Polyamine 21 1.3.2.3. Sự tiếp hợp Polyamine 22 1.3.2.4. Polyamine trong tương tác với các con đường sinh tổng hợp khác 22 1.3.2.5. Các chất ức chế sinh tổng hợp Polyamine 22 1.3.3. Polyamine đóng vai trò là chất điều hòa sinh trưởng 23 1.4. SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) 25 1.4.1. Phân loại và đặc điểm hình thái 25 1.4.1.1. Phân loại 25 1.4.1.2. Đặc điểm hình thái 25 1.4.2. Phân bố 26 1.4.3. Thành phần hóa học 26 1.4.3.1. Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) 26 1.4.3.2. Phần trên mặt đất (thân và lá) 28 1.4.3.3. Các thành phần khác 28 1.4.4. Các tác dụng của sâm Ngọc Linh 28 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 30 2.1.1. Nguồn mẫu 30 2.1.2. Môi trường nuôi cấy 30 2.1.3. Điều kiện thí nghiệm 30 2.1.4. Địa điểm thực hiện đề tài 30 2.2. PHƯƠNG PHÁP 31 2.2.1. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang 31 2.2.2. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét 31 2.2.3. Thu thập mẫu và phân tích Polyamine nội sinh 32 2.2.4. Bố trí thí nghiệm 32 2.2.4.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu cấy khác nhau của cây sâm Ngọc Linh 32 2.2.4.2. Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau lên sự hình thành mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 33 2.2.4.3. Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 33 2.2.4.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy và điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 34 2.2.4.5. Thí nghiệm 5. Khảo sát ảnh hưởng của một số tiền chất sinh tổng hợp Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 35 2.2.4.6. Thí nghiệm 6. Khảo sát ảnh hưởng của một số Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 35 2.2.5. Xử lý số liệu 35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU LÊN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO CÓ KHẢ NĂNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH SÂM NGỌC LINH 36 3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MÔI TRƯỜNG KHOÁNG LÊN KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH 38 3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ 2,4-D KẾT HỢP VỚI 0,5 mg/l NAA VÀ 0,2 mg/l KIN LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH 41 3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH 44 3.4.1. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (đặc, lỏng tĩnh, lỏng lắc) lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 44 3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 46 3.5. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ TIỀN CHẤT SINH TỔNG HỢP POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH 49 3.5.1. Ảnh hưởng của Arginine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 49 3.5.2. Ảnh hưởng của Ornithine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 50 3.6. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THUỘC NHÓM POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH 52 3.6.1. Ảnh hưởng của Putrescine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 52 3.6.2. Ảnh hưởng của Spermidine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 55 3.6.3 Ảnh hưởng của Spermine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 57 3.7. PHÂN TÍCH POLYAMINE NỘI SINH 60 3.8. GIẢI PHẪU CÁC DẠNG HÌNH THÁI PHÔI KHÁC NHAU CỦA SÂM NGỌC LINH 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 65 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ½MS : Môi trường MS với thành phần khoáng đa lượng giảm ½, vi lượng giữ nguyên ½SH : Môi trường SH với thành phần khoáng đa lượng giảm ½, vi lượng giữ nguyên 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid ABA : Absisic acid ACC : 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid ACD : Arginine decarboxylase Arg : Arginine ATP : Adenosine-5’-triphosphate BAP : 6-benzylaminopurine CH : Casein EC : Các cụm phát triển phôi (Embryogenic cluster) G- : Ginsenoside GA 3 : Gibberellic acid G-Rb 1 : Ginsenoside-Rb 1 G-Rg 1 : Ginsenoside-Rg 1 IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid Kin : Kinetin LDC : Udecarboxylase MR 2 : Majonoside-R 2 MS : Môi trường Murashige và Skoog, 1962 MS½ : Môi trường MS với thành phần khoáng đa lượng và vi lượng giảm ½ NAA : Acid -naphtaleneacetic ODC : Ornithine decarboxylase Orn : Ornithine PA : Polyamine PEM : Cụm tiền phôi (Pre-embryo mass) pkl : Gene pickle (Một dạng đột biến gene ở cây Arabidopsis) Put : Putrescine SAM : S-adenosylmethionine SERK : Somatic embryogenesis receptor-like kinase SH : Môi trường Schenk and Hildebrandt, 1972 SH½ : Môi trường SH với thành phần khoáng đa lượng và vi lượng giảm ½ Spd : Spermidine Spm : Spermine TDZ : Thidiazuron DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1. Khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu khác nhau của sâm Ngọc Linh 36 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên khả năng hình thành mô sẹo xốp từ lá sâm Ngọc Linh 39 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,5; 2 mg/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 42 Bảng 3.4.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 45 Bảng 3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 47 Bảng 3.5.1. Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 49 Bảng 3.5.2. Ảnh hưởng của Orn lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 51 Bảng 3.6.1. Ảnh hưởng của Put lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 53 Bảng 3.6.2. Ảnh hưởng của Spd lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 56 Bảng 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 57 DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Các dạng phát sinh phôi ở thực vật 3 Hình 1.2. Mô hình giả thuyết các sự kiện xảy ra trong quá trình phát sinh phôi vô tính 7 Hình 1.3. Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển của phôi 9 Hình 1.4. Trao đổi chất PA và tương tác với các con đường trao đổi chất khác 19 Hình 1.5. Cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 25 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu lên khả năng hình thành mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 37 Hình 3.2. Ảnh hưởng của các môi trường khoáng lên khả năng hình thành mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 41 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 44 Hình 3.4.1. Mô sẹo và phôi trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc, lỏng tĩnh và đặc. 46 Hình 3.4.2. Mô sẹo trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày và tối hoàn toàn 48 Hình 3.5.1. Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 50 Hình 3.5.2. Ảnh hưởng của Orn lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 52 Hình 3.6.1. Ảnh hưởng của Put lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 54 Hình 3.6.2. Ảnh hưởng của Spd lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 56 Hình 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 58 Hình 3.6.4. Một số cây con tái sinh từ mô sẹo xốp trên môi trường ĐC, Spd, Put và Spm. 58 Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi hàm lượng PA ở các giai đoạn phát triển cụm mô phôi ở sâm Ngọc Linh trên môi trường ĐC và môi trường bổ sung Spd 61 Hình 3.7. Sự thay đổi hình thái và cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh 64 [...]... hòa sinh trưởng, điều kiện nuôi cấy và điều kiện chiếu sáng được đánh giá trước khi nghiên cứu vai trò của các Polyamine cũng như tiền chất của chúng lên sự hình thành và tần suất phát sinh phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh in vitro Đồng thời, nồng độ Polyamine nội sinh cũng được tiến thành phân tích để những kết luận trở nên thuyết phục, có giá trị hơn và mở đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về Polyamine. .. 1997] cũng như các giai đoạn hình thành cây hoàn chỉnh ở thực vật đã được chứng minh [Kevers et al., 2000] song cơ chế tác động vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng Trong nỗ lực bảo tồn và nhân giống cây sâm Ngọc Linh, chúng tôi đã tiến hành Nghiên cứu vai trò của một số Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro Ảnh hưởng nguồn mẫu,... phát sinh phôi diễn ra trước khi mẫu cấy được cấy chuyền sang môi trường không có 2,4-D 1.1.5 Sự phát sinh phôi vô tính Sự phát sinh phôi vô tính được định nghĩa là một quá trình mà trong đó cấu trúc lưỡng cực giống phôi hữu tính phát triển từ một tế bào sinh dưỡng và không có liên kết mao mạch với tế bào gốc ban đầu Sự phát sinh phôi vô tính xảy ra thông qua một số giai đoạn tương tự như phôi hữu tính. .. vào sử dụng như auxin ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi trong tế bào sinh dưỡng cà rốt Sự thay đổi trong trao đổi PA ở giai đoạn phát sinh phôi sinh dưỡng được nghiên cứu trong nhiều hệ thống khác nhau ở thực vật Đây là một hướng đi quan trọng trong sự tái sinh cây trồng và là hệ thống hiện đại, tiềm năng để nghiên cứu các sự kiện sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái in vitro [Yadav và Rajam,... của Put và Spd ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi Mối quan hệ không có mặt giữa hàm lượng PA tự do, hoạt động của enzyme để sinh tổng hợp và cấp độ biểu hiện gene ở giai đoạn sau của sự phát sinh phôi và tái sinh cây có thể mang lại kết quả hệ thống điều hòa tế bào Nghiên cứu gần đây chỉ ra vai trò quan trọng của PA ngoại sinh trong quá trình phát triển in vitro như quá trình phát sinh phôi vô tính. .. thức phát sinh phôi ở thực vật được tóm lược trên Hình 1.1 1.1.2 Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng Theo Moltrasio và cộng sự (2004) thì khả năng phát sinh phôi vô tính được biểu hiện trước hết là ở mức kiểu gene và điều này có thể được chứng minh dễ dàng bằng cách chuyển khả năng phát sinh phôi từ kiểu gene có khả năng phát sinh phôi sang kiểu gene ngăn cản sự phát sinh phôi thông... bào phát sinh đỉnh hoặc noãn, nhưng cũng có một số lượng lớn tế bào sinh dưỡng thực vật có thể trải qua quá trình phát triển phôi dưới những điều kiện thích hợp Ví dụ, sự hình thành phôi (có vai trò như lá mầm sinh dưỡng) cũng có thể xảy ra trên mép lá của cây sống đời Kalanchoe, cây Malaxis paludosa [Taylor, 1967] Có nhiều thí nghiệm phát sinh phôi được bắt đầu từ nuôi cấy in vitro các tế bào sinh dưỡng... này Đối với một số loài thực vật, những auxin khác lại sử dụng hiệu quả hơn 2,4-D, như trong trường hợp của cây bí ngô, NAA và IBA được dùng cho phát sinh phôi Trong nuôi cấy phôi tâm cây Vitus, sự hình thành phôi xảy ra khi có mặt của NAA và BAP [Mullin và Schlegel, 1976] Các mô sẹo của phôi tâm cây Citrus sinensis thuộc họ Cam chanh yêu cầu có IAA và Kin cho sinh trưởng và biệt hóa phôi Sự cấy chuyền... trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy mô sẹo phát sinh phôi [Hecht et al., 2001] Có ý kiến cho rằng protein SERK đơn thuần chỉ là một marker phát sinh hình thái tổng quát chứ không hẳn là một marker phát sinh phôi 1.1.3 Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính Có nhiều hệ thống nuôi cấy mô sử dụng 2,4-D như là một chất cảm ứng có hiệu quả trong quá trình phát sinh phôi vô tính Hiện nay, thừa nhận quan điểm... trưởng thành của phôi nhằm tăng hiệu quả phát triển phôi lại gây ra những ảnh hưởng xấu đến chất lượng phôi, từ đó làm giảm khả năng nảy mầm và tăng trưởng ex vitro của thực vật từ phôi vô tính Do vậy, tăng trưởng ex vitro của thực vật chịu ảnh hưởng của toàn bộ quá trình nuôi cấy và biện pháp xử lý trong giai đoạn in vitro Tóm lại, có thể tóm tắt sự tái sinh thực vật thông qua con đường phát sinh phôi vô . CỦA POLYAMINE 17 1.3.1. Giới thiệu 17 1.3.2. Con đường trao đổi chất của Polyamine 18 1.3.2.1. Sinh tổng hợp Polyamine 18 1.3.2.2. Sự vận chuyển Polyamine 21 1.3.2.3. Sự tiếp hợp Polyamine. tiếp hợp Polyamine 22 1.3.2.4. Polyamine trong tương tác với các con đường sinh tổng hợp khác 22 1.3.2.5. Các chất ức chế sinh tổng hợp Polyamine 22 1.3.3. Polyamine đóng vai trò là chất. mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 34 2.2.4.5. Thí nghiệm 5. Khảo sát ảnh hưởng của một số tiền chất sinh tổng hợp Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 35 2.2.4.6. Thí