tóm tắt luận án tiến sĩ Nghiên cứu sàng lọc gene mã hoá enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics

27 607 1
tóm tắt luận án tiến sĩ Nghiên cứu sàng lọc gene mã hoá enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC GENE MÃ HÓA ENZYME THAM GIA THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI SINH VẬT TRONG RUỘT MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 TÓM TẮT DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2014 2 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Trƣơng Nam Hải 2. TS. Đỗ Thị Huyền Phản biện: 1. 2. 3. Dự thảo luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Hà Nội - Trung tâm thông tin – Thƣ viện, Đại học quốc gia Hà Nội 3 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cellulase là nhóm enzyme đƣợc sử dụng phổ biến trong các ngành công nghiệp nhƣ chế biến thực phẩm, chế biến thức ăn, sản xuất giấy, sản xuất rƣợu, sản xuất bia, công nghệ dệt…. Đặc biệt, cellulase đang đƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học nhƣ cồn sinh học từ nguồn phế phẩm lignocellulose dồi dào thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch đang trên đà cạn kiệt. Trong vòng 25 năm qua, sản lƣợng cồn sinh học đã tăng trƣởng và đạt mức nhảy vọt kể từ năm 2000. Cồn sinh học có thể đƣợc dùng nhƣ nguồn nhiên liệu độc lập cho các loại xe có động cơ chuyên biệt hoặc làm phụ gia nhiên liệu cho loại xe có động cơ truyền thống với tỉ lệ lên đến 30%. Ở nƣớc ta, ƣớc tính hàng năm, nguồn nguyên liệu lignocellulose từ phế phẩm nông nghiệp nhƣ rơm, rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến 50 triệu tấn. Các biện pháp xử lý nguồn phế phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hƣởng tiêu cực đến môi trƣờng sống và sức khoẻ con ngƣời. Việc tận dụng đƣợc nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm này vào sản xuất cồn sinh học sẽ đem đến nhiều lợi ích to lớn cho môi trƣờng cũng nhƣ cho nền kinh tế của nƣớc ta. Việc sử dụng cellulase thay thế các hoá chất truyền thống nhƣ acid, kiềm và nhiệt độ cao vào trong quá trình sản xuất của các ngành công nghiệp đã giải quyết đƣợc nhiều vấn đề nhƣ hạn chế ô nhiễm môi trƣờng và bảo vệ đƣợc sức khoẻ ngƣời lao động cũng nhƣ tăng hiệu quả sản xuất. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là cần thiết phải có đƣợc nguồn cellulase hoạt động ở điều kiện pH và nhiệt độ thích hợp cho các quá trình sản xuất đó. Hơn nữa, việc sản xuất cồn sinh học đang gặp một số khó khăn trong việc giảm chi phí sản xuất đặc biệt là nguồn cellulase để phân cắt cellulose thành glucose hiệu quả. Do đó, vấn đề quan trọng nhất là tìm ra đƣợc nguồn cellulase mới phù hợp với điều kiện sản xuất của các ngành công nghiệp liên quan, phát triển các phức hợp cellulase hiệu quả và ổn định để khắc phục khó khăn trong quá trình sản xuất. Metagenomics là kỹ thuật cho phép thu nhận trực tiếp DNA đa hệ gene của toàn bộ các vi sinh vật trong môi trƣờng sống nhất định. Chính vì lợi thế là thu nhận và phân tích đƣợc tất cả hệ gene của vi sinh vật phong phú và đa dạng, đặc biết là 99% vi sinh vật không nuôi cấy đƣợc mà Metagenomics trở thành công cụ giúp các nhà nghiên cứu khai thác nguồn gene mới hiệu quả nhất. Thực tế đã chứng minh, sau 20 năm phát triển, đặc biệt là khoảng 5 năm gần đây, khi kỹ thuật giải mã gene thế hệ mới đƣợc áp dụng, Metagenomics đã đƣợc sử dụng rất hiệu quả để tìm hiểu sự đa dạng vi sinh vật cũng nhƣ 4 khai thác các gene mới từ nhiều môi trƣờng sống khác nhau nhƣ nƣớc, đất, các đƣờng tiêu hóa, phế thải, … Mối đóng một vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái bởi khả năng phân hủy sinh khối lignocellulose và góp phần vào chu trình carbon. Khả năng phân hủy hiệu quả lignocellulose của mối là kết quả hoạt động tổng hợp của các enzyme cellulase và hemicellulase đƣợc tiết ra từ bản thân mối và từ vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột mối. Trong đó, hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa hiệu quả nguồn thức ăn lignocellulose của mối. Vì vậy, ruột mối là một nguồn gene cellulase phong phú cần đƣợc khai thác nhằm tìm ra các enzyme mới liên quan đến sự phân hủy cellulose. Ở Việt Nam cho đến nay đã tìm thấy hơn 100 loài mối khác nhau. Tuy nhiên, hệ vi sinh vật của các loài mối ở Việt Nam vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu vì thế toàn bộ hệ enzyme thủy phân lignocellulose có nguồn gốc từ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối cũng chƣa đƣợc điều tra và khảo sát. Với đặc điểm đặc trƣng của quần xã vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột mối và vai trò của chúng giúp vật chủ phân hủy thức ăn, quần xã vi sinh vật ở mối bậc thấp đƣợc xem là nguồn khai thác gene cellulase mới lý tƣởng sử dụng trong quá trình thủy phân cellusose. Do đó, để nghiên cứu hệ vi sinh vật ruột mối và khai thác gene mới mã hóa cellulase từ hệ vi sinh vật tƣơng ứng sống cộng sinh trong ruột hiệu quả, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu sàng lọc gene mã hoá enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics”. 2. Mục tiêu của đề tài 1. Đánh giá đƣợc sự đa dạng vi sinh vật ruột mối và đa dạng gene mã hoá cellulase của chúng. 2. Phân lập, tách dòng và biểu hiện đƣợc một gene mã hoá cellulase từ DNA đa gene vi sinh vật ruột mối. 3. Xác định đƣợc ảnh hƣởng của một số điều kiện đến hoạt động của protein do gene tách dòng đƣợc mã hoá. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc tiến hành trên đối tƣợng là vi sinh vật ruột mối thợ Coptotermes thu thập ở miền Bắc Việt Nam. 4. Nội dung nghiên cứu 1. Xác định đối tƣợng để tách lấy DNA đa hệ gen của vi sinh vật và định danh đối tƣợng. 5 2. Xây dựng phƣơng pháp để tách chiết và tinh sạch DNA đa hệ gene. 3. Giải trình tự và xử lý trình tự DNA đa hệ gene. 4. Dự đoán gene theo hai khía cạnh là đa dạng vi sinh vật và đa dạng gene từ bộ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gene. 5. Chọn một trình tự gene để thiết mồi, phân lập, tách dòng và biểu hiện. 6. Xác định đặc điểm của sản phẩm biểu hiện gene phân lập đƣợc. 1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học 1. Đã định loại đƣợc một loài mối bậc thấp Coptotermes gestroi thu thập ở sáu địa điểm tại Hà Nội và Hƣng Yên bằng phƣơng pháp phân tử. 2. Đã đánh giá đƣợc sự đa dạng vi sinh vật và đa đạng gene cellulase của vi khuẩn sống trong ruột mối C. gestroi. Ý nghĩa thực tiễn 3. Đã phân lập, tách dòng và biểu hiện đƣợc một gene mã hoá endoglucanase. Đây là enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp. 4. Đóng góp mới của đề tài 1. Đây là nghiên cứu đầu tiên về sự đa dạng vi sinh vật ruột mối bậc thấp C. gestroi cũng nhƣ đa dạng gen cellulase của chúng. 2. Trình tự của gen đã phân lập, tách dòng và biểu hiện đƣợc có độ sai khác so với trình tự gene tƣơng ứng của các cơ sở dữ liệu. 5. Bố cục của luận án Luận án gồm 151 trang bao gồm: phần mở đầu 3 trang; chƣơng 1: tổng quan tài liệu 37 trang; chƣơng 2: đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 22 trang; chƣơng 3: kết quả và thảo luận 58 trang; kết luận và kiến nghị 2 trang. Các công trình khoa học của tác giả 1 trang. Tài liệu tham khảo 19 trang. Trong luận án có 19 bảng và 62 hình. Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIGNOCELLULOSE Nêu đại cƣơng về đặc điểm cấu trúc chung của ba thành phần chính cấu tạo nên lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin. 1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CELLULASE Nêu tổng quan về cơ chế hoạt động của cellulase và sự thủy phân cellulose. Cấu trúc của cellulase. 6 1.3. CELLULASE CỦA VI KHUẨN Nêu tổng quan về các họ cellulase, đặc biệt các loài vi khuẩn và vi khuẩn cổ tạo ra cellulase. Đồng thời đặc điểm về nhiệt độ, pH và kích thƣớc cellulase của các vi khuẩn đƣợc đƣa ra cụ thể. Ngoài ra, phần này còn nêu một số ứng dụng nổi bật của cellulase. 1.4. MỐI VÀ HỆ VI SINH VẬT RUỘT MỐI LIÊN QUAN ĐẾN SỰ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE Sơ lƣợc về mối và đa dạng mối ở Việt Nam. Nêu tổng quan hệ vi sinh vật trong ruột mối bậc thấp và sự tiêu hóa lignocellulose của mối. Khái quát tính hình nghiên cứu gene mã hóa cellulase của sinh vật trong đƣờng ruột mối bậc thấp 1.5. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METAGENOMICS Nếu khái quát: phƣơng pháp tiếp cận tìm gene mới bằng Metagenomics, các nghiên cứu phân lập gene từ thƣ viện DNA đa hệ gene và hơn phƣơng pháp khai thác và phân lập gene từ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gene. Nêu rõ phƣơng pháp giải trình tự của một số hệ thống máy thế hệ mới. Đặc biệt, đƣa ra các nghiên cứu ứng dụng của Metagenomics trong khai thác gene mới và đánh giá sự đa dạng vi sinh vật. Ngoài ra tiềm năng ứng dụng của Metagenomics cũng đƣợc đề cập. Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIỆT BỊ MÁY MÓC Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng đối tượng là vi sinh vật ruột mối thuộc chi Coptotermes do Viện Sinh thái và Bảo vệ công trình cung cấp; các chủng vi sinh vật dùng làm thể nhận trong thí nghiệm tách dòng gene và làm thể nhận biểu hiện gene; plasmid sử dụng để tách dòng và biểu hiện gene; các cặp mồi PCR. Các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đƣợc đặt mua từ các công ty đạt tiêu chuẩn quốc tế nhƣ Bio-Lab (Mỹ), Fermentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Các phƣơng pháp vi sinh 2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số của mối 2.2.2.2. Phƣơng pháp thu nhận vi sinh vật ruột mối và tách chiết DNA đa hệ gene của chúng 2.2.2.3. Tinh sạch DNA đa hệ gene bằng phƣơng pháp máng đơn (troughing) 2.2.2.4. Giải trình tự DNA đa hệ gene hiệu năng cao bằng máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq2000 của Illumina 7 2.2.2.5. Phƣơng pháp biến nạp bằng sốc nhiệt DNA plasmid vào vi khuẩn E. coli 2.2.2.6. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli 2.2.2.7. Phƣơng pháp cắt và ghép nối gene 2.2.2.8. Phƣơng pháp tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel Extraction kit 2.2.2.9. Kỹ thuật PCR 2.2.2.10. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gene egc 2.2.2.11. Điện di DNA trên gel agarose 2.2.2.12. Phƣơng pháp biểu hiện gene 2.2.2.13. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide-SDS 2.2.2.14. Điện di protein trên gel polyacrylamide không SDS 2.2.3. Các phƣơng pháp hóa sinh protein 2.2.3.1. Phƣơng pháp tinh sạch protein bằng sắc kí ái lực his-tag 2.2.3.2. Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford 2.2.3.3. Định lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp DNS 2.2.3.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính endoglucanase 2.2.3.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính β-glucosidase và β-xylosidase 2.2.3.6. Xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH, các ion kim loại và một số hóa chất lên hoạt tính endoglucanase 2.2.3.7. Xác định độ bền của enzyme 2.2.4. Các phƣơng pháp tin sinh học và xử lý số liệu bằng phần mềm sinh học 2.2.4.1. Phân tích trình tự DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối 2.2.4.2. So sánh trình tự ORF của dữ liệu DNA đa hệ gene với CSDL của NCBI 2.2.4.3. Thiết kế mồi bằng phần mềm FastPCR 2.2.4.4. Kiểm tra vị trí của các enzyme hạn chế trên gene quan tâm bằng phần mềm trực tuyến RestrictionMapper 2.2.4.5. Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự amino acid bằng chƣơng trình dịch mã ExPASy 2.2.4.6. Xây dựng cây chủng loài của loài mối nghiên cứu với các loài mối khác bằng phần mềm Genedoc và MEGA5 2.2.4.7. Dự đoán cấu trúc của EGC bằng phần mềm Phyre2 2.2.4.8. Xác định độ tinh sạch của protein EGC tinh sạch đƣợc bằng phần mềm Quantity One Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THU THẬP MỐI 3.1.1. Thu thập mối Từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2012, sáu tổ mối đƣợc thu thập ở sáu địa điểm khác nhau. Các tổ mối thu đƣợc ghi rõ địa điểm, sắp xếp vào các hộp đựng mẫu. Năm địa điểm 8 thu đƣợc mối tại Hà Nội là Văn Quán, Hà Đông; Tản Lĩnh, Ba Vì; Bùi Xƣờng Trạch, Đống Đa; Thái Hà, Đống Đa; Võng Thị, Tây Hồ và một địa điểm tại tỉnh Văn Lâm, Hƣng Yên. Trong tổ thu đƣợc có hai đẳng cấp là mối lính và mối thợ. Mối lính thực hiện chức năng bảo vệ. Còn mối thợ thực hiện chức năng tìm kiếm và dự trữ thức ăn. Chính vì mối thợ có vai trò then chốt trong tìm kiếm và tiêu hoá thức ăn, dó đó chúng là đối tƣợng quan trọng đƣợc lựa chọn để tách lấy vi sinh vật đƣờng ruột. Mối của sáu tổ đều ăn gỗ và có hình dạng bên ngoài giống nhau. Dựa vào hình thái, rất ngẫu nhiên, cả sáu mẫu mối đƣợc các nhà nghiên cứu thuộc Viện Sinh thái và Bảo vệ công trình đã định loại ở bậc giống đều là Coptotermes. 3.1.2. Kết quả định loài mối nghiên cứu bằng phƣơng pháp phân tử 3.1.2.1. Tách DNA tổng số của mối Để xác định loài mối bằng phƣơng pháp phân tử, trƣớc hết, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của mối. DNA tổng số mối của cả sáu mẫu thu thập ở sáu địa điểm tách chiết đƣợc đều nguyên vẹn và có kích thƣớc lớn hơn 10 kb. Mẫu DNA này sẽ đƣợc sử dụng trực tiếp làm khuôn để khuếch đại đoạn gene ARN ribosome16S (rARN 16S) ti thể. 3.1.2.2. PCR khuếch đại đoạn DNA của gene ARN ribosome 16S ti thể mối Hình 3.1. Điện di đồ hỗn hợp sản phẩm PCR khuếch đại các đoạn gene mã hóa rARN 16S ti thể mối bằng hai cặp mồi LR-J-13007, LR-N-13398 và FST-F, FST-R từ khuôn DNA tổng số của mối Coptotermes trên gel agarose 1,7%. ĐC M: Thang chuẩn 100 bp (Fermentas); các ĐC TH, VT, BXT, VL, VQ và TL tương ứng là sản phẩm PCR từ khuôn là DNA hệ gene mối thu thập ở Thái Hà, Võng Thị, Bùi Xương Trạch, Văn Lâm, Văn Quán và Tản Lĩnh. Hai cặp mồi gồm cặp thứ nhất là LR-J-13007, LR-N-13398 và cặp thứ hai là FST- F, FST-R đƣợc sử dụng để khuếch đại hai đoạn DNA của gene mã hóa RNA ribosome ti thể mối. Kết quả là ở 54 o C, cặp mồi thứ nhất đã khuếch đại hiệu quả đoạn DNA duy nhất đậm nét, kích thƣớc lớn hơn 400 bp và bé hơn 500 bp từ DNA tổng số của cả sáu mẫu mối. bp TH VT BXT VL M VQ TL 400 100 Sản phẩm PCR của cặp mồi thứ nhất Sản phẩm PCR của cặp mồi thứ hai 1000 500 9 Tuy nhiên, chỉ ở 57 o C, cặp mồi thứ hai mới khuếch đại đƣợc một băng DNA duy nhất kích thƣớc lớn hơn 100 bp từ hai mẫu khuôn DNA tổng số thu thập ở Văn Quán và Tản Lĩnh, còn bốn mẫu DNA còn lại không có đoạn DNA nào đƣợc khuếch đại (Hình 3.1). Tất cả các đoạn DNA khuếch đại đƣợc đều đƣợc đọc và phân tích trình tự nucleotide. 3.1.2.3. Phân tích sản phẩm PCR Phân tích trình tự nucleotide đoạn DNA được khuếch đại bằng cặp mồi thứ nhất Trình tự nucleotide của sáu đoạn DNA khuếch đại bằng cặp mồi thứ nhất đƣợc sắp xếp và so sánh với nhau đã thể hiện rằng tất cả các trình tự đều tƣơng đồng với nhau trong vùng 430 bp và không có sự khác nhau giữa ba mẫu mối thu thập ở Võng Thị, Văn Lâm và Bùi Xƣơng Trạch. Tuy nhiên, giữa hai mẫu mối Văn Quán và Thái Hà khác với các nhóm khác từ 0,5-0,9%; mẫu mối Tản Lĩnh khác với các mẫu mối khác từ 0,5-1,5% (Bảng 3.1). Đồng thời, mức độ tƣơng đồng trình tự nucleotide của sáu đoạn DNA trên cũng đƣợc so sánh với các trình tự tƣơng ứng của NCBI bằng BlastN. Kết quả cho thấy có sự giống nhau rất cao (97-99%) giữa sáu trình tự nghiên cứu với các trình tự tƣơng ứng của C. gestroi (Bảng 3.2). Để xác định rõ hơn mỗi quan hệ giữa mối Coptotermes nghiên cứu và các loài thuộc giống này, cây phát sinh loài đƣợc thiết lập bằng phần mềm MEGA5 (Hình 3.2) dựa vào trình tự vùng 430 bp cùng với 21 trình tự (giống từ 92-99%) của gene tƣơng ứng mã hoá rARN 16S của các loài mối thuộc giống Coptotermes. Kết quả cho thấy tất cả sáu mẫu mối thu tại sáu địa điểm nằm hoàn toàn trong nhánh tiến hóa của C. gestroi. Phân tích trình tự nucelotide đoạn DNA được khuếch đại bằng cặp mồi thứ hai Hai trình tự nghiên cứu chỉ khác nhau 1 nucleotide duy nhất. Kết quả so sánh mức giống nhau của hai trình tự nghiên cứu với các trình tự tƣơng ứng của NCBI bằng Blastn cho thấy, mức giống nhau thể hiện cao nhất (99-100%) đối với các trình tự của Coptotermes gestroi. (Bảng 3.3). Đồng thời, các trình tự tƣơng ứng trên ngân hàng gene có mức giống nhau từ 95-100 % so với hai trình tự nghiên cứu và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA5 thể hiện mỗi quan hệ giữa hai mẫu mối nghiên cứu và các loài mối thuộc giống Coptotermes. Giống với kết quả phân tích trình tự đoạn 430 bp, cây phát sinh loài cũng cho thấy hai mẫu mối nghiên cứu nằm hoàn toàn trong nhánh tiến hóa của C. gestroi. Nhƣ vậy, những kết quả phân tích trên đã chứng minh đầy đủ và chắc chắn rằng, ở mức độ phân tử, sáu mẫu mối nghiên cứu thu thập ở sáu địa điểm đều thuộc loài Coptotermes gestroi. 10 Hình 3.2. Cây phát sinh loài giữa loài mối nghiên cứu và 21 loài khác được xây dựng dựa trên các trình tự có mức độ giống cao nhất với đoạn DNA kích thước 430 bp được khuếch lại bằng cặp mồi LR-J-13007 và LR-N-13398. Bảng 3.1. Tỷ lệ giống nhau và khác nhau về trình tự nucleotide giữa các vùng 430 bp gene rARN ti thể mối Coptotermes thu thập từ 6 địa điểm. Tỷ lệ giống nhau (%) BXT VQ VL TL TH VT BXT 99,1 100 99,5 99,5 100 VQ 4 99,1 98,5 99,5 99,1 VL 0 4 99,5 99,5 100 TL 2 6 2 99,1 99,5 TH 2 2 2 4 99,5 VT 0 4 0 2 2 Số nucleotide khác nhau CTanLinhVN CVongThiVN CHungYenVN CBuiXuongTrachVN CgestEF092285SG CgestDQ004478SG CgestDQ004480SG CgestDQ915942SG CThaiHaVN CVanQuanVN CgestDQ004481MY CgestDQ004487AU CgestEF156760US CgestAY558905AG CgestAY558906TC CcarvAY558909MY CkalsAY683211MY ClactAY558912AU CformAB626146JP CformU17778US CformAB626145JP CformAY558911CN CformDQ007344US CformGU075666CN CinteAY558904TG CcrasAY558901BZ CvastAY558898US 97 65 31 54 100 68 44 43 55 68 70 92 67 39 61 64 62 40 0.005 C. formosanus C. gestroi C. carvinatus C. kalshoveni C. lacteus C. intermedius C. crassus C. vastator [...]... 1 kb DNA đa hệ gen 10 Hình 3.3 Điện di đồ DNA đa hệ gene của hệ vi sinh vật ruột mối Coptotermes gestroi trên gel agarose 0,8% ĐC M: Thang chuẩn 1 kb (Fermentas); ĐC 1: DNA đa hệ gene được tinh chế bằng phương pháp Máng đơn Để có đủ lƣợng DNA cần thiết cho vi c nghiên cứu, chúng tôi đã tách chiết DNA đa hệ gene vi sinh vật từ khoảng 1.000.000 ruột mối thợ Coptotermes gestroi của sáu mẫu mối thu thập... Bùi Xương Trạch; VQ: Văn Quán; VL: Văn Lâm; TL: Tản Lĩnh; TH: Thái Hà; VT: Võng Thị) 3.2 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DNA ĐA HỆ GENE VI SINH VẬT SỐNG TRONG RUỘT MỐI Toàn bộ ruột mối thợ gồm ruột trƣớc, ruột giữa và ruột sau đều đƣợc tách lấy Sau đó, DNA đa hệ gene của hệ vi sinh vật ruột mối đƣợc tách lấy và tinh sạch Kết quả cho thấy sản phẩm tinh chế chỉ còn một băng DNA đa hệ gene duy nhất đậm nét có kích... vi khu n chiếm ưu thế nhất trong ruột mối Coptotermes gestroi ORF được chú thích dựa vào CSDL NR 3.4 GENE MÃ HOÁ ENZYME THUỶ PHÂN CELLULOSE CỦA VI SINH VẬT RUỘT MỐI Coptotermes gestroi 3.4.1 Chú thích chức năng của DNA đa hệ gene Toàn bộ các trình tự amino acid tƣơng ứng của 125.431 ORF trong dữ liệu DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối C gestroi đƣợc chú thích bằng Blastp dựa vào CSDL eggNOG, COG và... mối thu thập ở sáu địa điểm và thu đƣợc gần 11 µg DNA đa hệ gene sạch có nồng độ 114 ng/µl và OD260/280 đạt 1,83 Trong đó, 8,5 µg DNA đa hệ gene đƣợc đọc trình tự 11 3.3 ĐỌC VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ DNA ĐA HỆ GENE VI SINH VẬT RUỘT MỐI Coptotermes 3.3.1 Tập hợp trình tự và xác định gene Trình tự DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối C gestroi đƣợc đọc bằng máy giải trình tự HiSeq 2000 của Illumina Dữ liệu... pJET-egc mong muốn 3.5.6 Phân tích trình tự gene egc phân lập đƣợc từ DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối Trình tự nucleotide của gene egc phân lập đƣợc từ DNA đa hệ gene vi sinh vật mối chỉ khác với trình tự của ORF GL013068 một nucelotide ở vi trí 588/1104 Điều ngẫu nhiên là nucleotide sai khác này lại không làm thay đổi amino acid tƣơng ứng Nghĩa là trình tự amino acid của đoạn DNA phân lập đƣợc và của... trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi thu đƣợc có 316 ORF đƣợc chú thích mã hoã các enzyme phân huỷ cellulose và hemicellulose Tuy nhiên, trong khu n khô nghiên cứu này, chúng tôi mới phân lập, tách dòng và biểu hiện đƣợc một ORF Do đó, cần thiết phải có thêm các nghiên cứu tiếp theo biểu hiện các ORF mã hoá cellulase phối trộn với nhau và với EGC để phân huỷ hiệu quả cellulose hiệu... DNA đa hệ gene, mức độ đa dạng vi sinh vật ruột mối C gestroi đƣợc đánh giá dựa theo hai cách: Thứ nhất, các read chất lƣợng cao đƣợc so sánh với các trình tự của CSDL Trong số đó, 34,07% các read giống với gene vi khu n, 0,032% giống với gene của nấm, 3,79% giống với gene vi sinh vật đƣờng ruột ngƣời và 0,189% giống với trình tự của RDP Tổng số read có trình tự giống với CSDL là 206.742.13 Trong đó,... Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm khu ch đại gene egc trên gel agarose 0,8% ĐC (-): đối chứng âm; ĐC 1: sản phẩm PCR lần thứ nhất từ khu n DNA đa hệ gene vi sinh vật trong ruột mối; ĐC 2: sản phẩm PCR lần thứ hai từ khu n là sản phẩm PCR lần thứ nhất; ĐC M; thang chuẩn DNA 1 kb (Fermentas) 3.5.3 Ghép nối sản phẩm khu ch đại gene egc vào vector tách dòng pJET1.2 blunt Trong nghiên cứu này, vector pJET1.2/blunt... và còn lại 18,79% là các ORF không dự đoán đƣợc Từ dữ liệu, tổng số 1.460 loài vi sinh vật đƣợc xác định có mặt trong ruột mối C gestroi, trong đó, vi khu n có độ đa dạng cao nhất, với 1.368 loài (chiếm tới 93,7% tổng số loài đƣợc dự đoán) (Bảng 3.3) thuộc 628 chi, 217 họ, 97 bộ, 41 lớp và 22 ngành Bảng 3.3 Đa dạng vi sinh vật ruột mối C gestroi được dự đoán bằng MEGAN dựa vào CSDL NR (non-redundant... phản ứng của enzyme vào nồng độ cơ chất CMC theo Linewever-Burk 25 KẾT LUẬN Với những kết quả thu đƣợc trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi rút ra những kết luận sau: 1 Bằng phƣơng pháp phân tử, dựa vào phân tích trình tự đoạn DNA của gen mã hoá rRNA 16S ti thể, loài mối nghiên cứu đƣợc định loại là Coptotermes gestroi 2 Đã tách chiết và tinh sạch đƣợc DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối C gestroi . enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics . 2. Mục tiêu của đề tài 1. Đánh giá đƣợc sự đa dạng vi sinh vật ruột mối và đa dạng gene mã hoá. QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC GENE MÃ HÓA ENZYME THAM GIA THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI SINH VẬT TRONG RUỘT MỐI BẰNG KỸ. vi sinh vật ruột mối và khai thác gene mới mã hóa cellulase từ hệ vi sinh vật tƣơng ứng sống cộng sinh trong ruột hiệu quả, chúng tôi đã tiến hành đề tài Nghiên cứu sàng lọc gene mã hoá enzyme

Ngày đăng: 07/04/2015, 13:24

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan