1 CHƯƠNG III: CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT SÂU TỪ Bacillus thuringiensis 2 I. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA THUỐC TRỪ SÂU BT 1901 Bacillus thuringiensis được tiến sỹ Ishiwatari phát hiện. 1911 Berliner phát hiện trong các silo hạt ở Thuringe. 1915 Berliner quan sát thấy sự tạo thành tinh thể trong giai đoạn tạo bào tử. 1920 Được sử dụng lần đầu tiên làm thuốc trừ sâu. 1950 Chế phẩm chứa bào tử được thương mại hóa lần đầu tiên. 1957 Thuốc Thuricide được sản xuất từ chủng Bt var.kurstaki. Những năm 1970 Phát hiện chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao. Công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh. Có 13 chủng Bt đã được xác định. Tất cả đều chỉ diệt được côn trùng bộ cánh vẩy (Lepidoptera). 1977 Phát hiện ra Bt var.israelensis diệt ấu trùng ruồi, muỗi. 1983 Phát hiện ra Bt var.tenebrionis diệt bộ cánh cứng. 1985 Gen cry Bt được chuyển vào cây trồng để diệt sâu. 3 II. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA Bacillus thuringiensis  Trực khuẩn, kích thước 1-1,2 x 3-5 µm  Phủ tiêm mao, di chuyển được  Gram +  Sinh bào tử, kích thước 1,6 – 2 µm  Hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc  Tế bào đứng riêng hoặc xếp chuỗi  Nhiệt độ sinh trưởng 15º-45ºC  Phổ biến trong tự nhiên, cư trú trong đất, trên bề mặt cây và trên xác sâu  Tạo ra tinh thể protein trong giai đoạn tạo bào tử, kích thước 0,6 – 2 µm 4 Bào tử: hình trứng dài, kích thước 1,6 x 2 µm Tinh thể: kích thước 0,6 x 2 µm. Bản chất là protein 5 III. PHÂN LOẠI Bacillus thuringiensis Giới: Procaryotae Ngành: Firmicutes Họ: Bacillacaeae Chi: Bacillus Loài: thuringiensis Loài phụ… Bacillus thuringiensis thuộc: Khoá phân loại của Bergey (1984) 6 III. Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp) 1. Theo typ huyết thanh kháng tiêm mao Nguyên lí Kháng nguyên tiêm mao H kết hợp với kháng thể sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết → tạo cặn lắng trắng dưới đáy ống nghiệm. Quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào không di chuyển được 7 III. Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp) 1. Theo typ huyết thanh kháng tiêm mao (tiếp) Chuẩn bị kháng nguyên tiêm mao H Tiêm vào thỏ → thu huyết thanh miễn dịch (xác định hiệu giá) Thử phản ứng ngưng kết 8  Chuẩn bị dịch kháng tiêm mao H  Nuôi cấy VK B. thuringiensis trên môi trường bán lỏng NA: cao thịt 5g, agar 2g, nước cất 1000ml, điều chỉnh tới pH = 7,2. Thời gian nuôi 16 – 18 giờ.  Chuyển sang môi trường NB: nuôi ở chế độ lắc cho tới khi OD 650 = 0,8 – 1,0.  Bổ sung 0,5 ml formaldehyt Thu nhận dịch kháng nguyên tiêm mao H  Thu nhận huyết thanh miễn dịch  Tiêm dịch kháng nguyên tiêm mao H:  Mũi đầu tiên dưới da.  Các mũi tiếp theo tiêm ven, mỗi tuần 2 lần, liều lượng mỗi lần tăng dần (1ml, 2ml, 3ml), thời gian tiêm 3 tuần  Kiểm tra sự hình thành kháng thể:  Sau 8 ngày của lần tiêm cuối: lấy 2ml máu từ ven tai thỏ để xác định hiệu giá.  Nếu HG lớn hơn hoặc bằng 25 000 là đạt yêu cầu.  Nếu HG nhỏ hơn 25 000 thì tiếp tục tiêm thêm 2 – 3 lần nữa để nhận hiệu giá cao hơn.  Dùng 02 con thỏ cho một kháng nguyên để tránh rủi ro.  Huyết thanh được tách trong đièu kiện vô trùng và bảo quản ở 4 o C hoặc đông khô. 9  Xác định hiệu giá  Cho 1,8ml NaCl 1,15M và 200µl dịch huyết thanh miễn dịch tiêm mao vào ống nghiệm 5ml.  Pha loãng với các nồng độ giảm dần theo hệ số 2: 1:10; 1:20; 1:40; …… ; 1:2560.  Chuyển 100µl dịch ở mỗi nồng độ pha loãng này vào ống nghiệm có chứa 900µl dịch vi khuẩn B. thuringiensis, như vậy độ pha loãng lúc này là 1:100; 1:200; 1:400; … ; 1:25600. Mẫu đối chứng được thay thế 100µl dịch huyết thanh bằng 100µl dịch NaCl 1,15M.  Ủ các ống nghiệm ở 37 o C trong 2 giờ và quan sát sự ngưng kết. Hiệu giá thu được là nồng độ pha loãng cao nhất xảy ra hiện tương ngưng kết 10 Nhược điểm của phân loại theo type huyết thanh Mối liên hệ giữa type huyết thanh với phổ diệt côn trùng không nhất quán:  Có các loài cùng type huyết thanh có độc tính với côn trùng như nhau: loài phụ Kustaki và loài phụ alesti đều biểu hiện độc với côn trùng bộ cánh vẩy.  Có các loài có type huyết thanh giống nhau nhưng độc tính với côn trùng khác nhau: loài phụ morisoni (type huyết thanh H8ab) có độc tính với côn trùng bộ hai cánh và loài phụ sandiego (type huyết thanh H8ab) có độc tính với côn trùng bộ cánh cứng. Không thể thông qua type huyết thanh của một loài phụ để xác định hoạt tính diệt sâu của chúng [...]... cảm với bộ hai cánh và bộ cánh vẩy) 27 IV SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA Bt Chu trình sống của Bacillus thuringiensis 1 Pha phát triển sinh dưỡng 2 Pha tạo bào tử 28 Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử 29 Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử và tinh thể của Bt 30 Động học quá trình phát triển, tạo bào tử và tinh thể độc 31 V CÁC LOẠI ĐỘC TỐ CỦA Bacillus thuringiensis 1 α-exotoxin: là phospholipase... Cry4Ba 127,8 24 Hai cánh Hai cánh Phân loại độc tố diệt sâu (tiếp) Độc tố diệt sâu Hofte and Whiteley (1989) Crickmore et al (1999) Khối lượng phân tử (kDa) Độc tính CryIVC Cry10Aa 77,8 Hai cánh CryIVD Cry11Aa 72,4 Hai cánh CryVIA Cry6Aa 54 Nematode CytA Cyt1Aa 27,4 Hai cánh/phân hủy tế bào CytB Cyt2Aa 29 Hai cánh/phân hủy tế bào 25 III Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp) 3 Các cách phân loại khác... thước protein (kDa) Đối tượng sâu diệt 130-140 ấu trùng bộ cánh vẩy CryII (A, B, C) Hình lập phương 69-71 Bộ cánh vẩy và bộ hai cánh CryIII (A, B, C, D) Phẳng/không đều 73-74 Bộ cánh cứng CryIV (A, B, C, D) Lưỡng tháp 73-134 Bộ hai cánh CryV-cryIX Đa dạng 35-129 Đa dạng 25-28 Tế bào động vật xương sống và ko xương sống 22 Cyt Phân loại Bt theo độc tố diệt sâu Độc tố diệt sâu Hofte and Whiteley (1989)... đoạn phát triển sinh trưởng trước khi hình thành bào tử Khối lượng phân tử thấp, tan trong nước Có tác dụng ức chế tổng hợp ARN • Tác dụng cộng hưởng với δ-endotoxin: δ-endotoxin làm dập vỡ, phá huỷ vùng biểu mô ruột giữa côn trùng β-exotoxin xâm nhập vào huyết tương và máu gây ra biến đổi sinh lý của ấu trùng • Độc với cơ thể sống kể cả người, phổ diệt sâu rộng Do đó cần loại bỏ các chủng sinh độc tố... cánh CryIC(b) Cry1Cb 134 Cánh vẩy CryID Cry1Da 132,5 Cánh vẩy CryIE Cry1Ea 132 Cánh vẩy CryIF Cry1Fa 133,6 Cánh vẩy CryIG Cry9Aa 130 Cánh vẩy CryIX Cry9Ba 81 23 Cánh vẩy Phân loại độc tố diệt sâu (tiếp) Độc tố diệt sâu Hofte and Whiteley (1989) Crickmore et al (1999) Khối lượng phân tử (kDa) Độc tính CryIH Cry9Ca 129,9 Cánh vẩy CryIIA Cry2Aa 70 Cánh vẩy/hai cánh CryIIB Cry2Ab 70,8 Cánh vẩy CryIIC Cry2Ac... khác Chứa 290 axít amin và chứa đầu N Chịu trách nhiệm tạo lỗ rò trên ruột sâu 2 Vùng 2: từ a.a 291 đến a.a 500 Chứa 7 tấm β và một chuỗi xoắn α ngắn Chịu trách nhiệm gắn với thụ thể 3 Vùng 3: Từ a.a 501 đến a.a 644 Chứa 12 tấm β chứa đầu C Chịu trách nhiệm nhận biết điểm gắn kết Cấu trúc không gian của tinh thể Cry3 34 Cơ chế tác động của tinh thể độc 35 III Tinh thể độc I II Thụ thể Màng tế bào III...Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H H antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả 1 thuringiensis THU Berliner 1915; Heimpel và Angus 1958 2 finitimus FIN Heimpel và Angus 1958 3a, 3c alesti ALE Toumanoff và Vago 195, Heimpel và Angus 1958... (không công bố) 60 pingluonsis PIN Li Rong Sen 61 sylvestriensis SYL Damgaard (không công bố) 62 zhaodongensis ZHA Li Rong Sen 63 bolivia BOL Ferré-Manzanero et al.(không công bố) 17 Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H H antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả 64 azorensis AZO Santiago-Alvarez et al.(không công bố) 65 pulsiensis PUL Khalique F Và Khalique A (không công bố)... al.(không công bố) 67 vazensis VAZ Santiago-Alvarez et al.(không công bố) 68 thailandensis THA Chanpaisaeng et al.(không công bố) 69 pahangi PAH Seleena và Lee H.L (không công bố) 18 III Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp) 2 Theo gen mã hóa protein tinh thể độc Protein Cry Mã hóa Gen Cry 19  Protein cry hay còn gọi δ-endotoxin (tinh thể độc)       ICP tồn tại dưới dạng tiền độc tố, cần được... và Aizawa 1989 4a, 4b sotto SOT Ishiwata 1905, Heimpel và Angus 1958 4a, 4c kenyae KEN Bonnefoi và De Barjac 1963 5a, 5b galleriae GAL Shvetsova 1959, De Barjac và Bonnefoi 1962 11 Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H H antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả 5a, 5c canadensis CAN De Barjac và Bonnefoi 1972 6 entomocidus ENT Heimpel và Angus 1958 7 aizawai AIZ Bonnefoi và