Giảitrìnhtự thế hệ mới Phạm Hùng Vân Trưởng ĐơnVị Kỹ ThuậtPhânTíchGene Hai giai đoạn trong giải trình tự Sanger Ứng dụng giảitrìnhtự Sanger 1. Giảitrìnhtự gene hay bộ gen cho các nghiên cứucó liên quan; 2. Phát hiệncácđộtbiến gene (liên quan đến ung thư, đên kháng thuốc), các SNP (trong cá nhân hóa các liệuphápđiềutrị), các kiểu gene (genotype của virus gây bệnh)…; 3. Định danh vi khuẩnhay vi nấmdựatrêngiảitrìnhtự DNA của gene qui định RNA của ribosome (16S của vi khuẩn và 28S củavi nấm) đặcbiệt là các tác nhân khó định danh hay thấtbại nuôi cấytừ mẫuthử; 4. Phân tích đoạn xét nghiệmdấu vân tay DNA (DNA finger printing) để nhậndạng cá nhân và mốiquan hệ cá nhân (pháp y), trong chẩn đoán tiền sanh, trong phát hiện đadạng loài… Pyrosequencing Nguyên tắc pyrosequencing 1. A, hay T, hay C, hay G đượclậptrìnhchovàogiếng phản ứng; và mỗi khi dung dịch nucleotide cho vào có nucleotide đượcbắtcặpvàosợikhuônthìmột pyrophosphate (PPi) sẽđượcphóngthíchrađể được enzyme sulfurylase tạoramột ATP, ATP này sẽ giúp hệ thống phát quang luciferin-luciferase (luciferin thành oxyluciferin phát quang) 2. dATP-S đượcsử dụng để thay thế dATP vì dATP-S không có hoạttínhcủaATP. 3. ATP và các nucleotide tự do còn thừasaumỗilầnbổ sung nucleotide bị huỷ nhờ apyrase đượcchovào giếng sau khi tín hiệu phát quang được ghi nhận Định lượng được độtbiến Ứng dụng pyrosequencing  Nhiềubộ thuốcthửđã đượcchấpnhậnIVD (In-Vitro Diagnosis) trong phát hiệncácđột biến gene ung thư liên quan đếnchỉđịnh và theo dõi điềutrịđích,  Epigenomic: Định lượng các CpG vớiC bị gắn methyl (Cytosine methylation) để tiên đoán ung thư,  Phát hiện độtbiến gene trong chẩn đoán và sàng lọcbệnh di truyền,  Đặcbiệt trong vi sinh lâm sàng: định danh các vi khuẩn. Ba giai đoạn của giảitrìnhtự thế hệ mới Giảitrìnhtự bằng tổng hợp thế hệ mới vs pyrosequencing 1. Thuốcthử giảitrìnhtựđượcthổichảy vào chip nano- well hay vi bảntheochương trình và sau khi ghi nhận đượctínhiệuthìthuốcthử củ sẽđượcthổichảy ra để thuốcthử mớilại đượcbơmvào. 2. Tổng hợpmạch bổ sung dựatrênmạch khuôn có thể là kéo dài đầu3’ củamạch bổ sung bằng các nucleotide (A, T, C hay G) được ghi nhận, hay có thể là kéo dài đầu3’ củamạch bổ sung mỗilần2 base nhờ sự kéo dài và nốiprobe dựatrênsợi khuôn 3. Tín hiệutổng hợpcóthể là tín hiệu phát quang dựa trên hệ thống luciferin-luciferase (454 củaRoche), tín hiệu điệndo thayđổi pH (Ion-Tolent hay Ion- Proton củaABI), tínhiệuhuỳnh quang được đánh dấu trên các nucleotide A, T, C hay G (Solexa của Illumina), hay cũng có thể là tín hiệuhuỳnh quang đượcgắn lên probe (solid củaABI). Công nghệ Barcode cho phép xác định nguồngốctrìnhtựđượcgiải [...]... hiện dị bội của thai nhi bằng phân tích DNA của bào thai hiện diện trong máu mẹ dựa trên ưu điểm độ nhạy cao của kỹ thuật Giải trình tự bộ gene (Crag Venter) Ứng dụng giải trình tự thế hệ mới  Giải trình tự bộ gene, thậm chí 24h cho bộ gene người  Lôi ra ánh sáng bất cứ một trình tự nucleic acid của bất cứ tác nhân gì có mặt trong mẫu thử lấy từ vật chủ hay bệnh nhân  Công cụ nhạy cảm nhất để có thể... chạy giải trình tự, phân tích kết quả: 3 ngày Kết quả  Phân tích kế quả bằng phần mềm SeqMan thu được toàn bộ genome của virut Rubella (9.762bp) So sánh trình tự thu được trên ngân hàng gene NCBI  Trình tự thu được giống với: Rubella virus strain RVi/LA.CA.USA/45.08/2B CRS, complete genome  Các vùng giàu GC vủa virut đều có thể đọc trình tự được (việc này rất khó khi thực hiện bằng máy giải trình tự. ..Ứng dụng giải trình tự thế hệ mới  Giải trình tự bộ gene, thậm chí 24h cho bộ gene người  Lôi ra ánh sáng bất cứ một trình tự nucleic acid của bất cứ tác nhân gì có mặt trong mẫu thử lấy từ vật chủ hay bệnh nhân  Công cụ nhạy cảm nhất để có thể phát hiện các đột biến... with Amplicon  Viewer New! Kết quả giải trình tự bộ gene virus trên máy MiSeq ‐ Illumina Các bước tiến hành:  Bảo quản mẫu và bất hoạt chủng virut Rubella      bằng dung dịch RNA Shield™ của hãng Zymo Research – Mỹ Tách chiết mẫu Virut Rubella bằng Direct-zol™ RNA MiniPrep Kit (P/N: R2050) của hãng Zymo Research Chuẩn bị thư viện với bộ kit TruSeq RNA LT của Illumina Chạy giải trình tự với bộ kít MiSeq 300... thu được giống với: Rubella virus strain RVi/LA.CA.USA/45.08/2B CRS, complete genome  Các vùng giàu GC vủa virut đều có thể đọc trình tự được (việc này rất khó khi thực hiện bằng máy giải trình tự thế hệ cũ)  Độ chính xác cao: 51782 coverage với Q >30 . khuẩn. Ba giai đoạn của giảitrìnhtự thế hệ mới Giảitrìnhtự bằng tổng hợp thế hệ mới vs pyrosequencing 1. Thuốcthử giảitrìnhtựđượcthổichảy vào chip nano- well hay vi bảntheochương trình và sau khi ghi nhận. Giảitrìnhtự thế hệ mới Phạm Hùng Vân Trưởng ĐơnVị Kỹ ThuậtPhânTíchGene Hai giai đoạn trong giải trình tự Sanger Ứng dụng giảitrìnhtự Sanger 1. Giảitrìnhtự gene hay bộ gen cho. củaABI). Công nghệ Barcode cho phép xác định nguồngốctrìnhtựđượcgiải Ứng dụng giảitrìnhtự thế hệ mới  Giảitrìnhtự bộ gene, thậm chí 24h cho bộ gene người  Lôi ra ánh sáng bấtcứ mộttrìnhtự nucleic