ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN QUỐC HIỀN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN BIA NỒNG ĐỘ CAO SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRÊN GEL ALGINATE LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT TP. HỒ CHÍ MINH, 2012 - i - ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN QUỐC HIỀN Chuyên ngành: Chế biến thực phẩm và đồ uống Mã số chuyên ngành: 62 54 02 01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn 2. TS. Hoàng Kim Anh NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN BIA NỒNG ĐỘ CAO SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRÊN GEL ALGINATE Phản biện độc lập 1: Phản biện độc lập 2: Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: - ii - LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Những kết quả trình bày trong luận án này chưa được một tác giả nào khác công bố Nghiên cứu sinh Trần Quốc Hiền - iii - LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các giảng viên hướng dẫn khoa học là PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn và TS. Hoàng Kim Anh đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cám ơn những người thân trong gia đình đã động viên và tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận án này. Xin chân thành cám ơn Thầy Ngô Đăng Nghĩa, Viện Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã hỗ trợ phân tích các chỉ tiêu hóa lý của chế phẩm alginate; xin cảm ơn các chuyên viên Phòng phân tích sắc ký, Trung tâm Hóa dầu, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Đại học Bách khoa TP. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ phân tích sắc ký ethanol và một số sản phẩm phụ có trong dịch lên men. Đồng thời xin gửi lời cảm ơn tới các chuyên viên Phòng thí nghiệm kính hiển vi điện tử, Viện Công nghệ Hóa học, Trung tâm KHTN & CN QG đã giúp đỡ nhiệt tình trong phần nghiên cứu về thay đổi hình dạng nấm men dưới tác động của áp lực thẩm thấu và nồng độ ethanol cao trong quá trình lên men. Xin gửi lời cám ơn tới Quý thầy cô và các bạn trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh đã hết sức giúp đỡ và ủng hộ trong suốt thời gian thực hiện luận án. NCS Trần Quốc Hiền - iv - TÓM TẮT LUẬN ÁN Lên men bia nồng độ cao là kỹ thuật lên men dịch nha với nồng độ chất khô ban đầu rất cao (> 15 o Pt), sau đó pha loãng sản phẩm bia thu được để đạt nồng độ ethanol theo giá trị mong muốn. Sản xuất bia nồng độ cao với nấm men cố định trong gel alginate sẽ làm giảm khả năng tạp nhiễm vi sinh vật lạ; tăng mật độ tế bào trong một đơn vị thể tích dịch lên men, tăng số lần tái sử dụng nấm men trong phương pháp lên men chu kỳ; tiết kiệm chi phí năng lượng, chi phí lao động; tăng năng suất của thiết bị lên men; giảm bớt lượng nước cần sử dụng trong sản xuất. Đối với phương pháp lên men chu kỳ, khi nồng độ dịch nha tăng từ 12 lên 28 o Bx, thời gian lên men sẽ tăng theo. Tuy nhiên thời gian lên men của nấm men cố định thấp hơn so với nấm men tự do từ 26,2-46,2%. Trong quá trình lên men, nấm men cố định sinh trưởng tốt hơn và có tỷ lệ tế bào sống cao hơn nấm men tự do. Nhìn chung, hoạt tính lên men của nấm men cố định luôn tốt hơn nấm men tự do trong lên men bia nồng độ cao. Đó là do chất mang alginate có khả năng bảo vệ tốt tế bào nấm men trước tác động của stress áp lực thẩm thấu và stress ethanol. Sự thay đổi mật độ nấm men và nồng độ alginate trong hạt gel sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính lên men của nấm men cố định khi lên men dịch nha 24 o Bx từ malt đại mạch. Khi tăng mật độ nấm men trong hạt gel từ 25x10 6 -100x10 6 tb/mL gel thì tổng số chu kỳ lên men thực hiện được sẽ giảm, thời gian lên men trung bình và hàm lượng ethanol trong bia non tăng. Tuy nhiên, tốc độ sinh tổng hợp ethanol sẽ giảm mạnh. Khi nồng độ alginate trong hạt gel thay đổi trong khoảng 0,5-1,0% w/v, độ bền gel sẽ yếu, hạt gel sẽ bị dễ vỡ trong quá trình lên men. Do đó, nồng độ alginate trong khoảng trên không thích hợp để cố định nấm men ứng dụng trong lên men bia nồng độ cao. Khi nồng độ alginate trong hạt gel thay đổi từ 1,5-3,0%w/v, thời gian lên men trung bình của các chu kỳ giảm nhẹ nhưng hàm lượng ethanol trung bình trong bia non và tốc độ sinh tổng hợp ethanol tăng lần lượt từ 9,59 lên 10,22%v/v và từ 0,47 lên 0,72g/L.h. Việc tăng tỷ lệ giống cấy để lên men dịch nha 24 o Bx từ malt đại mạch là không phải giải pháp mang lại hiệu quả kinh tế cho quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate. Giải pháp này tuy có rút ngắn được thời gian lên men chính nhưng sẽ làm cho hàm lượng ethanol trong bia non giảm đi đáng kể so với mẫu đối chứng. Điều này không có lợi bởi vì hệ số pha loãng sẽ thấp khi - v - pha bia thành phẩm về độ cồn 5%v/v. Đối với giải pháp cung cấp oxy vào dịch nha, khi thời gian sục không khí tăng từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên thì thời gian lên men giảm 41,7%; tuy nhiên, hàm lượng ethanol trong bia non giảm 9,5%. Trong quá trình lên men bia nồng độ cao, thời gian sục khí thích hợp cho dịch nha sau khi cấy giống là 12 giờ, hàm lượng oxy hòa tan trong dịch lên men trong suốt thời gian sục khí là 7,5 ppm. Khi lên men dịch nha 24 o Bx có 30% suyrup maltose, giải pháp bổ sung tween 80 và ergosterol sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính lên men của nấm men cố định trong gel alginate. Từ kết quả quy hoạch thực nghiệm, hàm lượng Tween 80 và ergosterol tối ưu cần bổ sung vào dịch nha lần lượt là 0,3%v/v và 18mg/L. Khi đó, thời gian lên men chính giảm 22,2% và hàm lượng ethanol trong bia non không thay đổi khi so sánh với mẫu đối chứng. Các tế bào nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate đã chuyển hóa hoặc hấp thu cả 4 loại đường trong dịch nha là glucose, fructose, saccharose và maltose trong những giờ lên men đầu tiên. Việc cố định nấm men trong gel Ca- alginate làm cho các tế bào có thể sử dụng maltotrisoe từ những giờ lên men đầu tiên, trong khi nấm men tự do chỉ bắt đầu sử dụng maltotriose sau giờ lên men thứ 48. Ngoài ra, hiệu suất sinh tổng hợp ethanol tính theo đường lên men của nấm men cố định thấp hơn 8,3% so với nấm men tự do. Trong khi đó, hiệu suất sinh tổng hợp các sản phẩm phụ khác trong bia như glycerol, acid hữu cơ và rượu cao phân tử của nấm men cố định lần lượt thấp hơn 39,1; 13,7 và 53,8% so với nấm men tự do. Việc gia tăng tỷ lệ giống cấy từ 1,0x10 7 tb/mL (mật độ giống cấy thông thường) lên 7,0x10 7 tb/mL (mật độ giống cấy cao) sẽ làm tăng tỷ lệ pha loãng trong phương pháp lên men liên tục lên 3,2 lần, từ đó làm tăng năng suất sử dụng thiết bị lên men. Tuy nhiên, việc tăng tỷ lệ giống cấy sẽ làm giảm hàm lượng ethanol trong bia non nên làm giảm thể tích bia được tạo thành sau khi pha loãng bia về độ cồn 5%. Ngoài ra, nấm men cố định với tỷ lệ giống cấy cao chỉ có thể sử dụng liên tục trong 24 ngày; trong khi đó nấm men cố định ở tỷ lệ giống cấy thông thường có thể sử dụng trong 44 ngày. Việc tăng tỷ lệ giống cấy làm giảm hàm lượng các sản phẩm phụ trong bia non, ngoại trừ diacetyl. Tuy nhiên, hàm lượng acetaldehyde, rượu cao phân tử và ethylacetate trong bia non sau khi pha loãng về độ cồn 5% ở hai nghiệm thức 1,0x10 7 tb/mL và 7,0x10 7 tb/mL đều nằm trong ngưỡng cho phép. - vi - MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA i LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT LUẬN ÁN iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ ĐỊNH NGHĨA ix DANH MỤC CÁC BẢNG xi DANH MỤC CÁC HÌNH xiii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tình hình phát triển của ngành công nghiệp sản xuất bia Việt Nam 3 1.2. Nấm men bia cố định 4 1.2.1. Định nghĩa 4 1.2.2. Yêu cầu đối với chất mang và phương pháp cố định nấm men bia 4 1.2.3. Chất mang cố định nấm men 5 1.2.4. Phương pháp cố định nấm men 6 1.3. Lên men bia nồng độ cao 9 1.3.1. Định nghĩa 9 1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bia nồng độ cao 9 1.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất khô ban đầu trong dịch nha 9 1.3.2.2. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng trong dịch nha 10 1.3.2.3. Ảnh hưởng của mật độ nấm men gieo cấy ban đầu 10 1.3.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng oxy trong dịch nha ban đầu 11 1.3.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men 12 1.3.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol trong dịch lên men 13 1.4. Ứng dụng nấm men cố định trong quá trình lên men bia nồng độ cao 13 1.4.1. Tính chất sinh lý của nấm men cố định 13 1.4.2. Khả năng sử dụng cơ chất 14 1.4.3. Khả năng chịu đựng những yếu tố bất lợi 14 1.4.4. Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất 15 - vii - 1.5. Chất mang alginate 16 1.5.1 Cấu trúc của alginic acid 17 1.5.2 Khả năng tạo gel của alginate 17 1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về kỹ thuật lên men bia nồng độ 19 cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate 1.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 19 1.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 21 1.7. Nội dung nghiên cứu của luận án 23 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 2.1. Nguyên liệu 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1. Thiết bị lên men 27 2.2.2. Phương pháp thực nghiệm 28 2.2.3. Bố trí thí nghiệm 29 2.2.4. Một số quy trình chuẩn bị nguyên liệu cho thí nghiệm 45 2.3. Phương pháp phân tích 46 2.4. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm 47 2.5. Công thức tính toán 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50 3.1. Ảnh hưởng của việc cố định tế bào trong gel alginate đến hình thái và 50 khả năng lên men bia nồng độ cao của nấm men cố định 3.1.1. So sánh hoạt tính lên men của nấm men tự do và nấm men cố định khi 50 nồng độ dịch nha thay đổi 3.1.2. Quan sát hình thái của nấm men trong điều kiện stress áp lực thẩm thấu 62 và stress ethanol tăng cao 3.1.3. Xác định mật độ tế bào và nồng độ alginate thích hợp trong 1mL gel để 65 cố định nấm men ứng dụng trong quá trình lên men bia nồng độ cao 3.1.4. Quan sát hình thái hạt gel trong quá trình lên men bia nồng độ cao theo 68 phương pháp chu kỳ 3.1.5. So sánh hoạt tính lên men của nấm men cố định và nấm men tự do 70 trong quá trình tái sử dụng để lên men bia nồng độ cao theo phương pháp chu kỳ 3.2. Nghiên cứu ứng dụng nấm men cố định để lên men dịch nha 24 o Bx từ 75 malt đại mạch 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến khả năng lên men của 75 - viii - nấm men cố định 3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của thời gian sục khí trong giai đoạn đầu của 84 quá trình lên men đến khả năng lên men của nấm men cố định 3.3. Sử dụng nấm men cố định để lên men dịch nha có bổ sung thế liệu syrup 93 maltose 3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ thế liệu đến hoạt tính lên men của nấm 93 men cố định trong quá trình lên men bia nồng độ cao 3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp bổ sung Tween 80 vào dịch nha 98 đến hoạt tính lên men của nấm men cố định 3.3.3. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp bổ sung ergosterol vào dịch nha 100 đến hoạt tính lên men của nấm men cố định 3.3.4. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp bổ sung kết hợp Tween 80 và 102 ergosterol đến hoạt tính lên men của nấm men cố định 3.3.5. Thiết lập phương trình cân bằng vật chất của quá trình lên men chính 110 khi sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do 3.4. Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm men cố định lên men dịch nha có bổ 118 sung thế liệu bằng phương pháp lên men liên tục. 3.5. So sánh các phương án lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định 126 trong gel alginate KẾT LUẬN 129 KIẾN NGHỊ 131 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 132 TÀI LIỆU THAM KHẢO 133 - ix - DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ ĐỊNH NGHĨA A. CHỮ VIẾT TẮT - o Bx: Độ Brix - o Pt: Độ Plato - DEAE: Diethylaminoethyl - DCM (Delignified cellulose materials): Nguyên liệu cellulose đã tách lignin - EDTA: Ethylen diamin tetraacetic acid - FAN (Free amino nitrogen): Nitơ amin tự do - SEM (Scanning electron microscope): Kính hiển vi điện tử quét - VDK: Vicinal diketones - YE (Yeast extract): Chất chiết nấm men - YPC (Yeast peptide complex): Hỗn hợp peptide được trích ly từ nấm men - M/G: Tỷ lệ D-mannuronic acid/L-guluronic acid của chế phẩm alginate B. ĐỊNH NGHĨA - Độ Brix: là đơn vị đo hàm lượng đường hòa tan trong dung dịch. Một độ Brix tương ứng với 1 gam saccharose hòa tan trong 100 gam dung dịch ở 20 o C. Theo lý thuyết, 1 o Bx tương đương với 1 o Pt và tương đương với 1%w/w. - Nấm men cố định: là nấm men được gắn trên chất mang hoặc được nhốt trong chất mang hoặc có vị trí hoạt động bị giới hạn trong một vùng không gian nhất định của bình lên men nhưng vẫn có khả năng duy trì được hoạt tính trao đổi chất. - Khả năng sinh trưởng thực của nấm men hay số lượng tế bào nấm men sinh trưởng thực: là hiệu số giữa tổng số tế bào nấm men cực đại trong quá trình lên men bia và số lượng tế bào nấm men gieo cấy ban đầu. [...]... ca nm men bia, cỏc ng lờn men, 115 cỏc acid amin trong dch nha, ru cao phõn t v acid hu c trong bia non khi lờn men bia nng cao s dng nm men c nh v nm men t do Bng 3.17: Lng c cht ó c nm men s dng hoc hm lng sn phm do 116 nm men sinh ra trong bia non trong quỏ trỡnh lờn men bia nng cao s dng nm men c nh trong gel alginate v nm men t do Bng 3.18: S mole c cht hoc sn phm tớnh theo 1 mole ng lờn men trong... trỡnh lờn men bia nng cao s dng nm men c nh v nm men t do Bng 3.19: Hiu sut (%) tng hp sinh khi v sn phm tớnh theo ng lờn men 117 trong quỏ trỡnh lờn men bia nng cao s dng nm men c nh v nm men t do Bng 3.20: nh hng ca t l ging cy n kh nng lờn men liờn tc ca nm men 121 c nh trong gel alginate Bng 3.21: Nng ca mt s sn phm trong bia non (mg/l) khi s dng nm men c nh v mt ging cy thay i (dung dch bia non... tc [97] Ht gel (2% Na -alginate, 0,1M CaCl2); lờn men liờn tc [98] Ht gel (2,5% Na -alginate, 0,1M CaCl2); lờn men liờn tc [99] 1,0x107 tb/ht Ht gel (ỉ3mm, 1% Na -alginate, 0.1 M CaCl2); lờn men tnh [35] 1,0x108 tb/mL gel Ht gel (3% Na -alginate, 1% w/v CaCl2); lờn men tnh cú tun hon dch nha [94] 1,0x109 tb/mL gel Ht gel (ỉ2mm, 50g/L K-pectate, 0.1M CaCl2); lờn men tnh [95] 1,0x109 tb/mL gel Ht gel (ỉ2mm,... lờn men tnh [73] 1,0x109 tb/mL gel k-carrageenan 0,65x10 tb/mg gel 1,0x109 tb/mL gel Ca-pectate Ti liu tham kho 1,0x109 tb/mL gel Ca -alginate Thụng s k thut/phng phỏp lờn men Ht gel (ỉ2mm, 40g/L k-carrageenan, 0.1M NaCl); lờn men tnh, lờn men liờn tc [68] 1,0x107 tb/mL gel Ht gel (ỉ3,5mm dy 0,3mm); lờn men tnh [36] 1,0x107 tb/mL gel Ht gel (ỉ3,5mm dy 0,3mm); lờn men tnh [100] 6 9 PVA -9- 1.3 Lờn men bia. .. lờn men ph trong phng phỏp lờn men bia truyn thng, lờn men bia khụng cn hoc bia cú cn thp, lờn men bia nng cao [9], [19], [20] Trong quỏ trỡnh lờn men bia, vic s dng nm men c nh cú nhng thun li nh: n nh hot tớnh lờn men ca nm men trong mt khong thi gian di [21], [22], [23]; tng mt t bo trong mt n v th tớch dch lờn men [24], [25]; s dng phng phỏp lờn men liờn tc [24], [25]; tng s ln tỏi s dng nm men. .. Ht gel (ỉ0,3-0,6mm, 2% Na -alginate) ; lờn men tnh [37] 0,16 gam tb/mL gel Ht gel (ỉ3mm, 1% Na -alginate, 0.05 M CaCl2); lờn men liờn tc [96] 1,0x109 tb/mL gel Ht gel (ỉ2mm, 25g/L Na -alginate, 0,1% CaCl2); lờn men tnh [15] Phng phỏp nht t bo trong cht mang xp Ca -alginate -8- Phng phỏp nht t bo trong cht mang xp (tt) Cht mang Lng nm men c nh Ht gel (ỉ3mm, 4% Na -alginate, 04% CaCl2); lờn men tnh v lờn men. .. CaCl2); lờn men liờn tc [66] 1,0x109 tb/mL gel Ht gel (50g/L k-pectate, 0.1 M CaCl2); lờn men liờn tc [98] 1,0x109 tb/mL gel Ht gel (ỉ2mm, 50g/L K-pectate, 0.1M CaCl2); lờn men tnh, lờn men liờn tc [68] 1,0x109 tb/mL gel Ht gel (ỉ2mm, 40g/L k-carrageenan, 0.1M NaCl); lờn men tnh [95] 1,0x10 tb/mL gel Ht gel (ỉ2mm, 40g/L k-carrageenan, 0.1M NaCl); lờn men liờn tc [66] 1,0x109 tb/mL gel Ht gel (ỉ2-4mm,... dng k thut lờn men bia nng cao vi hm lng cht khụ thp hn nhiu so vi th gii v cha s dng nm men c nh trong quy trỡnh sn xut bia nng cao Da trờn nhng phõn tớch v nhu cu th trng, tỡnh hỡnh nghiờn cu v sn xut bia trong nc, cng nh nh hng phỏt trin ca ngnh bia trong nhng nm ti, chỳng tụi thc hin ti nghiờn cu quỏ trỡnh lờn men bia nng cao s dng nm men c nh trong gel alginate nhm mc ớch nõng cao nng sut sn... dng nm men c nh v nm men t do vi nng dch nha thay i t 12-28oBx Bng 3.3: nh hng ca mt t bo nm men trong 1mL gel n hot tớnh lờn men 65 ca nm men c nh vi dch nha 24oBx (Thi gian kho sỏt l 150 ngy) Bng 3.4: nh hng ca nng alginate trong 1mL gel alginate- nm men n kh 66 nng lờn men ca nm men c nh vi dch nha 24oBx Bng 3.5: Thi gian lờn men v hm lng ethanol cú trong bia non theo phng phỏp 71 lờn men chu... do, nm men c nh trờn b mt ca ht gel v bờn trong ca ht gel; (A2) (B2) v (C2) hỡnh nh ca nm men t do, nm men c nh trờn b mt ca ht gel v bờn trong ca ht gel sau 30 phỳt tip xỳc vi dung dch sorbitol (24oBx); (A3), (B3) and (C3) hỡnh nh ca nm men t do, nm men c trờn b mt ca ht gel v bờn trong ca ht gel sau 30 phỳt tip xỳc vi dung dch ethanol (10% v/v) Hỡnh 3.11: T bo nm men S cerevisiae c nh trong gel alginate